“Curso de extracción y cuantificación de ADN y ARN” biomics Research Group Grupo Consolidado biomics Research Group Grupo Consolidado Universidad del País Vasco Euskal Erriko Universitatea MÁSTER EN CALIDAD Y SEGURIDAD ALIMENTARIA ORGANISMOS TRANSGÉNICOS IDENTIFICACIÓN DE ADN TRANSGÉNICO MAESTRANTE: María Teresa Pacheco TUTOR: Phd. MSc. Marian Pancorbo Mayo 2012
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Práctica y resultados DETECCIÓN DE ADN TRANSGÉNICO (1)
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“Curso de extracción y cuantificación de ADN y ARN”
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Consolidado
Universidad del País Vasco Euskal Erriko Universitatea
MÁSTER EN CALIDAD Y SEGURIDAD ALIMENTARIA
ORGANISMOS TRANSGÉNICOS
IDENTIFICACIÓN DE ADN TRANSGÉNICO
MAESTRANTE: María Teresa Pacheco
TUTOR: Phd. MSc. Marian Pancorbo
Mayo 2012
“Curso de extracción y cuantificación de ADN y ARN”
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1. EXTRACCIÓN ORGÁNICA DE ADN: MÉTODO CTAB
Encender el baño o termomix para que alcance la temperatura de 60 ºC.
Resuspender cada muestra en 500 µl de H20 milliQ estéril. Añadir los volúmenes
correspondientes a los reactivos del buffer de lisis que se indican en la siguiente
tabla:
Reactivo Volumen
Buffer lisis CTAB 2% 1 ml
Proteinasa K 20 mg/ml 20 l
2-mercaptoetanol 20 l
Mezclar bien todos los reactivos, cerrarlos con las bridas y colocarlos en una
gradilla para incubar en el baño con agitación constante a 60 ºC durante 90
minutos.
Centrifugar durante 3 minutos aproximadamente a 13000rpm. Trasvasar el
sobrenadante a otro tubo eppendorf de 2 ml.
Añadir 1 ml de Fenol/Cloroformo-Isoamiloalcohol (25:24:1). Voltear el tubo para
homogeneizar las fases y centrifugar a 13.000 g durante 10 min.
Recuperar la fase acuosa en otro tubo eppendorf previamente etiquetado.
Precipitar el ADN añadiendo 2/3 del volumen de isopropanol y 1/10 del volumen
de acetato sódico 3M recuperado tras el fenol. Voltear varias veces (mínimo 15-20
veces) viéndose la madeja de ADN.
Seguidamente centrifugar durante 5 minutos tras lo cual el sobrenadante es
eliminado y el pellet es resuspendido en 200 µl de buffer TE 1X y tratados con 20 µl
de RNase A (10 mg/ml) para digerir cualquier contaminación con RNA.
Tras 30 minutos de incubación a 37 ºC, tratar las muestras con 200 µl de
cloroformo:isoamiloalcohol (24:1) para eliminar el enzima RNasa A.
Trasvasar la fase acuosa a un tubo eppendorf de 1,5 ml y precipitar de nuevo con
1 volumen de isopropanol y 1/10 del volumen de acetato sódico 3M. Tras una
centrifugación de 5 minutos a 13.000 rpm, el sobrenadante es eliminado y el ADN
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depositado en el fondo del tubo es resuspendido en 100 µl de H2O milliQ. Las
muestras de ADN fueron conservadas a 4 ºC hasta su análisis.
Material necesario
Reactivos y material fungible
- Gradillas de tubos eppendorf.
- Gradilla para el baño de agitación
- Puntas de 10, 200 y 1000 µl.
- Tubos eppendorf de 0,5 ml y 1,5 ml
- Pipetas Pasteur de 1 ml
- Bridas
- Buffer de lisis CTAB 2 %
- Fenol:cloroformo:isoamiloalcohol (25:24:1)
- Isopropanol
- Acetato sódico 3M (a -20 ºC)
- TE 1X
- RNase A
- Cloroformo:isoamiloalcohol (24:1)
- Agua milliQ autoclavada.
Aparatos y equipos
- Pipetas monocanal de 1 a 10, 5 a 50 y 100 a 1000 µl.
- Baño de agitación.
- Centrifuga de tubos eppendorf
- Concentrador de ADN
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2. CUANTIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
Es conveniente encender el espectrofotómetro 20 minutos antes de su uso para
que la lámpara de Xenón se estabilice.
Una vez encendido, hay que elegir el tipo de ensayo (dsDNA) y el factor de
conversión (OD) que para el ADN de doble hebra es de 50 µg/µl. Otro valor que
hay que elegir es el factor de dilución. Este puede depender de la cantidad de
muestra que se haya obtenido tras la extracción. Se recomienda que la
extracción no sea menor de 1/50 y se aconseja que sea de 1/25. De esta forma
disminuyen las cuantificaciones erróneas por error de pipeteo.
La valoración se lleva a cabo analizando el espectro de absorción a 260 nm y 280
nm de la disolución que contiene el ADN problema.
El valor de absorción a 260 nm indicará la concentración de ADN en la muestra
analizada ya que 1 unidad de absorbancia a 260 nm equivale a una
concentración de ADN de doble cadena de 50 µg/ml.
Para estimar la concentración de ADN se prepara una dilución 1/25 de la muestra
problema, depositando 4µl de la muestra en 96 µl de H2O bidestilada. Como
blanco de la medición se prepara una dilución 1/25 del solvente en el que se
encuentra el ADN problema (TE o H2O).
Primeramente se mide la solución sin ADN para establecer el “blanco”: Read
blank.
A continuación se mide la dilución 1/25 de ADN muestra: Read sample.
La concentración de la muestra se calcula según las siguientes fórmulas:
ADN [µg/ml] = (Abs 260nm)x(50µg/ml)x(25/1)
ADN [µg/µl] = Valor ADN [µg/ml] obtenido / 1000
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Para conocer la pureza del ADN extraído se calcula la relación R= (Abs 260)/(Abs
280). Este valor indica si el ADN de la muestra está bien purificado, ya que la
absorbancia a 230 nm corresponde a la cantidad de sales y la absorbancia a 280
nm, a la cantidad de restos proteicos. Un ADN de cadena doble de gran pureza
proporciona valores R entre 1,8 y 2.
Notas del maestrante y resultados obtenidos:
Si se obtiene un valor de R inferior a 1,8 indica (exceso proteínas o sales) la muestra debería
purificarse o volver a obtenerse son cuidado de que hayan pérdidas de ADN.
Restos de fenol se manifestarán con picos a 270nm, y de etanol a 220nm.
El ruido de fondo se puede determinar por la relación: R=(A260 nm - A320 nm)/(A 280 nm - A320 nm).
También se puede conocer la cantidad de ADN, por PCR a tiempo real o por fluorimetría.
Al aplicar fluorimetría, se pueden usar como fluorocromos: fluoresceína o picogreen. Estos
fluorocromos se ubican en medio de la doble hélice de ADN y en consecuencia, emiten una señal de
fluorescencia proporcional a la cantidad de ADN existente en la muestra. Para aplicar este método se
debe trabajar con una λ de exitación de 356 nm y una λ de emisión de 458nm.