Analytická HPLC Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 22 – Analytická HPLC Kvalitativní analýza Cílem kvalitativní analýzy je identifikovat pík chromatogramu nebo konkrétní složku v eluentu. Pokud je chemické složení zcela neznámé, můžeme využít při identifikaci některou ze speciálních analytických technik. Další možností je získání většího množství materiálu semi-preparativní nebo preparativní HPLC a ten potom analyzovat off-line různými analytickými metodami. Jestliže naopak ve vzorku předpokládáme přítomnost několika komponent, můžeme pro nejjednodušší určení porovnat hodnoty k neznámých píků a referenčních látek, které byly naměřeny za stejných chromatografických podmínek. Jestliže se shodují retenční časy píků, mohlo by se jednat o stejné látky. Nicméně měly by být provedeny ještě další experimenty, aby byla identifikace spolehlivější: a) Referenční látka je přimíchána do vzorku. Zkoumaný pík by měl být vyšší, bez toho aniž by byla přítomna raménka nebo se projevilo rozšiřování píku. Kolona s větším
26
Embed
Příprava materiálu byla podpo řena projektem OPPA č. …fchi-oppa.vscht.cz/uploads/AK-skripta/Kap_22.pdf · 2014. 4. 25. · OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 22 – Analytická
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Analytická HPLC
Příprava materiálu byla podpo řena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
Část 22 – Analytická HPLC
Kvalitativní analýza
Cílem kvalitativní analýzy je identifikovat pík chromatogramu nebo konkrétní složku
v eluentu. Pokud je chemické složení zcela neznámé, můžeme využít při identifikaci některou
ze speciálních analytických technik. Další možností je získání většího množství materiálu
semi-preparativní nebo preparativní HPLC a ten potom analyzovat off-line různými
analytickými metodami.
Jestliže naopak ve vzorku předpokládáme přítomnost několika komponent, můžeme pro
nejjednodušší určení porovnat hodnoty k neznámých píků a referenčních látek, které byly
naměřeny za stejných chromatografických podmínek. Jestliže se shodují retenční časy píků,
mohlo by se jednat o stejné látky. Nicméně měly by být provedeny ještě další experimenty,
aby byla identifikace spolehlivější:
a) Referenční látka je přimíchána do vzorku. Zkoumaný pík by měl být vyšší, bez toho
aniž by byla přítomna raménka nebo se projevilo rozšiřování píku. Kolona s větším
Analytická HPLC
počtem teoretických pater má větší schopnost rozlišit dvě podobné látky se
srovnatelným chromatografickým chováním.
b) Stejný test by měl být proveden i s jinou mobilní a nejlépe i jinou stacionární fází.
Fáze by měly mít diametrálně rozdílné vlastnosti (třeba normální vs reverzní fáze).
Pokud sledovaný pík nejeví ani při jedné analýze známky separace, je velmi
pravděpodobné, že se jedná o identické látky.
Už jsme zmínili, že zkoumaný pík musí být důkladně analyzován, aby mohl být určen
s potřebnou jistotou. K dalšímu zlepšení kvalitativní analýzy můžeme dospět i bez větších
výdajů následujícími postupy:
a) Specifičtější detektor přispívá k identifikaci píku. RI detektor je univerzální a zachytí
všechny složky, ale UV detektor dává odezvu jen pro absorbující látky a fluorescenční
detektor reaguje jen na fluoreskující sloučeniny. Ještě vyšší specificity
(u fluoreskujících látek) může být dosaženo nastavením excitační a emisní vlnové
délky.
b) Změna zaznamenávané vlnové délky UV detektoru musí být doprovázena stejnou
odezvou signálu vzorku i reference. To znamená, že relativní nárůst i pokles by měl
být stejný. Poměr absorbancí při dvou vlnových délkách je specifický pro každou
látku.
c) Poměr signálů UV a za ním zapojeného RI detektoru (nebo jiné dvojice detektorů) je
za daných podmínek pro látku charakteristický.
Průkaznější, nicméně náročnější, jsou speciální metody. Zejména diodové pole a spřažené
techniky s hmotností spektrometrií jsou v kvalitativní analýze využívány.
Vlivem použitého rozpouštědla vzorku mohou vznikat píky související se změnou indexu
lomu eluentu (tzv. refractive index peaks) a nesmí být zaměňovány za píky analytu (obr.
níže). Vždy je lepší vzorek rozpouštět v samotné mobilní fázi, abychom se těmto
neočekávaným píkům vyhnuli. Nicméně pokud není možné vzorek rozpouštět v mobilní fázi,
můžeme provést slepý pokus s čistým solventem.
Porovnání retenčních časů je významně ovlivněno stabilitou průtoku mobilní fáze kolonou a
je tak méně citlivé než metoda nástřiku směsi reference se vzorkem.
Analytická HPLC
Stopová analýza
Jestliže je cílem analýzy kvantitativní nebo kvalitativní analýza látek v nízkých
koncentracích, je nezbytná optimalizace chromatografického systému. Při izokratické eluci
vždy platí, že je koncentrace v maximu píku cmax nižší než koncentrace v nástřiku ci.
kde:
Vi je objem nastříknutého vzorku,
VR je retenční objem, VR = tR F,
a N je počet teoretických pater kolony.
(S gradientovou elucí je cmax vyšší než vychází z výpočtu pomocí tohoto vzorce.)
Příklad
Je nastříknuto 10 µl roztoku s koncentraci zkoumaného analytu 1ppm (10-6 g ml-1). Retenční
objem odpovídajícího píku je 14 ml. K tomuto píku je vyčíslen počet teoretických pater
kolony na 10 000. Jaká je koncentrace v maximu píku (cmax)?
Řešení
Pro stopovou analýzu je nezbytné získat nejvyšší signál, to znamená nejvyšší možnou
koncentraci v maximu píku. Jak toho docílit?
Příklad
Pro separaci z úlohy výše byla použita kolona o délce 15 cm, vnitřním průměru 4,6 mm a
náplní 5 µm. Koncentrace v maximu píku 0,028 ppm poskytla signál 1mV na UV detektoru.
Vypočtěte intenzitu signálu při následujících podmínkách (všechny ostatní parametry
zůstávají nezměněny).
a) délka kolony je 25 cm,
Analytická HPLC
b) vnitřní průměr kolony je 3 mm,
c) náplň kolony tvoří částice o průměru 3,5 µm.
Řešení
a) Jestliže je náplň nové kolony identické kvality, je výška teoretického patra H stejná.
Proto je počet teoretických pater N, stejně tak retenční objem VR, 25 cm dlouhé kolony
1,7 násobně vyšší (25 : 15 = 1,7).
odpovídající signálu 0,8 mV.
b)
odpovídající signálu 2,4 mV.
c) S identickou náplní kolony s částicemi 3,5 µm bude teoretický počet pater 1,4 krát
vyšší (5,0 : 3,5 = 1,4).
odpovídající signálu 1,2 mV.
Je jasné, že nejmenšího ředění a nejvyššího píku je dosaženo, jestliže je použita krátká
a hlavně úzká kolona s největším možným počtem teoretických pater. Separační účinnost
kolony je důsledkem její kvality, použití dobré náplně, ale nikoliv její délky. Delší kolona
dává nižší koncentrace v maximech píků, protože VR stejně jako N jsou úměrné délce kolony
LC, tudíž cmax závisí na . S danou koncentrací vzorku ci je ředění píků menší s větším
objemem nástřiku, vyšším počtem pater a menším retenčním objemem.
Dříve zmíněná rovnice může být napsána i jiným způsobem (protože a
):
Analytická HPLC
kde:
dC je vnitřní průměr kolony,
ε je celková porozita,
k je retenční faktor,
LC je délka kolony,
a H je výška teoretického patra.
Nyní je nejlepší strategie zřejmá:
- Použít kolonu s malým vnitřním průměrem. Dvojnásobné zúžení znamená čtyřnásobné
zvýšení cmax
- Použít krátkou kolonu
- Použít náplň kolony s malou výškou teoretického patra. Toho je dosaženo menšími
částicemi, výborným plněním a stacionární fází s dobrými vlastnostmi přenosu hmoty.
Kolona musí být provozována ve svém van Deemterovském optimu
- Eluovat analyt s malým retenčním faktorem
Ačkoli jsou preferovány krátké kolony, musí být zároveň dostatečně dlouhé k dosažení dělení
směsi. Metoda musí být optimalizována s ohledem na stopové složky.
Z rovnice rovněž vyplývá, že látkové množství vzorku (neboli součin ciVi) by mělo být velké.
Může dokonce docházet i k přetížení kolony majoritní složkou pokud není ovlivněno rozlišení
stopového píku (obr. níže). Nicméně objem nástřiku je na druhou stranu omezen kvůli
rozšiřování píku. Největší objem nástřiku, který způsobí rozšiřování pásů do 9% je dán:
Analytická HPLC
Je možný i alternativní způsob zápisu rovnice (protože retenční čas a rychlost
průtoku ):
Pokud máme k dispozici dostatečné množství vzorku (např. analýzy potravin), je možné
nastříknout Vi max, i když budou dříve eluované píky široké nebo hlavní složka přetíží kolonu
(za předpokladu, že se tím nezmění rozlišení pro stopový analyt).
Tím pádem bude koncentrace v maximu píku definována ze spojených rovnic pro cmax
a Vi max:
Toto je nejpříznivější situace pro izokratickou eluci (a 9% rozšiřování píků) i přes to, že je
čtyřnásobné ředění poměrně velké.
Všimněte si, že za těchto podmínek (dostatečné množství analytu a nástřik Vi max) nemají dříve
zmíněné požadavky, jako jsou dostatečně krátká a úzká kolona, malá výška teoretického patra
a krátký retenční čas, žádný význam. Jestliže Vi max neovlivňuje rozlišení, rovnice cmax =
0,24ci platí i pro široké, dlouhé a špatně naplněné kolony. Nicméně je vždy žádoucí
optimalizovat separační proces, protože tím ušetříme čas a množství potřebného solventu.
Ve stopové analýze musíme rovněž vzít v úvahu některé další skutečnosti:
a) Vyhýbáme se chvostování. Asymetrické píky jsou širší, a tím pádem i nižší než
symetrické píky.
Analytická HPLC
b) Gradientovou elucí jsou píky zužovány, a proto jsou i vyšší. Jestliže není možné
eluovat složku ve stopové koncentraci při nízkém retenčním faktoru, je doporučováno
využít gradientovou eluci. Může být použit skokový gradient, který je při správném
načasování jednoduchým a efektivním řešením.
c) Měli bychom použít detektor s nejnižším možným detekčním limitem. Detektory na
principu měření obecných vlastností, jako index lomu aj., nejsou pro stopové analýzy
vhodné. Používanější jsou detektory fluorescenční, elektrochemické, nebo UV
detektory, se kterými můžeme “maskovat” interferující nečistoty volbou vhodné
vlnové délky. Podobného efektu se dá docílit i pomocí MS detekce sledováním
charakteristického iontu. Zlepšení meze detekce až o několik řádů můžeme dosáhnout
derivatizací analytů. Při stopových analýzách může být občas přesnější kvantifikace
pomocí výšky píku, než integrací jeho plochy.
Ačkoli je pro kvantitativní analýzu nezbytný poměr signálu k šumu alespoň 10, pro
kvalitativní analýzu je postačující poměr lepší než 3.
Při stopové analýze je nejdůležitější správná příprava vzorku (pokud to jde i s
obohacením/zkoncentrováním analytu). Samotná HPLC poskytuje účinné možnosti
zakoncetrování. Pokud má rozpouštědlo malou eluční sílu, je vzorek zachycen a koncentrován
přímo na vstupu do kolony. Jestliže je potom použit eluent s vysokou eluční silou, omezuje se
rozšiřování píků a koncentrace v maximu píků jsou vysoké. Tento postup je nejefektivnější
pokud se dá provozovat při k = 0, tzn. s rozpouštědlem na čele. Tato technika je označováno
jako vytěsňovací chromatografie (displacement chromatography). Například se podařilo 4
000 krát obohatit fenoly ve vodách na stacionární fázi styren-divinylbenzenu. Pro oddělení
hlavního analytu od stopových látek může být využita technika přepínání kolony (column
switching).
Limity stanovitelnosti a detekce budou rozebírány i v jiné části textu.
Kvantitativní analýza
Signál detektoru je v HPLC mnohem více závislý na vlastnostech specifické složky než
v plynové chromatografii. Například absorpce UV je funkcí molárního absorpčního
koeficientu, který se pohybuje pro různé látky od 0 až po 10 000 l mol-1 cm-1. Absorpční
Analytická HPLC
koeficient se rovněž liší pro jednotlivé látky homologických řad. Z tohoto důvodu je nezbytné
vytvořit kalibrační závislost pro každou stanovovanou látku.
Kalibrace může být provedena třemi různými metodami: externím (vnějším) standardem,
interním (vnitřním) standardem a standardním přídavkem (viz obrázek dole). Celý postup je
zde vysvětlen na jednobodové kalibraci, i když je v každém případě lepší provádět kalibraci
alespoň na tři nebo více bodů. V takovém případě potom nejsou výpočty prováděny
jednoduchou trojčlenkou, jak je uváděno níže, ale pomocí regresní analýzy kalibračního
grafu. Kalibrační závislost by měla být lineární a měla by procházet počátkem
souřadnicového systému. Jestliže používáme ke kvantifikaci starší kalibraci, je možné, že se
současné chromatografické podmínky liší od těch minulých, a tím roste systematická chyba
měření. Pro kvantitativní analýzu můžeme využít plochy i výšky píků, v následujícím textu
slovem „signál“ budeme označovat obě možnosti.
Modelovým příkladem bude stanovení glukózy v limonádách. Obsah glukózy předpokládáme
asi kolem 5 g l-1. Tři kalibrační postupy v tomto případě budou následující:
a) Metoda externího standardu. Připravíme roztok standardu o známé koncentraci
6 g l-1 (není důležité, aby byla přesně 6,000 g l-1, ale musí být přesně známa). Plocha
píku tohoto roztoku Sstd byla 5400 a plocha píku neznámého vzorku Svz byla 3600.
Analytická HPLC
Analytická HPLC
b) Metoda interního standardu. Ke vzorku i ke standardu (z odstavce a) přidáme stejné
množství jiné látky, která není přítomna ve vzorku. Například přidáme fruktózu (obsah
v obou roztocích 10 g l-1). Plochy píků pro glukózu jsou stejné, jako v předchozím
případě. Plochy píků fruktózy jsou pro oba roztoky stejné, rovny 6300. Z uvedených
měření je možné vypočítat poměr signálů, který udává i poměr obsahu složek.
c) Metoda standardního přídavku. Do vzorku je přidáno známé množství analytu.
V tomto případě tedy přídavek glukózy 5 g l-1. Plochy píků jsou 3600 pro samotný
vzorek a 8100 pro vzorek s přídavkem.
Metoda externího standardu je nejjednodušší a měla by být použita jen pro jednodušší
analýzy. Nástřik musí být v tomto případě proveden s dobrou reprodukovatelností, proto je
doporučován nástřik vzorku s využitím zcela naplněné smyčky. Při vícebodové kalibraci není
vhodné nastřikovat různé objemy vzorku a referenčních standardů (např. 10, 20, 30, 40
a 50 µl), protože není možné zajistit dostatečnou přesnost a správnost těchto nástřiků. Je
výhodnější připravit množství kalibračních roztoků s různými koncentracemi a nastříknout
pokaždé stejný objem (pomocí zcela naplněné smyčky nebo alespoň stejným postupem,
kterým byl dávkován vzorek).
V případě kalibrace na vnitřní standard odchylky v objemu nástřiku nejsou podstatné. Tato
metoda je preferována, pokud je příprava vzorku složitá. Přídavek standardu probíhá před
samotnou úpravou vzorku. Výběr vhodného vnitřního standardu není jednoduchý. Musí být
dostatečně čistý, s přesně definovaným složením a podobnými vlastnostmi, jaké má analyt
zejména ohledně úpravy vzorku, chromatografické separace a samozřejmě konečné detekce.
Navíc by měl být pík standardu v chromatogramu vmezeřený mezi ostatními píky, ne na
začátku ani na konci záznamu.
Analytická HPLC
Standardní přídavek je elegantní metoda pokud máme k dispozici neomezené množství
vzorku. Umožňuje analýzu kalibrovat za realistických podmínek se všemi intercedenty, tedy
v aktuální matrici. Metody standardního přídavku a vnitřního standardu mohou být navzájem
kombinovány.
Definovat, jak často je třeba provádět kalibraci, je důležitou součástí validace analytických
postupů. Je rovněž nezbytné zvážit možné chyby v kalibračních křivkách. V obrázku níže je
vidět rozdíl mezi konstantní systematickou odchylkou a úměrnou systematickou odchylkou.
V prvním případě kalibrační křivka neprochází počátkem. Odchylka může být pozitivní (jako
v tomto grafu), ale i negativní. Při použití metody standardního přídavku tento typ chyby
nemůžeme určit! K řivka s úměrnou chybou má odlišný sklon, který může být větší nebo
menší. Oba typy odchylek se mohou objevovat současně a mohou být odhaleny určením
výtěžnosti.
Pro nalezení meze stanovitelnosti (LOQ) bylo navrženo mnoho metod. Musí být definována
nejnižší koncentrace analytu, kterou je potřeba stanovit s požadovanou správností a
opakovatelností. Nejpragmatičtějším přístupem je stanovit si horní limit standardní nejistoty
opakovatelnosti a najít jej experimentálně. Mělo by být analyzováno nejméně šest různých
koncentrací v okolí očekávaného LOQ a každá koncentrace stanovena nejméně šestkrát.
Analytická HPLC
Příklad
Bylo analyzováno šest roztoků různých koncentrací s matricí, každý z nich desetkrát.
Požadavek na opakovatelnost je specifikován maximální relativní standardní nejistotou 10%.