POTENSI EKSTRAK DAUN PRANAJIWA (Euchresta horsfieldii ... · dalam meningkatkan aktivitas enzim superoksida dismutase dan glutation peroksidase pada tikus wistar (rattus norvegivus)

i

TESIS

POTENSI EKSTRAK DAUN PRANAJIWA (Euchresta

horsfieldii Lesch Benn.) DALAM MENINGKATKAN

AKTIVITAS ENZIM SUPEROKSIDA DISMUTASE

DAN GLUTATION PEROKSIDASE PADA TIKUS

WISTAR (Rattus norvegivus) DENGAN AKTIVITAS

FISIK MAKSIMAL

NI WAYAN RIKA KUMARA DEWI

NIM 1492061009

PROGRAM MAGISTER

PROGRAM STUDI KIMIA TERAPAN FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR

2017

ii

POTENSI EKSTRAK DAUN PRANAJIWA (Euchresta

horsfieldii Lesch Benn.) DALAM MENINGKATKAN

AKTIVITAS ENZIM SUPEROKSIDA DISMUTASE

DAN GLUTATION PEROKSIDASE PADA TIKUS

WISTAR (Rattus norvegivus) DENGAN AKTIVITAS

FISIK MAKSIMAL

Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister

pada Program Magister, Program Studi Kimia Terapan,

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana

NI WAYAN RIKA KUMARA DEWI

NIM 1492061009

PROGRAM MAGISTER

PROGRAM STUDI KIMIA TERAPAN FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR

2017

iii

iv

PENETAPAN PANITIA PENGUJI TESIS

Tesis Ini Telah Diuji pada

Tanggal 30 Januari 2017

Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor

Universitas Udayana, No : 532/UN14.1.28/EP/2017, Tanggal 24 Januari 2017

Ketua : Dr. I Wayan Gunawan, S.Si., M.Si.

Anggota :

1. Dra. Ni Made Puspawati, M.Phil., Ph.D.

2. Prof. Dr. Drs. I Made Dira Swantara, M.Si.

3. Dr. Drs. I Made Oka Adi Parwata, M.Si.

4. Dr. Dra. Wiwik Susanah Rita, M.Si.

v

vi

UCAPAN TERIMAKASIH

Om Swastyastu

Puji syukur penulis panjatkan ke hadapan Ida Sang Hyang Widhi

Wasa/Tuhan Yang Maha Esa, karena atas Asung Kertha Wara Nugraha-Nya tesis

ini dapat terselesaikan.

Bantuan serta bimbingan dari berbagai pihak telah membantu penyusunan

tesis ini. Dalam kesempatan ini, penulis menyampaikan terimakasih yang sebesar-

besarnya kepada Dr. I Wayan Gunawan, S.Si., M.Si. selaku pembimbing I yang

telah memberikan semangat, bimbingan, masukan, dan saran dalam penyelesaian

tesis ini. Terimakasih yang setulus-tulusnya juga penulis sampaikan kepada Dra.

Ni Made Puspawati, M.Phil., Ph.D. yang dengan penuh perhatian telah banyak

membantu penulis, memberikan bimbingan, masukan, dan sarannya kepada

penulis.

Ucapan yang sama juga penulis sampaikan kepada Prof. Dr. dr. Ketut

Suastika, Sp.PD (K) selaku Rektor Universitas Udayana atas kesempatan dan

fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan

pendidikan Program Magister di Universitas Udayana. Ucapan terimakasih ini

juga ditujukan kepada Drs. Ida Bagus Made Suaskara, M.Si selaku Dekan

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana atas

kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa Program

Magister pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas

Udayana. Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Ketua Program Studi

Kimia Terapan Universitas Udayana, Prof. Dr. Drs. I Made Dira Swantara, M.Si

atas kesempatan yang telah diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa

dan mengikuti Program Magister. Ungkapan terimakasih penulis sampaikan

kepada para penguji tesis ini, yaitu Prof. Dr. Drs. I Made Dira Swantara, M.Si, Dr.

Drs. I Made Oka Adi Parwata, M.Si., Dr. Dra. Wiwik Susanah Rita, M.Si yang

telah memberikan saran, masukan, sanggahan, dan koreksi untuk

menyempurnakan tesis ini.

Ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada para

pengajar dan pengampu mata kuliah selama penulis mengenyam pendidikan

vii

Program Magister di Universitas Udayana. Ucapan terimakasih penulis sampaikan

kepada Dr. Ir. I Komang Agusjaya Mataram, M.Kes dan Ni Putu Agustini, SKM.,

M.Si. atas bantuan, bimbingan, saran, dan semangat selama penelitian.

Pada kesempatan ini, penulis juga menyampaikan penghargaan yang tulus

kepada Ketua Jurusan Gizi Poltekkes Denpasar beserta staf dan rekan sekerja

yang memberikan dorongan dan semangat. Ucapan terimakasih penulis

sampaikan kepada Ni Made Dewantari, SKM, M.FOr, G.A. Dewi Kusumayanti,

DCN, M.Kes, Ketut Lilik Arwati, S.Gz., M.Biomed yang memberikan dukungan,

semangat, pengertian, dan perhatian kepada penulis. Ucapan terimakasih yang

sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada bapak tercinta Drs. I Made Karda,

M.Si dan ibu tercinta Ni Made Rustini, S.Sos yang telah mengasuh, mendidik,

membesarkan, dan memberikan dukungan kepada penulis dengan kasih sayang

dan doa. Ucapan terimakasih yang setulus-tulusnya penulis sampaikan kepada

suami tercinta Putu Pratama Jaya Denria, S.Si yang tidak pernah lelah

memberikan semangat, dorongan, perhatian, pengertian, dan kasih sayang kepada

penulis. Ucapan terimakasih juga kepada adik-adik tersayang beserta keluarga

besar atas kasih sayang, dukungan dan doa yang diberikan kepada penulis. Penulis

juga menyampaikan terimakasih kepada bapak mertua tercinta Drs. Ketut

Sulenden, ibu mertua tercinta Ni Luh Nyoman Seriasih, S.Pd dan adik ipar

tercinta yang telah memberikan dukungan, kasih sayang, dan doa kepada penulis.

Akhirnya penulis sampaikan terimakasih kepada rekan seperjuangan Program

Studi Magister Kimia Terapan angkatan 2014 atas dukungan, semangat, dan

bantuannya dalam penyusunan tesis ini.

Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa/Tuhan Yang Maha Esa selalu

melimpahkan anugerah-Nya kepada semua pihak yang telah membantu

pelaksanaan dan penyelesaian tesis ini, serta kepada penulis sekeluarga.

Om Santhi Santhi Santhi Om

Denpasar, 30 Januari 2017

Penulis

viii

ABSTRAK

POTENSI EKSTRAK DAUN PRANAJIWA

(Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) DALAM MENINGKATKAN

AKTIVITAS ENZIM SUPEROKSIDA DISMUTASE DAN GLUTATION

PEROKSIDASE PADA TIKUS WISTAR (Rattus norvegivus) DENGAN

AKTIVITAS FISIK MAKSIMAL

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak etil

asetat daun pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) terhadap superoksida

dismutase (SOD) dan glutation peroksidase (GPx) dalam menghambat peroksidasi

lipid pada plasma darah tikus Wistar serta menentukan golongan flavonoid yang

aktif sebagai antioksidan.

Penentuan aktivitas antioksidan secara in vitro dilakukan dengan metode

DPPH (1,1-diphenyl-2-pycrylhidrazyl) dan secara in vivo dengan tikus Wistar

menggunakan lima kelompok perlakuan. Kelompok kontrol negatif (aquadest 10

mL/200 g BB/hari), kelompok ekstrak etil asetat 10, 20, 30 mg/200 g BB/hari, dan

kelompok kontrol positif (vitamin C 10 mg/200 g BB/hari). Masing-masing

perlakuan diberikan selama 21 hari. Perlakuan aktivitas fisik maksimal yang

diberikan dengan cara merenangkan tikus Wistar sampai hampir tenggelam

selama 60 menit. Semua kelompok dilakukan pemeriksaan aktivitas SOD dan

kadar GPx darah di awal dan akhir perlakuan. Pemisahan ekstrak etil asetat

dilakukan dengan kromatografi kolom, kemudian diidentifikasi dengan

spektrofotometer FTIR dan UV-Vis.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat memiliki aktivitas

antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 393,95 µg/mL dan kadar total flavonoid

sebesar 6619,72 mg QE/100g ekstrak atau 6,62 % (b/b). Pemberian ekstrak etil

asetat 20 mg/200 g BB/hari memberikan hasil yang terbaik yaitu dapat

meningkatkan aktivitas SOD sebanyak 34,93 kali, sedangkan pemberian

ekstraketil asetat 30 mg/200 g BB/hari mampu meningkatkan kadar GPx sebanyak

9,76 kali. Pemisahan dan pemurnian ekstrak etil asetat menghasilkan isolat aktif

yang positif flavonoid (isolat FE) yang diduga merupakan senyawa flavonoid

golongan flavonol yaitu 3,5,7,3’,4’-pentahidroksi flavonol (kuersetin).

Kata kunci : Eucresta horsfieldii (Lesch.) Benn, superoksida dismutase, glutation

peroksidase, flavonol, kuersetin.

ix

ABSTRACT

THE POTENCY OF PRANAJIWA LEAF

(Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) EXTRACT IN INCREASING THE

ACTIVITY OF SUPEROXIDE DISMUTASE AND GLUTHATION

PEROXIDASE IN RATS (Rattusnorvegivus) WITH

MAXIMUM PHYSICAL ACTIVITY

The present study was conducted to determine antioxidant activity of

Pranajiwa leaves ethyl acetate extracts in inhibiting lipid peroxidation through

increasing of superoxide dismutase (SOD) and gluthation (GPx) enzymes activity

in rats with maximum physical activity and to identify the flavonoid active

compounds.

In vitro antioxidant activity was d using DPPH (1,1-diphenyl-2-

pycrylhidrazyl) method and in vivo test was used five groups of rats. A negative

control group (received vehicle only), three treatment groups received ethyl

acetate extracts with a dose of 10, 20, 30 mg/200 g BB/day respectively, and a

positive control group which received vitamin C 10 mg/200 g BB/day. The

maximal physical activity condition of rats was achieved by swimming the rats for

60 minutes. All groups were given treatment for 21 days. The bloods were taken

before and after treatment to measure SOD and GPx activity. The separation of

the ethyl acetate extract was conducted by column chromatography and then

identified by using FTIR and UV-Vis spectrophotometer.

The results showed that ethyl acetate extract had antioxidant activity with

IC50 value of 393,95 µg/mL and total flavonoid content of 6619,72 mg EQ/100g

or 6,62% (w/w). The ethyl acetate extract at a dose of 20 mg/200 g BB/day

increased of SOD activity by 34,93 times, while at a dose of 30 mg/200 g BB/day

increased of GPx activity by 9,76 times. Based on UV-Vis and Infrared spectra

analysis, isolate which positive flavonoid (isolates FE) was tentaviey identified as

3,5,7,3',4'-penthadihydroxi flavonols (quercetin).

Keywords: Eucresta horsfieldii (Lesch.) Benn, superoxide dismutase, glutathione

peroxidase, flavonols, quercetin.

x

RINGKASAN

Pemberian aktivitas fisik maksimal dengan cara merenangkan tikus sampai

hampir tenggelam ternyata memicu peningkatan metabolisme dan konsumsi

oksigen sehingga dapat meningkatkan terbentuknya ROS. Hal tersebut dapat

diketahui dengan mengukur kadar MDA, karena MDA digunakan sebagai

biomarker penanda terjadinya stres oksidatif. Superoksida dismutase (SOD) dan

glutatión peroksidase (GPx) merupakan antioksidan endogen. Superoksida

dismutase berfungsi mengkatalisis reaksi dismutasi radikal bebas anion

superoksida menjadi hidrogen peroksida dan molekul oksigen. Sedangkan

glutatión peroksidase berfungsi mengkatalisis reduksi hidrogen peroksida dan

peroksida lipid oleh glutation. Pembentukan radikal bebas yang terus menerus

terjadi dapat mengakibatkan terjadinya penurunan aktivitas SOD dan GPx

sehingga diperlukan peranan antioksidan eksogen seperti vitamin, polifenol, dan

flavonoid untuk membantu kerja enzim SOD dan GPx dalam mencegah kerusakan

sel. Dengan demikian, pada penelitian ini dilakukan penentuan aktivitas

antioksidan ekstrak etil asetat daun pranajiwa terhadap kenaikan aktivitas SOD

dan kadar GPx pada tikus Wistar dengan pemberian aktivitas fisik maksimal.

Selanjutnya dilakukan penentuan senyawa golongan flavonoid yang terkandung

dalam ekstrak etil asetat daun pranajiwa.

Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan yaitu maserasi, uji fitokimia,

penentuan kandungan total flavonoid, uji aktivitas antioksidan secara in vitro

dengan metode DPPH, dan secara in vivo dengan mengukur aktivitas SOD dan

kadar GPx pada tikus Wistar menggunakan lima kelompok perlakuan yang terdiri

dari kelompok kontrol negatif (pemberian aquades), kelompok perlakuan

pemberian ekstrak daun pranajiwa 10 mg/200 g BB/hari, kelompok perlakuan

pemberian ekstrak daun pranajiwa 20 mg/200 g BB/hari, kelompok perlakuan

permberian ekstrak daun pranajiwa 30 mg/200 g BB/hari, dan kelompok kontrol

positif (pemberian vitamin C 10 mg/200 g BB/hari). Semua perlakuan diberikan

selama 21 hari. Perlakuan aktivitas fisik maksimal yang berikan dengan cara

merenangkan tikus wistar sampai hampir tenggelam selama 60 menit. Semua

kelompok dilakukan pemeriksaan aktivitas SOD dan kadar GPx darah di awal dan

akhir perlakuan.

Pemisahan dan pemurnian ekstrak etil asetat daun pranajiwa dilakukan

dengan kromatografi kolom konvensional dan kromatografi lapis tipis sedangkan

proses identifikasi dilakukan dengan spektrofotometer UV-Vis dan FTIR. Hasil

uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat daun pranajiwa mengandung

senyawa flavonoid dengan kandungan total flavonoid sebesar 6,62% b/b EQ.

Hasil uji aktivitas antioksidan secara in vitro dengan metode DPPH menunjukkan

bahwa ekstrak etil asetat memiliki aktivitas antioksidan lemah dengan nilai IC50

sebesar 393,95 µg/mL. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh senyawa tersebut

masih dalam keadaan tidak murni, sehingga perlu dilakukan fraksinasi dengan

harapan agar didapat nilai IC50 dari senyawa spesifik yang memiliki aktivitas

antioksidan yang lebih kuat bila dibandingkan dengan ekstrak yang tidak murni.

Adanya kandungan metabolit sekunder selain flavonoid kemungkin tidak

memberikan respon sinergis sehingga aktivitas antioksidan yang dihasilkan

lemah.

xi

Hasil uji one way anova terhadap rerata aktivitas SOD dan kadar GPx

setelah pemberian ekstrak etil asetat menunjukkan nilai p sebesar 0,000 (p<0,05),

sehingga nilai tersebut mengindikasikan bahwa kelima perlakuan yang diberikan

terhadap tikus wistar memberikan pengaruh yang berbeda nyata. Hasil uji beda

Duncan terhadap rerata aktivitas SOD dan kadar GPx setelah pemberian ekstrak

etil asetat menunjukkan perlakuan antara kelompok di dalam subset tidak berbeda

nyata, akan tetapi antara subset terdapat perbedaan yang nyata. Jika dilihat dari

aktivitas SOD dan kadar GPx sebelum dan setelah pemberian ekstrak etil asetat

menunjukkan terjadinya peningkatan aktivitas SOD dan kadar GPx. Pemberian

ekstrak etil asetat 20 mg/200 g BB/hari memberikan hasil yang terbaik yaitu dapat

meningkatkan aktivitas SOD sebanyak 34,93 kali yaitu 171,44%. Peningkatan

tersebut terjadi karena pada pemberian ekstrak dengan konsentrasi 20 mg/200 g

BB/ hari sudah menunjukkan aktivitas SOD telah berada pada kisaran normal atau

terjadi kondisi homeostasis. Selain itu meningkatnya aktivitas enzim SOD setelah

pemberian ekstrak etil asetat juga diduga karena induksi gen yang bertanggung

jawab pada sintesis enzim antioksidan melalui translokasi Nrf2 ke inti sehingga

meningkatkan ekspresi gen penyandi antioksidan. Selanjutnya Nrf2 akan

mengikat ARE (Antioxidant Response Element) pada daerah target gen dan akan

menginduksi gen antioksidan. Sedangkan pemberian ekstrak etil asetat 30 mg/200

g BB/hari mampu meningkatkan kadar GPx sebanyak 9,76 kali yaitu 41,80%.

Peningkatan kadar GPx karena pada konsentrasi tersebut ekstrak sudah mampu

meningkatkan transkripsi gen antioksidan GPx yang dimediasi oleh Nrf2.

Pemisahan dan pemurnian ekstrak etil asetat dengan teknik kromatografi

kolom menggunakan fase gerak n-heksan:kloroform:etanol (20:1:1). Pemisahan

menghasilkan isolat aktif yang positif flavonoid yaitu isolat FE dengan hasil

identifikasi pada spektrofotometer FTIR diduga memiliki gugus fungsi –OH, C-H

aromatik, C=C, C=O, C-O, dan C-H alifatik. Hasil análisis dengan

spektrofotometer UV-Vis mengindikasikan bahwa ekstrak etil asetat diduga

mengandung senyawa flavonoid golongan flavonol yaitu 3,5,7,3’,4’-pentahidroksi

flavonol (kuersetin) yang berkontribusi sebagai antioksidan.

xii

DAFTAR ISI

Halaman

SAMPUL DALAM ………………………………………………….. i

PRASYARAT GELAR ……………………………………………… ii

LEMBAR PERSETUJUAN …………………………………………. iii

PENETAPAN PANITIA PENGUJI …………………………………. iv

SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT ………………………. v

UCAPAN TERIMAKASIH …………………………………………. vi

ABSTRAK …………………………………………………………… viii

ABSTRACT …………………………………………………………. ix

RINGKASAN ……………………………………………………….. x

DAFTAR ISI …………………………………………………………. xii

DAFTAR TABEL ……………………………………………………. xv

DAFTAR GAMBAR ………………………………………………… xvi

DAFTAR ARTI LAMBANG, SINGKATAN, DAN ISTILAH……… xvii

DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………… xviii

BAB I PENDAHULUAN ……………………………………………. 1

1.1. Latar Belakang …………………………………………. 1

1.2. Rumusan Masalah ……………………………………… 5

1.3. Tujuan Penelitian ………………………………………. 6

1.4. Manfaat Penelitian ……………………………………... 6

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ……………………………………... 7

2.1. Tumbuhan Pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) 7

2.2. Antioksidan …………………………………………….. 13

2.2.1. Superoksida Dismutase …………………………. 16

2.2.2. Glutation Peroksidase …………………………… 16

2.2.3. Malondialdehida (MDA)………………………… 17

2.3. Flavonoid ………………………………………………. 20

2.4. Vitamin C ………………………………………………. 25

2.5. Stres Oksidatif ………………………………………….. 27

2.6. Radikal Bebas dan Oksidan ……………………………. 28

2.7. Produksi Radikal Bebas Akibat Aktivitas Fisik ……….. 29

2.8. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid …………… 30

2.8.1. Ekstraksi ………………………………………… 30

2.8.2. Pemisahan dan pemurnian ……………………… 31

2.8.3. Spektrofotometri UV-Vis ……………………….. 33

2.8.3.1. Pereaksi diagnostik untuk identifikasi

Flavonoid ………………………………. 34

2.8.4. Spektrofotometri Inframerah …………………… 39

BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS ….. 41

3.1. Kerangka Berpikir ……………………………………… 41

3.2. Kerangka Konsep ………………………………………. 44

xiii

3.3. Hipotesis Penelitian ……………………………………. 44

BAB IV METODELOGI PENELITIAN ……………………………. 45

4.1. Rancangan Penelitian ………………………………….. 45

4.2. Tempat Penelitian ……………………………………… 47

4.3. Ruang Lingkup Penelitian ……………………………... 47

4.4. Penentuan Sumber Data ……………………………….. 47

4.4.1. Populasi ………………………………………... 47

4.4.2. Kriteria sampel ………………………………… 48

4.4.3. Besar sampel …………………………………... 48

4.5. Variabel Penelitian …………………………………….. 48

4.6. Bahan Penelitian ………………………………………. 49

4.7. Alat Penelitian …………………………………………. 49

4.8. Prosedur Penelitian …………………………………… 50

4.8.1. Penyiapan sampel …………………………….. 50

4.8.2. Maserasi ………………………………………. 50

4.8.3. Penentuan kandungan total flavonoid ………… 50

4.8.4. Penentuan aktivitas antioksidan secara in vitro . 52

4.8.5. Penentuan aktivitas antioksidan secara in vivo .. 52

4.8.5.1. Penetapan dosis ekstrak etil asetat daun

pranajiwa ……………………………… 52

4.8.5.2. Hewan percobaan dan pengambilan

sampel ………………………………… 53

4.8.5.3. Pengukuran kadar malondialdehide (MDA) 54

4.8.5.4. Pengukuran kadar superoksida dismutase

(SOD) …………………………………. 54

4.8.5.5. Pengukuran kadar glutatión peroksidase

(GPx) ………………………………….. 55

4.8.6. Pemisahan dan pemurnian ekstrak kental etil

asetat ……………………………………………. 55

4.8.6.1. Kromatografi lapis tipis ………………. 55

4.8.6.2. Kromatografi kolom ………………….. 56

4.8.7. Uji golongan senyawa flavonoid ………………. 57

4.8.8. Identifikasi isolat flavonoid pada fraksi aktif ….. 58

4.8.8.1. Pengukuran dengan spektrofotometer

UV-Vis ……………………………….. 58

4.8.8.2. Pengukuran dengan spektrofotometer

FTIR ………………………………….. 59

4.9. Alur Penelitian ………………………………………… 60

4.9.1. Ekstraksi, pemisahan, dan pemurnian daun

Pranajiwa ……………………………………… 60

4.9.2. Penentuan aktivitas antioksidan secara in vivo .. 61

4.10. Analisis Data ………………………………………….. 61

BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………. 62

5.1. Uji Fitokimia terhadap Ekstrak Etil Asetat Daun Pranajiwa 62

5.2. Total Flavonoid ………………………………………….. 68

5.3. Penentuan Aktivitas Antioksidan Secara In Vitro

dengan metode DPPH……………………………………. 70

xiv

5.4. Penentuan Aktivitas Antioksidan Secara In Vivo ………. 75

5.4.1 Analisis Kadar MDA, Aktivitas SOD, dan GPx

Sebelum Pemberian Ekstrak Etil Asetat………….. 76

5.4.2 Analisis Aktivitas Superoksida dismutase (SOD)… 78

5.4.3 Analisis Kadar Glutation peroksidase (GPx) …….. 87

5.5. Pemisahan dan Pemurnian Ekstrak Etil Asetat Daun

Pranajiwa ……………………………………………….. 96

5.6. Identifikasi Isolat Flavonoid ……………………………. 101

5.6.1 Identifikasi dengan spektrofotometri UV-Vis ……. 101

5.6.2 Identifikasi dengan spektrofotometri FTIR ………. 104

5.6.3 Hasil penambahan pereaksi geser ………………… 107

BAB VI SIMPULAN DAN SARAN ………………………………... 112

6.1. Simpulan ………………………………………………… 112

6.2. Saran …………………………………………………….. 113

DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………… 114

LAMPIRAN ………………………………………………………….. 124

xv

DAFTAR TABEL

Halaman

2.1. Rentangan serapan spektrum UV-Vis flavonoid ……..…………... 34

2.2. Analisis spektrum inframerah senyawa golongan flavonoid ……... 40

5.1. Hasil uji fitokimia terhadap ekstrak etil asetat daun pranajiwa ….. 62

5.2. Nilai % inhibisi dan nilai IC50 ekstrak etil asetat daun pranajiwa

terhadap radikal bebas DPPH ……….…………………………….. 73

5.3. Hasil pengukuran kadar MDA, aktivitas SOD, dan GPx sebelum

pemberian ekstrak etil asetat ……………………………………… 76

5.4. Hasil uji normalitas kadar SOD setelah pemberian ekstrak etil

asetat …………………………………………………………….… 79

5.5. Rerata kadar SOD antar kelompok perlakuan setelah pemberian

ekstrak etil asetat …………………………………………….……. 79

5.6. Analisis aji Post Hoc Aktivitas SOD perlakuan antar kelompok

setelah pemberian ekstrak etil asetat ……………………………… 83

5.7. Hasil analisis uji beda Duncan terhadap aktivitas SOD setelah

pemberian ekstrak etil asetat ……………………………………… 84

5.8. Kenaikan aktivitas SOD ………………………………………….. 85

5.9. Hasil analisis peningkatan aktivitas SOD sebelum dan setelah

pemberian ekstrak etil asetat …………………………………...… 86

5.10. Hasil uji normalitas kadar GPx setelah pemberian ekstrak etil

asetat ……………………………………………………………… 88

5.11. Rerata kadar GPx antar kelompok perlakuan setelah pemberian

ekstrak etil asetat …………………………………………………. 89

5.12. Analisis uji Post Hoc LSD kadar GPx perlakuan antar kelompok

setelah pemberian ekstrak etil asetat ……………………………... 92

5.13. Hasil analisis uji beda Duncan terhadap kadar GPx setelah

pemberian ekstrak etil asetat ……………………………………... 93

5.14. Kenaikan kadar GPx …………………………………………..… 94

5.15. Hasil analisis peningkatan kadar GPx sebelum dan setelah

pemberian ekstrak etil asetat ………………………………….…. 96

5.16. Hasil KLT dengan menggunakan beberapa fase gerak ……….... 97

5.17. Data KLT penggabungan fraksi dari hasil kromatografi kolom… 99

5.18. Hasil uji flavonoid dengan fraksi noda tunggal dari hasil

kromatografi kolom ……………………………………………… 100

5.19. Hasil uji kemurnian secara KLT terhadap isolat FE …………….. 101

5.20. Analisis spektra FTIR isolat FE …………………………………. 106

5.21. Pergeseran panjang gelombang spektra UV-Vis isolat FE ……… 109

xvi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

2.1. Karakteristik tumbuhan pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) 8

2.2. Senyawa prenylflavanon pada akar dan batang Euchresta horsfieldii

Lesch Benn. di daerah Yunnan China …………………………… 10

2.3. Senyawa golongan flavonoid pada akar tumbuhan pranajiwa

(Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) di daerah Thailand ……….... 11

2.4. Mekanisme reaksi flavonoid dengan DPPH ……………………... 15

2.5. Reaksi kondensasi antara satu molekul MDA dengan dua molekul

TBA pada kondisi asam …………………………………………... 18

2.6. Peroksidasi lipid asam lemak tak jenuh rantai panjang ………..…. 19

2.7. Tiga struktur dasar senyawa flavonoid ………………………….... 21

2.8. Flavonoid berdasarkan struktur molekul …………………………. 22

2.9. Struktur 3,5,7,3’,4’-pentahidroksi flavonol …………..………...... 25

2.10. Struktur asam askorbat ………..………………………………….. 26

2.11. Pembentukan elektron di sitokrom oksidase mitokondria ……..… 30

3.1. Kerangka konsep penelitian …………………………………..….. 44

4.1. Rancangan penelitian …………………………………………….. 46

4.2. Ekstraksi, pemisahan dan pemurnian daun pranajiwa …………… 60

4.3. Penentuan aktivitas antioksidan secara in vivo …………………... 61

5.1. Reaksi yang terjadi pada uji Meyer ……………………………… 63

5.2. Reaksi yang terjadi pada uji Wagner …………………………….. 64

5.3. Reaksi yang terjadi pada uji Liebermann Burchard ……………… 64

5.4. Reaksi yang terjadi pada uji FeCl3 ……………………………….. 65

5.5. Reaksi yang terjadi dengan uji NaOH ……………………………. 66

5.6. Mekanisme reaksi pembentukan garam flavilium ……………….. 67

5.7. Mekanisme reaksi kuersetin dengan AlCl3 ………………………. 69

5.8. Mekanisme reaksi flavonoid dengan DPPH ……………………... 70

5.9. Struktur flavonoid dengan aktivitas antiradikal bebas yang tinggi.. 71

5.10. Aktivitas enzim SOD setelah pemberian ekstrak etil asetat……… 80

5.11. Mekanisme peredaman radikal oleh flavonoid …………………... 81

5.12. Aktivitas SOD sebelum dan setelah pemberian ekstrak etil asetat. 84

5.13. Reaksi GPx mengubah hidrogen peroksida menjadi air ……….... 87

5.14. Kadar GPx pada plasma darah tikus wistar perlakuan setelah

pemberian ekstrak etil asetat ……………………………………... 90

5.15. Kadar GPx sebelum dan setelah pemberian ekstrak etil asetat ….. 93

5.16. Spektrum UV-Vis isolat FE ………………………………………. 102

5.17. Senyawa flavonoid golongan flavonol …………………………… 104

5.18. Spektra FTIR isolat FE ………………………………………….... 105

5.19. Pergeseran spektrum UV-Vis pada isolat FE dengan penambahan

pereaksi geser …………………………………………………… 108

xvii

DAFTAR SINGKATAN

AGEs : Advanced Glycation End Product

ARE : Antioxidant Response Element

ATP : Adenosine Triphospate

BSA : Bovine Serum Albumin

DPPH : 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl

DNA : Deoxyribonucleic acid

EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acid

FTIR : Fourier Transform Infra Red

GAEAC : Gallic Acid Equivalent Antioxidant Capacity

GPx : Gluthation Peroksidase

GSH : Glutation tereduksi

HED : Human Equivalen Dose

IC50 : Inhibitory Concentration 50

KLT : Kromatografi Lapis Tipis

Km : Faktor Konversi

MDA : Malondialdehide

NADPH : Nicotinamid adenine dinukleotida fosfat

NBT : Nitro Blue Tetrazolium

Nrf2 : Nuclear factor erythroid 2 related factor 2

8-OHdG : 8-hidroksi-2-dioksiguanosin

ROS : Reactive oxygen spesies

Rf : Retention factor

SOD : Superoxide dismutase

HAT : Hydrogen atom transfer

ET : electron transfer

SPLET : sequential proton loss electron transfer

AITD : autoinmune thyroiditis

TBAR : Thiobarbituric Acid Reactive

xviii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1. Skema kerja penelitian ………………........................................... 124

1.1.Skema kerja tahap ekstraksi …………………………………… 124

1.2.Skema kerja tahap pemisahan, pemurnian, dan identifikasi ….. 125

1.3.Penentuan aktivitas antioksidan secara in vivo ………………... 126

1.4.Pengukuran kadar malondialdehida (MDA) …………………... 126

1.5.Pengukuran aktivitas superoksida dismutase ………………….. 127

1.6.Pengukuran kadar glutation peroksidase (GPx) ………………. 127

2. Pembuatan larutan ………………………………………………… 128

2.1.Larutan uji fitokimia …………………………………………... 128

2.2.Larutan uji total flavonoid …………………………………….. 128

2.3.Larutan uji antioksidan metode DPPH ………………………... 129

2.4.Perhitungan pembuatan larutan sampel ……………………….. 129

2.5.Pembuatan pereaksi geser ……………………………………... 130

3. Perhitungan konsentrasi dan kandungan total flavonoid ………….. 131

4. Pengukuran aktivitas antioksidan ………………………………….. 133

4.1.Nilai IC50 ………………………………………………………. 133

4.2.Kapasitas antioksidan …………………………………………. 134

5. Hasil pengukuran kadar MDA plasma darah tikus yang diberi

Aktivitas fisik maksimal …………………………………………… 136

6. Hasil pengukuran aktivitas SOD dan kadar GPx yang diberi

Aktivitas fisik maksimal …………………………………………… 137

6.1.Data pengukuran aktivitas SOD ……………………………….. 137

6.2.Data pengukuran kadar GPx …………………………………… 138

7. Hasil uji statistik masing-masing perlakuan terhadap aktivitas

SOD tikus setelah pemberian ekstrak etil asetat …………………… 139

8. Hasil uji statistik masing-masing perlakuan terhadap kadar GPx

tikus setelah pemberian ekstrak etil asetat………………………….. 142

9. Hasil pengukuran aktivitas SOD dan GPx rata-rata sebelum dan

setelah pemberian ekstrak etil asetat ……………………………….. 145

10. Persentase kenaikan SOD dan GPx ………………………………… 147

10.1. Persentase kenaikan superoksida dismutase …………………. 147

10.2. Persentase kenaikan kadar glutation peroksidase ……………. 147

11. Profil hasil kromatografi lapis tipis ………………………………… 149

11.1. Profil hasil KLT pemilihan eluen ……………………............. 149

11.2. Profil hasil KLT penggabungan ……………………………… 150

11.3. Profil hasil KLT uji kemurnian ………………………………. 151

12. Perhitungan Rf ……………………………………………………… 152

13. Penafsiran warna bercak dari segi struktur flavonoid ……………… 156

14. Penafsiran spektrum dengan penambahan pereaksi geser …………. 158

15. Hasil determinasi tumbuhan pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch

Benn.) ………………………………………………………………. 161

16. Foto-foto penelitian ………………………………………………… 161

16.1. Persiapan sampel ………..…………………………………… 163

xix

16.2. Persiapan sampel dan ekstraksi ……………………………… 164

16.3. Uji total flavonoid dan uji antioksidan dengan DPPH …..….. 165

16.4. Uji antioksidan secara in vivo ……………………………….. 166

xx

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Stres oksidatif adalah meningkatnya radikal bebas di dalam tubuh, serta

menurunnya kemampuan tubuh untuk menetralisir radikal bebas sehingga dapat

terjadi gangguan fungsi sel. Faktor internal utama yang menimbulkan stres

oksidatif adalah oksidasi fosforilasi akibat melakukan aktivitas fisik maksimal.

Selama aktivitas fisik akan terbentuk radikal bebas bersamaan dengan reaksi

oksidasi fosforilasi untuk membentuk Adenosine Triphospate (ATP) dalam

mitokondria. Pada reaksi tersebut dibutuhkan oksigen yang mana oksigen akan

bereaksi dengan hidrogen untuk membentuk air, tetapi sejumlah oksigen dapat

berubah menjadi radikal bebas. Dengan demikian semakin berat aktivitas fisik

maka dibutuhkan semakin banyak ATP, juga semakin banyak radikal bebas yang

dihasilkan sebagai produk samping (Pangkahila, 2007).

Radikal bebas dapat merusak membran sel, protein, dan DNA yang berakibat

fatal bagi kelangsungan hidup sel/jaringan. Radikal bebas dapat diredam baik

secara enzimatik maupun non-enzimatik oleh senyawa-senyawa yang termasuk

antioksidan. Antioksidan enzimatik seperti Superoxide dismutase (SOD),

Gluthation peroksidase (GPx), dan Catalase (CAT). Untuk antioksidan non

enzimatik dapat berupa mikronutrien pada buah, sayur-sayuran, dan tanaman lain

seperti vitamin A, C, E, asam folat, antosianin, senyawa fenol, dan flavonoid

(Edyson, 2003).

xxi

Tubuh sebenarnya telah mempunyai kemampuan untuk menetralisir radikal

bebas dengan adanya antioksidan endogen seperti Superoxide dismutase (SOD)

dan Gluthation Peroksidase (GPx). Antioksidan tersebut akan menangkal atau

meredam dampak negatif radikal bebas dalam tubuh dengan cara mendonorkan

elektronnya kepada radikal bebas sehingga aktivitas radikal bebas tersebut dapat

dihambat. Akan tetapi jika aktivitas fisik dilakukan secara maksimal maka

dihasilkan radikal bebas yang lebih banyak. Dalam kondisi demikian antioksidan

endogen tidak mampu lagi mengimbangi pembentukan radikal bebas sehingga

akan menyebabkan terjadinya stres oksidatif (Bagiada, 2001).

Untuk meningkatkan aktivitas antioksidan endogen dalam mencegah

terjadinya stres oksidatif maka diperlukan tambahan antioksidan dari luar tubuh

(antioksidan eksogen) yang dapat diperoleh dari asupan makanan dan minuman

yang dikonsumsi tiap hari. Antioksidan tersebut akan meredam radikal bebas

dengan cara mendonorkan elektronnya baik pada tahap inisiasi, propagasi maupun

tahap terminasi. Antioksidan eksogen merupakan jenis antioksidan alami yang

berasal dari kandungan mikronutrien, salah satunya adalah senyawa golongan

flavonoid. Keberadaan flavonoid tersebut dapat membantu kerja superoksida

dismutase dalam tubuh dengan menangkal radikal bebas yang terbentuk akibat

aktivitas fisik maksimal tersebut. Flavonoid berpotensi sebagai antioksidan karena

mampu menyumbangkan ion H+ pada senyawa radikal bebas. (Kandaswami dan

Midelton, 1997).

Hal ini di dukung oleh hasil penelitian yang dilakukan oleh Widayanti (2015)

menyatakan bahwa fraksi n-butanol terong belanda memiliki aktivitas antioksidan

yang kuat dengan nilai IC50 sebesar 69,89 mg/L dan dapat meningkatkan aktivitas

xxii

SOD dan menurunkan kadar MDA. Fraksi n-butanol tersebut diduga mengandung

senyawa flavonoid golongan flavon, flavonol, dan isoflavon yang mungkin

berkontribusi sebagai antioksidan alami. Penelitian Sugianto (2011) menyebutkan

bahwa pemberian jus delima merah dapat meningkatkan kadar GPx pada darah

mencit dengan aktivitas fisik maksimal. Hasil penelitian Wresdiyanti et al. (2013)

menyatakan bahwa α-tokoferol dapat meningkatkan SOD dan menurunkan MDA

jaringan hati tikus di bawah kondisi stres. Menurut Gunawan et al. (2015)

pemberian ekstrak biji pranajiwa dengan dosis 0,5; 2; dan 5 mg/kg bb/ hari dapat

memperbaiki laju kerusakan sel-β pankreas dengan indikasi menurunnya kadar

glukosa darah, AGEs (Advanced Glycation End Product), MDA

(Malondialdehid), dan 8-OHdG (8-hidroksi-2-dioksiguanosin) pada tikus Wistar

hiperglikemia.

Menurut Heyne (1987), tumbuhan Pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch

Benn.) merupakan salah satu tumbuhan tradisional yang digunakan untuk obat

kencing manis, obat asma, obat batuk, afrodisiak, dan merangsang muntah akibat

keracunan makanan. Akar dan batang tumbuhan pranajiwa mengandung

flavonoid, isoflavon, pterocarpan, caumaronochromon dan flavonon. Jenis

flavonoid yang terdapat pada daun adalah apigenin. Bijinya mengandung alkaloid

berupa cytosine (1,5%), matrine dan matrine-N-oxide (Ardaka et al., 2011 dan

Matsuura, et al., 1994).

Menurut penelitian Mizuno et al. (1990a,b,c) pada akar dan batang tumbuhan

pranajiwa mengandung senyawa golongan flavonoid. Di Yunnan (Cina), pada

bagian akar dan batang tumbuhan pranajiwa ditemukan flavanon (glabrol),

pterocarpan (maackiain), ester asam firulat, dan dua prenilflavanon (euchrenon a7

xxiii

dan a8). Sedangkan di Thailand ditemukan empat isoflavon (warangalone, osajin,

6,8-di(3-metil-2-butenil) genistein dan 8-O-methylretusin) dan dua pterocarpans

(maackiain dan sophoracarpan B).

Menurut Sari, dkk. (2015), isolat aktif ekstrak n-heksana daun pranajiwa pada

konsentrasi 8000 ppm memiliki aktivitas antiradikal bebas dengan persentase

peredaman sebesar 94,67%. Sedangkan menurut penelitian Tirta et al. (2010)

menyatakan bahwa kapasitas antioksidan pada ekstrak n-heksana daun pranajiwa

yaitu sebesar 126,94 ppm GAEAC (Gallic Acid Equivalent Antioxidant Capacity).

Berdasarkan hasil penelitian mengenai tumbuhan pranajiwa tersebut, maka

dilakukan uji pendahuluan fitokimia untuk daun pranajiwa. Uji pendahuluan

fitokimia menunjukkan bahwa daun pranajiwa mengandung senyawa fenol,

alkaloid, steroid/terpenoid, saponin, dan flavonoid. Senyawa golongan flavonoid

kemungkinan berperan penting dalam aktivitas antioksidan pada daun pranajiwa.

Menurut Nijveidt et al. (2001), senyawa flavonoid diketahui memiliki sejumlah

kemampuan yaitu dapat menghambat pembentukan radikal bebas hidroksil, anion

superoksida, radikal peroksil, radikal alkoksil, singlet oksigen, hidrogen

peroksida. Mekanisme kerja antioksidan flavonoid yaitu menekan pembentukan

radikal bebas atau ROS (Reactive Oxygen Spesies) dengan cara menghambat

enzim, pengkelatan ion logam (metal ion chelating) yang terlibat produksi radikal

bebas dan meredam radikal bebas (free radical scavengers).

Analisis senyawa golongan flavonoid lebih baik dilakukan dengan

memeriksa aglikon flavonoid yang terdapat dalam ekstrak tumbuhan tersebut.

Karena senyawa flavonoid glikosida yang mengikat gugus gula cenderung lebih

mudah larut dalam air sehingga lebih rumit dalam proses pemisahannya. Aglikon

xxiv

flavonoid yang tidak mengikat gugus gula dan bersifat kurang polar yang

cenderung larut dalam pelarut semipolar seperti etil asetat. Senyawa golongan

aglikon flavonoid diantaranya isoflavon, flavonon, flavon serta flavonol yang

termetoksi (Harborne,1987 dan Markham, 1988). Oleh sebab itu dilakukan

analisis aglikon flavonoid pada ekstrak etil asetat daun pranajiwa.

Berdasarkan beberapa penelitian tersebut, dapat dinyatakan daun pranajiwa

merupakan salah satu sumber antioksidan, akan tetapi belum ada penelitian yang

melaporkan tentang peranan ekstrak etil asetat daun pranajiwa dalam

meningkatkan aktivitas superoksida dismutase (SOD) dan kadar glutation

peroksidase (GPx) pada tikus Wistar yang mengalami stres oksidatif setelah

aktivitas fisik maksimal. Dengan dasar pemikiran tersebut maka pemberian

ekstrak etil asetat daun pranajiwa pada tikus Wistar setelah mengalami aktivitas

fisik maksimal masih perlu diteliti lebih lanjut.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan uraian di atas, maka permasalahan yang dapat dirumuskan adalah

sebagai berikut :

1. Apakah pemberian ekstrak etil asetat daun pranajiwa (Euchresta horsfieldii

Lesch Benn.) dapat meningkatkan aktivitas Enzim Superoksida Dismutase

(SOD) dan kadar Glutation Peroksidase (GPx) pada darah tikus Wistar (Rattus

norvegivus) dengan aktivitas fisik maksimal?

2. Senyawa flavonoid golongan apakah yang aktif memberikan aktivitas

antioksidan yang terkandung dalam ekstrak etil asetat daun pranajiwa ?

xxv

1.3 Tujuan Penelitian

Berdasarkan rumusan masalah yang dipaparkan, maka tujuan dalam penelitian

ini sebagai berikut :

1. Mengetahui aktivitas ekstrak etil asetat daun pranajiwa (Euchresta horsfieldii

Lesch Benn.) dalam meningkatkan enzim superoksida dismutase dan glutation

peroksidase pada darah tikus Wistar (Rattus norvegivus) dengan aktivitas fisik

maksimal.

2. Menentukan golongan flavonoid yang aktif sebagai antioksidan yang

terkandung dalam ekstrak etil asetat daun pranajiwa (Euchresta horsfieldii

Lesch Benn.).

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat yang dapat diperoleh dari penelitian ini untuk perkembangan ilmu

pengetahuan dan teknologi adalah menambah informasi mengenai aktivitas

antioksidan ekstrak etil asetat daun pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.)

terhadap superokside dismutase dan glutation peroksidase pada darah tikus Wistar

(Rattus norvegivus) dengan aktivitas fisik maksimal. Selain itu, penelitian ini

memperkaya informasi mengenai golongan flavonoid yang aktif sebagai

antioksidan yang bersumber dari ekstrak etil asetat daun pranajiwa. Manfaat

praktis dalam penelitian ini adalah menambah pengetahuan dan informasi bagi

masyarakat tentang khasiat daun pranajiwa bagi kesehatan yaitu sebagai salah satu

sumber antioksidan alternatif serta untuk mencegah penuaan.

xxvi