UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO PESQUISA E EXTENÇÃO NÚCLEO BIOTECNOLÓGICO MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIA E BIOTECNOLOGIA FERNANDA MEGIOLARO POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE FUNGOS MELANIZADOS NA DEGRADAÇÃO E ASSIMILAÇÃO DE HIDROCARBONETOS Videira – SC 2016
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POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE FUNGOS MELANIZADOS NA ...§ão... · derivados constituem a principal fonte de energia mundial. O setor petrolífero não está ligado apenas às questões
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UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO PESQUISA E EXTENÇÃO
NÚCLEO BIOTECNOLÓGICO MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIA E BIOTECNOLOGIA
FERNANDA MEGIOLARO
POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE FUNGOS MELANIZADOS NA DEGRADAÇÃO E ASSIMILAÇÃO DE HIDROCARBONETOS
Videira – SC 2016
FERNANDA MEGIOLARO
POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE FUNGOS MELANIZADOS NA DEGRADAÇÃO E ASSIMILAÇÃO DE HIDROCARBONETOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Mestrado Acadêmico em Ciência e Biotecnologia da Universidade do Oeste de Santa Catarina como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciência e Biotecnologia.
Mestranda: Fernanda Megiolaro Orientadora: Drª Jane Mary Lafayette Neves Gelinski Co-orientador: Dr. César Milton Baratto Co-orientadora: Drª Vania Aparecida Vicente – Universidade Federal do Paraná Área: Biotecnologia Aplicada à Agroindústria e Saúde Linha de pesquisa: Bioprospecção, produção e processamento de matéria-prima e bioproduto
Videira – SC
2016
Ficha Catalográfica
Vanessa Pereira – CRB 14/1446
M496p Megiolaro, Fernanda
Potencial biotecnológico de fungos melanizados na degradação e
assimilação de hibrocarbonetos / Fernanda Megiolaro – 2016.
76f. : ils. ; figs. ; tabs.
Orientadora: Profª. Drª. Jane Mary Lafayette Neves Gelinski.
Dissertação (Mestrado em Ciência e Biotecnologia) – Programa de
Pós-Graduação Mestrado Acadêmico em Ciência e Biotecnologia,
Universidade do Oeste de Santa Catarina, Campus Videira –
A indústria do petróleo apresenta extensa e fundamental importância para a
industrialização e o desenvolvimento econômico brasileiro. O petróleo e seus
derivados constituem a principal fonte de energia mundial. O setor petrolífero não
está ligado apenas às questões econômicas, mas também aos danos ao meio
ambiente (FONTES; FONTES, 2013).
A exploração do petróleo apresenta um potencial impacto ambiental aquático,
terrestre e atmosférico (UNEP, 1997). Segundo a Petrobrás, em 2014 o Brasil
atingiu uma produção total de 2,17 milhões de barris por dia de derivados de
petróleo (PETROBRÁS, 2015).
O petróleo apresenta frações de hidrocarbonetos aromáticos em sua
composição, o que torna sua degradação lenta (SATOW et al., 2008). Estes
compostos também estão distribuídos no meio ambiente a partir de fontes
antropogênicas, muitos possuem toxicidade, causam mutação ao DNA, são
carcinogênicos e teratogênicos (HESHAM et al., 2009).
A bioprospecção de organismos selecionados de áreas contaminadas por
hidrocarbonetos oferece uma estratégia importante, com a finalidade de obter
potenciais agentes da biorremediação destas áreas.
Nos últimos anos um grupo de fungos, dematiáceos ou melanizados vêm
chamando atenção, principalmente pela capacidade de sobreviver em ambientes
inóspitos, como em altas concentrações de hidrocarbonetos (PRENAFETA-BOLDÚ
et al., 2001). Esses micro-organismos são considerados patógenos primários em
hospedeiros imunocompetentes, mas sua patogenicidade depende do nicho
ecológico em que se encontra e da espécie à que pertencem (DE HOOG; VICENTE;
GORBUSHINA, 2013). Esses fungos são frequentemente encontrados em
ambientes ricos em hidrocarbonetos.
Os fungos fazem parte de um grupo extenso de micro-organismos,
considerados onipresentes, são capazes de sobreviver em diversos habitats, crescer
em inúmeros substratos e desempenhar funções distintas (SHIGH, 2006). Dentre
essas funções, a biorremediação vem ganhando destaque entre a comunidade
cientifica.
Segundo Prenafeta-Boldú, Summerbel e De Hoog (2006) as leveduras negras
possuem capacidade de assimilação destes compostos, sendo capazes de utilizar
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os hidrocarbonetos aromáticos como única fonte de carbono. Essa descrição
confere um potencial biotecnológico ainda não explorado (HESHAM et al., 2009).
Dentro deste contexto Prenafeta-Boldú, Summerbell e De Hoog (2006) façam
menção à baixa produção científica relacionada à degradação de compostos
monoaromáticos por fungos.
Esta pesquisa teve como objetivo isolar fungos melanizados oriundos de
materiais poluídos por combustíveis, avaliando características fisiológicas e o
potencial biotecnológico na assimilação de hidrocarbonetos do grupo BTX (Benzeno,
Tolueno e Xileno).
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2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Investigar o potencial biotecnológico de fungos melanizados, prospectando
micro-organismos assimiladores de hidrocarbonetos benzeno, tolueno e xileno.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obter fungos melanizados de substratos poluídos por hidrocarbonetos,
utilizando dois dos principais métodos de isolamento: flotação em óleo mineral e
inóculo direto em ágar;
Avaliar isolados fúngicos melanizados no que tange às características
fisiológicas voltadas à biorremediação ambiental;
Selecionar entre os isolados os que apresentam potencial de assimilação de
hidrocarbonetos BTX, gasolina e diesel;
Identificar os isolados selecionados por análise molecular avaliando-se o
relacionamento filogenético dos mesmos.
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3 REVISÃO DA LITERATURA
A revisão da literatura aqui realizada apresenta informações relevantes ao
estudo de leveduras negras e fungos melanizados que demonstram potencial de
assimilação de hidrocarbonetos monoaromáticos de origem petrolífera.
3.1 FUNGOS MELANIZADOS
Dados sobre fungos melanizados vem ganhando notoriedade principalmente
por sobreviverem em ambientes inóspitos. Esta característica se mostra de grande
importância, principalmente para aplicações biotecnológicas. Também denominados
de fungos dematiáceos, são caracterizados pela presença da melanina na parede
celular. Conferem a estes, coloração escura, podendo apresentar-se nas cores
negra, roxo, verde oliva e marrom escuro (KEJZAR et al., 2013).
Um dos primeiros fungos melanizados a serem descritos foi o Sporothrix
schenckii, popularizando o termo "sporotrichoid”, que por diversas vezes foi utilizado
para descrever fungos semelhantes. Os termos mais utilizados são “Phaeoid",
"Phaeo-sporotrichose" e "dematiácea" (PAPPAGIANIS; AJELLO, 1994; MARQUES,
et al., 2006) e vem sendo alterados durante as últimas décadas. O termo
comumente encontrado na literatura médica micológica se refere a fungos
dematiáceos, no entanto este termo não tem sido totalmente aceito devido ao seu
termo lexo do grego “deme”que significa “maço”. Por ser mais específico, o termo
melanizado tornou-se mais utilizado e adequado, devido ao seu significado mais
específico. Ainda assim, os termos "dematiáceos," "melanizados", "escuras", e
"phaeoid" são utilizados como sinônimos para designar fungos que contém melanina
(REVANKAR; SUTTON, 2010).
A principal característica destes fungos é a presença da melanina na parede
celular, o que justifica a sua coloração escura, sendo essa percebida tanto
microscopicamente quanto macroscopicamente (REVANKAR; SUTTON, 2010). A
melanina é um biopolímero que protege contra a radiação UV, temperaturas
extremas, agentes oxidantes e, confere virulência (YURLOVA; DE HOOG;
FEDOROVA, 2008; KEJZAR et al., 2013). Outras qualidades atribuídas à melanina
ainda aparecem na produção de bioplásticos, em células fotovoltaicas orgânicas e
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absorção de UV em lentes ópticas. Além de um papel na biorremediação
(DESHMUKH, 2012).
A melanina está presente em diversos organismos e estas biomoléculas
podem apresentar-se com diversas estruturas, dependendo do organismo e do local
que está sendo produzida (YORLOVA; DE HOOG; FEDOROVA, 2008). São
biopolímeros de elevado peso molecular, e formados a partir da polimerização
oxidativa de compostos fenólicos; como por exemplo: tirosina e catecol (YORLOVA;
DE HOOG; FEDOROVA, 2008).
Não há uma quantidade específica de melanina para que o fungo possa ser
considerado dematiáceo (REVANKAR; SUTTON, 2010). Os fungos dematiáceos são
considerados sapróbios, onipresentes, e em sua maior parte, encontrado no solo,
mas diversos agentes etiológicos ocupam nichos ou micronichos específicos. O
conhecimento da ecologia natural do fungo pode contribuir para a compreensão do
potencial patológico (CALIGIORNE et al., 1999).
Algumas espécies de fungos dematiáceos, tem capacidade de crescer em
substratos extremos, com altas concentrações de xileno, tolueno, ou madeira tratada
com creosoto (DÖǦEN; ILKIT; DE HOOG, 2013). As espécies da ordem
Dothideales, do gênero Exophiala e afins são comumente chamadas de leveduras
negras, devido a sua capacidade de produzir brotamento e células leveduriformes
em algum momento do seu ciclo de vida, além de hifas e células escuras
(CALIGIORNE et al., 1999; PRENAFETA-BOLDÚ; SUMMERBELL; DE HOOG,
2006).
3.2 CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS LEVEDURAS NEGRAS
As leveduras negras incluem-se no Phylum Ascomycota, Ordem
Chaetothyriales, Família Herpotrichiellaceae e Gênero Exophiala. No Phylum
Basidiomycota, as leveduras negras estão presentes nos gêneros Moniliella e
Trichosporonoides, com posição filogenética ainda não definida. De fato, a
separação filogenética entre os dois Phyla ocorreu há 400 milhões de anos, com a
invasão das plantas na terra (GUARRO; GENÉ; STCHIGEL, 1999). A maioria das
espécies destes gêneros dos basidiomicetos tem importância industrial, mas pouca
na área clínica (YORLOVA; DE HOOG; FEDOROVA, 2008). Com o avanço das
técnicas de biologia molecular, a identificação e o relacionamento filogenético de
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fungos passaram por mudanças e reagrupamentos. Isto tem minimizado
inclusão/exclusão de grupos com base na classificação binominal geral pelo Código
Internacional de Nomenclatura Botânica (ICBN) (GUARRO; GENÉ; STCHIGEL,
1999; TSUI et al., 2011).
A característica mais marcante destes fungos é a presença da melanina na
parede celular que confere coloração negra, castanho escuro e verde oliva aos
fungos. Mas também podem apresentar-se nas cores marrom e roxo e liberar
pigmento vermelho-vinho em ágar sabouraud (DE HOOG et al., 1995; REVANKAR;
SUTTON, 2010).
A identificação preliminar de fungos melanizados está relacionado à sua
morfologia macroscópica, que se distingue por meio da cor, da taxa de crescimento
e do desenvolvimento em meios específicos (REVANKAR; SUTTON, 2010).
As propriedades fisiológicas são caracterizadas principalmente pela
tolerância à ciclohexemida, assimilação de nitrato, hidrólise da uréia e crescimento
em diversas concentrações de sal. Identificadas ainda pela morfologia celular,
fermentação e assimilação de fonte de carbono e fontes de nitrogênio (HESHAM et
al., 2009).
Além da presença de melanina, de caroteno, as leveduras negras são
caracterizadas pela formação de parede celular espessa, fase leveduriforme, formas
adicionais de conidiogênese, termotolerância, osmotolerância, hidrofobicidade,
produção de polissacarídeos extracelulares, sideróforos, bem como produção de
metabólitos secundários ácidos ou alcalinos (HOOG et al., 2003).
A morfologia microscópica é notada por meio de conídios, hifas, e a
coloração escura da parede celular (DE HOOG et al., 1995). As leveduras negras
apresentam pleomorfismo, ou seja, morfologia microscópica variável na mesma
espécie fúngica, podendo apresentar as fases leveduriforme e, subsequentemente,
a filamentosa. Contudo, apresentar-se ou não na fase leveduriforme depende do
nicho ecológico ao qual elas estão inseridas (ZHAO et al., 2010; SEYEDMOUSAVI
et al., 2014).
As leveduras negras mostram-se ambientadas a uma ampla gama de
condições ambientais (DÖǦEN; ILKIT; DE HOOG, 2013). Contudo demonstram
notabilidade devido a presença em ambientes extremos, incomuns e tóxicos. As que
pertencem, principalmente, à ordem Chaetothyriales são dificilmente isoladas de
ambientes, principalmente por metodologias tradicionais (BADALI et al., 2008). No
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entanto técnicas seletivas podem mostrar a presença dessa levedura em uma
diversidade de ambientes. Ainda existe uma dificuldade na obtenção de protocolos
otimizados em temperatura, pH, meios nutricionais. Outra dificuldade de isolamento
é devido à alta contaminação, estas aparecem normalmente antes dos fungos
melanizados, que passa por vezes, despercebido (DE HOOG; VICENTE;
GORBUSHINA, 2013).
Algumas leveduras negras apresentam patogenicidade oportunista, sendo
causadoras da cromoblastomicose e feohifomicose, comumente conhecidas e
estudadas por seu caráter patogênico, que afetam principalmente indivíduos
imunocompetentes. No entanto a grande maioria é de origem ambiental e não
apresentam patogenicidade (MATOS et al., 2003; ZHAO et al., 2010).
Outra característica destes organismos é apresentar relações simbióticas com
algas e cianobactérias quando privados de nutrientes (DE HOOG; VICENTE;
GORBUSHINA, 2013). Segundo Voglmayr et al. (2011) podem conviver em simbiose
também com organismos bastante diferenciados como formigas, oriundas da
América do Sul, Sudeste da Ásia Central e África. As leveduras negras são ainda
responsáveis pelo escurecimento de rochas e superfícies de esculturas, na
destruição de mármore e calcário (STERFLINGER; PRILLINGER, 2001).
Badali et al. (2008) citam a presença de leveduras negras em rochas, fazendo
referência ao estudo escasso desses organismos por pesquisadores.
A identificação de fungos melanizados que degradam hidrocarbonetos é um
processo um pouco mais laborioso e lento, além de poucas informações sobre esses
organismos. Devido a essas dificuldades, a identificação genética é de grande
importância, por ser mais rápida e precisa (HESHAM et al., 2009). Conforme Badali
et al. (2008) pesquisas em filogenia molecular possibilitam conhecer as leveduras
negras e as atividades biológicas incomuns que elas apresentam
3.3 FILOGENIA E IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR
Segundo Taylor et al. (2000) a análise filogenética é determinada pela
variação de características do ácido nucleico com a proximidade de suas espécies
evolutivas. A região ITS (Internal Transcribed Spacer/Espaçador Interno Transcrito)
é a unidade mais usada para identificação de espécies e sua filogenia. A região
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ITS1, 5.8S e ITS2 (Figura 1), fornecem facilidade de amplificação e variabilidade à
nível de espécie (GOSTINČAR et al., 2010)
Figura 1 – Representação da região do DNAr com Espaçador Interno Transcrito
Legenda: 18S e 28S RNAs ribossomais codificados pelo gene rDNA; região ITS= espaçador interno transcrito; oligonucleotídeo iniciador= fragmento curto de ácidos nucléicos. Fonte: Embasado em Kasai et al. (2006)
A filogenia pode esclarecer o papel do micro-organismo em uma determinada
posição e sua função em uma comunidade. As comunidades são mais próximas
filogeneticamente, essa característica permite a sobrevivência dos organismos em
um mesmo habitat (MAHERALI; KLIRONOMOS, 2012).
A caracterização molecular deve ser avaliada seguidamente às semelhanças
fenotípicas. Essas características gênicas são dadas por meio do sequenciamento
dos genes ribossomais em comparação a base de dados do GenBank ou bancos de
dados privados (STERFLINGER; PRILLINGER, 2001; DE HOOG et al., 2006;
REVANKAR; SUTTON, 2010). Podem ser ainda verificados além das regiões ITS, os
domínios D1/D2, β-tubulina, actina, calmodulina, superóxido dismutase de
manganês, subunidade ATPase 6 e quitina-sintase (ZENG, 2007; SEYEDMOUSAVI,
et al., 2014).
Como auxílio na identificação molecular e filogenética, as análises de reação
em cadeia da polimerase (PCR) são de grande importância, pois o uso de
oligonucleotídeos específicos aumentam a sensibilidade da reação. Possibilitando
também a comparação com os bancos de dados e posterior classificação
filogenética (FUNGARO, 2000).
O sequenciamento da região ITS do DNAr (ácido desoxirribonucleico
ribossômico) tem sido amplamente utilizado em estudos de diversidade e filogenia
de fungos (CALIRGIONE et al., 2005; VOGLMAYR, H. et al., 2011; FIGEL et al.,
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2013). ZENG (2007) por exemplo, apresenta dados referentes à confiabilidade da
amplificação da região ITS para identificação de espécies de Exophiala, sem
necessidade da amplificação de outras regiões. Também, Caligiorne et al. (2005)
descrevem a eficiência das regiões ITS para a identificação de espécies de
leveduras negras e a formação da árvore filogenética, desde que pertençam a um
mesmo Clado. Afirmam ainda que o sequenciamento de genes do DNAr são
indispensáveis para o reconhecimento de espécies de leveduras negras causadoras
de doenças humanas. Isto porque várias espécies possuem polimorfismos intra-
específicos no domínio ITS, reconhecendo diferentes variantes de virulência.
Para avaliar a proximidade filogenética de fungos é utilizado um cálculo de
distância média filogenética taxon (MNTD- mean nearest phylogenetic taxon
distance), quanto menor o MNTD, mais próximos são filogeneticamente (VAMOSI, et
al., 2009).
Estudo realizado por De Hoog et al. (2013) com novas espécies de leveduras
negras demonstrou que uma grande parte das amostras analisadas oriundas de
fontes ambientais fazem parte de um clado com potencial oportunista. Estas
linhagens clínicas podem possuir a mesma constituição genética que seus
homólogos ambientais de mesma espécie. Espécies Cladophialophora psammophila
foram isoladas de solo poluído e demonstra crescimento em tolueno enquanto C.
bantiana é um patógeno humano responsável pela encefalite fatal. Estes fungos são
bem próximos filogeneticamente, mas possuem grande diferença na atividade
biológica (BADALI, 2008; BLASI et al., 2016).
No Brasil, espécimes isoladas de madeira tratada com creosoto e de ambientes
poluídos por hidrocarbonetos foram identificadas por meio de análise molecular
realizada com DNAr. Foram usados os oligonucleotídeos V9G e LS266 para a
amplificação e para sequenciamento os iniciadores ITS1 e ITS4, mostrando que
pertenciam à mesma ordem de agentes etiológicos conhecidos; mas as espécies
ainda não eram descritas pela literatura (VICENTE et al., 2008). Esses autores
relatam ainda que é possível distinguir as categorias de organismos oportunistas,
indicando diferenças na patogenicidade e virulência por intermédio de técnicas
moleculares (VICENTE et al., 2008). Voglmayr et al. (2011) utilizaram a análise
molecular para verificar a diversidade de fungos melanizados simbiontes a formigas,
por meio das regiões ITS1-5,8S-ITS2, com iniciadores V9G, e outras análises
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complementares. O estudo demonstrou a importância das relações ecológicas que
ocorrem em habitats pouco conhecidos.
3.4 ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA LACASE
A lacase é uma polifenol oxidase (p-difenol oxidase EC 1.10.3.2), que pode
ser definida como uma óxido-redutase capaz de oxidar polifenóis (EAWAG, 2003), e
uma ampla gama de compostos, tendo como aceptor terminal de elétrons o oxigênio
molecular (MAYER; STAPLES, 2002).
As enzimas lignolíticas são capazes de degradar os hidrocarbonetos por meio
da oxidação do substrato, formando um radical catiônico. (SILVA et al., 2004;
HARITASH; KAUSHIK, 2009). As lacases oxidam fenóis e estruturas
lignolíticas formando radicais passíveis de repolimerização ou despolimerização
(THURSTON, 1994; LEONOWICZ et al., 1999). O complexo enzimático que degrada
lignina se mostra eficiente na degradação de diversos poluentes orgânicos, bem
como compostos aromáticos fenólicos e não fenólicos (DURÁN et al., 2002; SILVA
et al., 2004).
Estudos evidenciam a importância da lacase em fungos melanizados (FENG,
et al., 2012; SUN. et al., 2012; DO NASCIMENTO et al., 2016). As fenoloxidases são
enzimas envolvidas com a atividade do metabolismo secundário dos fungos
filamentosos (DURAN; ESPOSITO, 2000). Dentre elas, as tirosinases, peroxidades,
catalases e lacases são comumente associadas à síntese de melaninas pela união
das moléculas de 1,8-di-hidroxinaftaleno (DHN) ao final da via de DHN melanina,
quando ocorre a união de moléculas de 1,8-DHN para formar o polímero melanina
(BUTLER; DAY, 1998; YURLOVA; DE HOOG; FEDOROVA, 2008).
No caso das eumelaninas produzidas por alguns basidiomicetos é possível
prever que esses polímeros são formados nas reações de oxidação da catecolamina
por intermédio de uma lacase (WILLIAMSON; WAKAMATSU; ITO, 1998). Plonka e
Grabacka (2006) revisaram sobre a biossíntese de melanina do ponto de vista
biotecnológico e biomédico. Eles reconheceram que o fungo patogênico
Cryptococcus neoformans produz melanina a partir de precursores de tirosina,
DOPA (dihidroxifelilalanina) e catecolaminas. A lacase é expressa localizando-se na
camada externa da parede celular, assim como a melanina. Isto protege o
organismo contra toxinas e outros fatores adversos o qual a melanina neutraliza.
Total (mL) 10 10 10 10 10 10 10 Legenda: 1- Meio mineral; C-= MM sem carbono; C+= MM com glicose; Benzeno= MM com 1% de benzeno; Tolueno= MM com1% de tolueno; Xileno= MM com 1% de xileno; Gasolina= MM com 1% de gasolina; Diesel= MM com 1% de diesel.
Os erlenmeyers foram fechados com papel alumínio e incubados em
dessecadores sob agitação orbital constante de 100 rpm à 28°C, pelo período de
dez dias.
Foram utilizados 7 dessecadores, sendo um para cada ensaio (C-,C+,
benzeno, tolueno, xileno, gasolina e diesel), evitando trocas gasosas entre os
experimentos. As culturas foram então coletadas e filtradas em membranas (Milipore
Ø0,47µm) previamente pesadas e secas à 110ºC, até atingir valor de massa
constante. A massa seca foi calculada utilizando o peso final da membrana após a
filtração, diminuído do peso inicial da membrana.
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a obtenção dos dados estatísticos foi utilizado o programa Statistica
(StatSoft South America) e Microsoft office excel 2007®. A análise de variância
(ANOVA ao nível de significância de 5%,) e as médias comparadas pelo teste de
Tukey foram aplicadas quando necessário.
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4.6 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR E FILOGENIA
4.6.1 Extração de DNA
A extração de DNA foi realizada utilizando o Ultra Clean® Microbial DNA
Isolation Kit (MO BIO, laboratories Inc. EUA)1, com alterações na metodologia,
conforme descritas a seguir:
Os isolados foram cultivados em MEA, e após 5 dias foi realizada a raspagem
de aproximadamente 2cm2 de micélio com o auxilio de uma lâmina estéril. O micélio
foi adicionado a um tubo de 2mL contendo 300µL da solução MicroBead e 50µL da
solução MD1. Em seguida o tubo foi agitado horizontalmente por 2 minutos em
vórtex e 2 minutos em banho-maria à 65ºC, alternadamente durante 10 minutos.
Após centrifugação o sobrenadante foi transferido para um novo tubo de 1,5mL e
acrescido 100 µL da solução MD2 e agitado em vórtex. Posteriormente permaneceu
por 10 minutos a 4ºC, centrifugando-se e adicionado-se ao sobrenadante 900µL da
solução MD3. Após agitação, 600µL desta solução foram transferidos para o Spin
Filter e centrifugados, sendo necessário repetir o último passo. Em seguida, o filtro
foi lavado com 300µL da solução MD4. Após a remoção total da solução MD4, o
filtro foi transferido para um novo tubo de 1,5mL. Foram adicionados 50µL de água
ultrapura (miliQ) no centro da membrana filtrante, para eluição do DNA. Após a
centrifugação o DNA foi analisado por eletroforese em gel de agarose 1,0% em
tampão TBE (Tris base, ácido bórico e EDTA, formulação em Anexo) 0,5X,
adicionado de brometo de etídeo (0,5 µg.mL-1). A integridade do DNA presente na
amostra foi verificada utilizando o sistema de transiluminador UV(VilbertLourmat,
França) e captura de imagem com o programa Photo Capt 12.4 Windows.
4.6.2 Amplificação da Região ITS – Internal Transcribed Spacer
Após a verificação da integridade do DNA, os fragmentos foram sequenciados
a partir de ambas extremidades, direto (forward) V9G
(5'TTACGTCCCTGCCCTTTGTA3') e inverso LS266
1 Zhao et al. (2010) utilizaram o mesmo protocolo determinado pelo Ultra Clean® Microbial
DNA Isolation Kit. No Anexo 1 está o protocolo original.
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(5'GCATTCCCAAACAACTCGACTC3') (FIGEL et al. 2013). As reações foram
elaboradas conforme a Tabela 5.
Tabela 5 – Produtos utilizados para as reações de amplificação dos isolados fúngicos.
Produto Volume (µL) Concentração
Água ultrapura (miliQ) 14,05 -
Tampão (PBS) 2,50 10x
MgCl2 0,75 50mM
dNTP's 2,00 2,5mM
Primer V9G 1,00 10 pmol
Primer LS266 1,00 10 pmol
Taq polimerase 0,20 1U.mL-1
DMSO 1,50 -
DNA 2,00 50ng Legenda: A reação foi realizada com volume total de 25µL.1. Reagentes Ludwig Biotecnologia LTDA.
As condições para a amplificação em termociclador B960 Gene Mate Series
(China) da região ITS para os isolados foi realizada segundo o programa: 94°C
durante dois minutos, seguido de 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 55°C
durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto e por fim 72°C durante 3 minutos.
O produto obtido da amplificação foi visualizado por eletroforese em gel de
agarose 1% conforme descrito no item 4.5.
A purificação foi realizada de acordo com Sambrook e Russel (2001), com
pequenas adaptações. Em um tubo de 0,5mL foi adicionado 40µL do produto da
PCR, 60µL de águra ultrapura, 20 µL de acetato de amônio (10mol.L-1) e 250 µL de
etanol absoluto. Após o período de 30 min a 4°C foi realizada a centrifugação por 15
min. Em seguida o sobrenadante foi descartado e após duas lavagens com etanol
70%, o produto foi ressuspenso em água ultrapura. O produto da reação foi
verificado em gel de agarose conforme descrito no item 4.7.1.
4.6.3 Sequenciamento e Análise Filogenética
As sequências foram obtidas com o sequenciador ABI-PRIM 3100 usando o
protocolo padrão do Laboratório ACTGene Análises Moleculares (Centro de
Biotecnologia, UFRGS, Brasil), para isto foram utilizados os oligonucleotídeos V9G e
LS266 conforme descrito no item 4.7.2.
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Para a elucidação taxonômica e filogenética as sequências resultantes foram
comparadas a linhagens depositadas no GenBank (submissão direta), banco de
dados do NCBI2, bem como linhagens de referência de gêneros Cladosporium e
Exophiala incluídas na base de dados do CBS - Centraalbureau voor
Schimmelcultures 3. As sequências obtidas foram alinhadas utilizando o programa
Clustal W (LARKIN et al., 2007). Análise evolutiva, filogenética e molecular foram
conduzidas usando o MEGA VERSÃO 7 (KUMAR; STECHER; TAMURA, 2016), a
partir dos isolados identificados e linhagens com similaridade de no mínimo 97%.
2 NCBI - National Center for Biotechonology Information. Disponível em:
<www.ncbi.nlm.nih.gov>.
3 CBS - Fungal Biodiversity Centre (Holanda), instituto de referência internacional sobre
Peças com sujidades 0 1 Escola Técnica Laboratório de mecânica 1 0
Ferro Velho Estopa 0 2
Madeira 0 0
Material com sujidades 1 4
Piso 0 0
Solo 0 0
Total 6 16 1- Inóculo direto em ágar mycosel com antibióticos. 2- Metodologia segundo Vicente et al. (2001, 2008)
Entre os tipos de amostras obtidas dos diferentes ambientes poluídos por
hidrocarbonetos, as que mais resultaram em isolados de fungos foram: peças com
41
sujidades, estopas e bico ejetor de gasolina. Satow et al. (2008) obteve pela técnica
de flotação em óleo mineral, 107 isolados a partir de 3 amostras de solo oriundas de
uma área de landfarming de petróleo. Utilizando outra técnica de isolamento,
Prenafeta-Boldú (2001) também obteve sucesso em relação ao isolamento de
fungos assimiladores de hidrocarbonetos. No entanto, apenas os fungos que eram
originalmente obtidos de locais poluídos por BTEX (Benzeno, Tolueno, Etilbenzeno e
Xileno) demonstraram capacidade de assimilar hidrocarbonetos. Portanto, a
presença de hidrocarbonetos no ambiente pode ter sido o fator determinante para o
isolamento das leveduras negras com potencial de biorremediar áreas degradadas
por hidrocarbonetos.
Todos os isolados foram caracterizados macroscopicamente como colônias
com coloração de fundo negra (placas de ágar), castanha ou verde-oliva. E,
microscopicamente, pela presença de hifas ou pseudo-hifas de coloração castanha
escura (Fotografia 1).
42
Fotografia 1 – Macroscopia e microscopia de linhagens de Cladosporium sp. e Exophiala sp., cultivados em placas em ágar extrato de malte 2%
Legenda: Primeira coluna crescimento miceliar visualizado na parte frontal da placa de ágar, segunda coluna visualização do verso da placa de ágar; terceira coluna visualização por microscopia óptica (Bioval, Brasil) respectivas aos grupos A 40x, 100x B-E 40x, F 40x, 100x. = Grupo A: Cladosporium sp.; B: Exophiala sp.; C: Cladosporium halotolerans; D: Cladosporium sp.; E: Cladosporium halotolerans; F: Exophiala dermatitidis.
43
5.2 CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS NA AVALIAÇÃO DO POTENCIAL
BIOTECNOLÓGICO
5.2.1 Hidrofobicidade dos Isolados
Noventa e um por cento dos isolados (91%) demonstraram caráter
hidrofóbico, ou seja, com percentual de recuperação de esporos na fase aquosa
abaixo de 50%. Para os hidrofílicos (9%), o percentual foi abaixo de 50%. Segundo
Satow et al. (2008), isolados obtidos pela técnica de flotação em óleo não exclui a
possibilidade de isolar leveduras negras com caráter hidrofílico. No entanto, no
presente estudo, tendo em vista a composição do material em que foram obtidas, ou
seja, na presença de combustíveis (gasolina e diesel), esperava-se que a maioria
dos micro-organismos ali existentes fossem de origem hidrofóbica. Göttlich et al.
(1995) verificaram variação no caráter hidrofóbico entre Exophiala jeanselmei e
Exophiala dermatitidis. Logo, diferentes espécies de um mesmo gênero não
apresentam homogeneidade no caráter hidrofóbico, esse fator pode estar ligado à
ecologia distinta entre essas espécies.
O caráter hidrofóbico pode servir como facilitador na dispersão de esporos,
conforme observado anteriormente por Seyedmousavi (2014), para o gênero
Cladophialophora.
5.2.2 Tolerância ao Cloreto de Sódio
Para o parâmetro tolerância ao cloreto de sódio, todos os isolados tiveram
crescimento (medido a partir do tamanho da colônia em centímetros) sob diferentes
concentrações em meio de cultura. Nas concentrações de 2,5% e 5,0% o
crescimento médio foi mais evidente, embora não tenha havido diferença estatística
significativa (p<0,05) entre os mesmos. Contudo para as demais concentrações do
sal (7,5% e 10%) a diferença de crescimento entre os grupos foi significativa (Gráfico
1). De Hoog et al. (2004), observando linhagens de Fonsecaea em diferentes
concentrações de cloreto de sódio, verificaram crescimento nas concentrações de
2,5% e 5,0%. Entretanto, diferente do presente estudo em que dos 22 isolados
testados 19 cresceram na condição de 10%, os autores não observaram
crescimento de nenhuma das linhagens de Fonsecaea com 10% de cloreto de sódio
44
no meio. Conforme citado por Gunde-Cinerman, Ramos e Pelmenitas (2009)
estudos indicam que fungos com comportamento halofílico não necessariamente
requerem sal no meio, mas conseguem se adaptar bem em ambientes hipersalinos.
A existência de linhagens de fungos, particularmente leveduras, com crescimento
em concentrações moderadas a altas de cloreto de sódio, pode indicar uma
tolerância a íons tóxicos e certa capacidade de adaptação a ambientes inóspitos
(GOSTINCAR et al., 2011).
Sterflinger (1998) foi um dos primeiros pesquisadores a verificar a tolerância
a diferentes concentrações de NaCl por fungos melanizados isolados de rochas. O
estudo resultou que dos 16 isolados, 13 cresceram à 3,5%, 11 à 7%, 8 à 10,5%, 5 à
14%, 2 à 17,25%, 2 à 21% e apenas um isolado cresceu nos meios com
concentração de 24,5% e 27%. Mais recentemente, Kejzar et al. (2013) avaliaram a
integridade da parede celular da levedura negra Hortaea wernecki, isolada
naturalmente de ambientes hipersalinos, a partir da ação de inibidores de melanina
(46 e triciclazole). A liberação da melanina da superfície celular, expos o micro-
organismo aos efeitos danosos do meio com alta salinidade, o qual teve seu
crescimento reduzido à medida que a concentração de NaCl foi maior. Portanto, a
melanina tem ação protetora para H. wernecki. Isto demonstra que a presença da
melanina pode ser um fator determinante para a tolerância a diferentes
concentrações de NaCl em fungos melanizados.
45
Gráfico 1- Avaliação do crescimento em diâmetro (cm) dos isolados em ágar MEA 2% com diferentes porcentagens de cloreto de sódio
46
5.2.3 Tolerância ao Potencial Hidrogeniônico
O pH dos isolados foram testados nas faixas de 4 a 9 variando de 1,0. Em
todas as faixas de pH houve crescimento dos isolados, com exceção apenas de 2,
em pH 9,0. Portanto, para todos os demais, o pH não foi um fator inibidor de
crescimento mesmo considerando os extremos, faixas 4,0 e 9,0, uma vez que não
et al., 2001, POTIN; VEIGNIE; RAFIN, 2004, ZHAO et al., 2010). Conforme Nikolova;
Nenov (2005) em estudo sobre degradação de BTEX por Cladosporium sp. e
Cladophialophora sp., verificou-se que estes micro-organismos foram capazes de
degradar, total ou parcialmente, etilbenzeno, tolueno e os isômeros de tolueno, no
entanto nenhuma linhagem foi capaz de degradar o benzeno.
Ameen et al. (2016) isolaram de manguesais do Mar vermelho na Arábia
Saudita, fungos com capacidade de degradar óleo diesel. Obtiveram, dentre outros,
fungos dos gêneros Exophiala e Cladosporium. Cladosporium apresentou valor de
massa seca, em presença de óleo diesel, superior ao de Exophiala. De acordo com
Weber; Hage e Bont (1995) citam que o micro-organismo Cladosporium
sphaerospermum foi o primeiro eucarioto descrito a crescer na presença de tolueno
como única fonte de carbono.
Zhao et al. (2010) isolaram 66 linhagens de leveduras negras a partir de
solo rico em guano, madeira tratada com creosoto e de bagas de frutas silvestres,
submeteram as amostras à atmosfera gasosa de hidrocarbonetos (benzeno,
tolueno, xileno e naftaleno). Eles consideraram o crescimento de leveduras negras
sob estas condições, como assimiladoras de hidrocarbonetos. E ainda, que a
levedura E. dermatitidis, é raramente isolada de fontes ambientais, no entanto,
quando isoladas destas fontes, frequentemente aparece associada a locais poluídos
como foi isolada de madeira poluída por creosoto e óleo de origem petrolífera.
59
Seyedmousavi et al., (2014) verificaram a baixa incidência de E. dermatitidis
oriundos de fontes ambientais em locais de clima temperado, sugerindo que essa
espécie é de origem tropical.
5.3 Identificação Molecular e Filogenia
Os isolados que apresentaram maior massa seca em todos os ensaios com
hidrocarbonetos foram identificados geneticamente pela amplificação da região ITS.
Após alinhamento e submissão das sequências consenso no NCBI, foi possível
identificar dois gêneros de fungos melanizados, Cladosporium (família
Cladosporiaceae) e Exophiala (família Herpotrichiellaceae). Sendo: duas linhagens
de Cladosporium sp., duas de Cladosporium halotolerans, uma de Exophiala sp. e
uma de Exophiala dermatitidis. Os fungos do gênero Exophiala são os principais
representantes das leveduras negras, grupo esse, que vem se destacando suas
características oligotróficas, bem como a degradação de hidrocarbonetos BTEX
(PRENAFETA-BOLDÚ 2002; REVANKAR; SUTTON, 2010; GONÇALVES et al.,
2016).
O resultado da identificação e a posição filogenética das linhagens foi
evidenciado pela formação da árvore filogenética desenvolvida pelo método Tamura-
Nei (1993). Para elaboração da árvore filogenética foram utilizados os seis isolados
selecionados e identificados, e sequências disponíveis no Genbank com similaridade
genética (Figura 2).
60
Figura 2 – Análise filogenética de seis linhagens identificadas de Cladosporium e Exophiala pelo método de máxima semelhança
Legenda= Árvore filogenética elaborada pelo método Tamura-Nei (1993) utilizando os seis isolados selecionados e identificados pela região ITS e linhagens com similaridade genética.
61
Os primers V9G e LS266, considerados estringentes para o grupo de fungos
melanizados, mostrou-se eficiente, fornecendo qualidade para a amplificação dos
isolados, que apresentaram sequências com tamanhos entre 839-938 pares e
bases, e atingindo 100% de identidade com Cladosporium halotolerans para o
isolado C1. Os demais dados de similaridade genética podem ser observados na
Tabela 10. Corroboram aos estudos de Figel et al. (2013), que utilizaram os mesmos
primers para a identificação de fungos melanizados.
Os fungos são ubiquitários por natureza. Adaptam-se aos mais diversos e
inóspitos ambientes. Fungos melanizados ainda apresentam características
especiais não só morfológicas, mas também fisiológicas, tais como, a presença de
melanina e a produção de compostos bioativos (GONÇALVES et al., 2016) isto
torna-os potenciais candidados à bioprospecção visando à biorremediação
ambiental. Mas normalmente requerem métodos seletivos para isolamento, tais
como flotação em óleo mineral (VICENTE, et al., 2008) erriquecimento com
hidrocarbonetos aromáticos entre outros (ZHAO, et al., 2010; BADALI, et al., 2010).
A tolerância ao estress devido às condições adversas pode estar associada à
presença de melanina (BADALI, et al., 2010)
As linhagens aqui identificadas apresentaram habilidade de sobreviver e
crescer em condições adversas de temperatura, salinidade e pH. Em adição,
também apresentaram capacidade de emulsificação e potencial de degradação de
hidrocarbonetos BTX. Esses dois gêneros, tem espécies que são patogênicas, mas
os isolados de ambiente que apresentam características fisiológicas similares a
isolados clínicos tem, em geral, virulência reduzida (ZHAO et al., 2010).
As seis linhagens identificados por análise molecular serão encaminhadas
para fazer parte da coleção de culturas microbianas do Laboratório de Microbiologia
(LABMICRO) do Departamento de Patologia Básica do Setor de Ciências Biológicas
da Universidade Federal do Paraná, para integrar-se ao Centro de Coleções de
Culturas Biológicas (CCB-UFPR)4. Como parte da parceria de pesquisa do
Programa de Ciência e Biotecnologia com o Programa de Pós em Microbiologia,
Parasitologia e Imunologia da UFPR, setor de Ciências Biológicas.
Tabela 9 – Linhagens fúngicas utilizadas na construção da árvore filogenética, composta por isolados identificados nesse estudo e com similaridade genética
Exophiala dermatitidis CL ---- ---- Legenda:1= Número de acesso registrado no Genbank; 2=Identidade obtida no genbank a partir das sequências consenso dos isolados fúngicos.
63
6 CONCLUSÃO
Na perspectiva de avaliação do potencial biotecnológico, nesta pesquisa foi
possível analisar qualitativa e quantitativamente algumas das principais
características fisiológicas de fungos melanizados obtidos de amostras
contaminadas por hidrocarbonetos.
Entre as duas metodologias de isolamento dos fungos melanizados, por
flotação em óleo mineral e por inóculo direto em ágar, a primeira mostrou-se mais
eficiente, pois resultou em um maior número de isolados.
A maioria dos isolados apresentou caráter hidrofóbico. Como a maior parte
foi obtida a partir de materiais de uso e circulação contínua nos ambientes
pesquisados, provavelmente esse caráter hidrofóbico seja um fator facilitador da
dispersão de esporos no ambiente.
A avaliação de cada isolado de fungo melanizado nos ensaios sob diferentes
condições de temperatura, pH, NaCl, evidenciou que entre esses parâmetros, a
temperatura é uma condição crítica para crescimento, sendo 25ºC a temperatura
ótima para a maioria dos isolados.
A atividade de lacase foi detectada em condições padronizadas de cultivo.
Mas, para alguns dos isolados a não expressão dessa atividade pode ter sido devido
a essas mesmas condições, em termos quantitativos e/ou qualitativos (substrato,
temperatura, pH, etc.).
Os isolados suportaram crescimento na presença de BTX, gasolina e óleo
diesel como única fonte de carbono. Os que apresentaram maior capacidade de
degradação de hidrocarbonetos foram identificados como pertencentes às
espécies Cladosporium halotolerans, Cladosporium sp., Exophiala sp., e E.
dermatitidis. Entre os hidrocarbonetos BTX, o tolueno tem melhores resultados para
os fungos em relação a massa seca resultante.
A capacidade de emulsificação (E24) apresentada pelos isolados ficou
abaixo de 65%, resultados próximos ou acima desse valor conferem uma
característica favorável quando se busca por micro-organismos biorremediadores.
Contudo, mais experimentos deverão ser realizados para confirmar a real
importância das linhagens selecionadas como assimiladoras de hidrocarbonetos,
face ao potencial aqui demonstrado sob outros aspectos.
64
A bioprospecção de micro-organismos com potencial em biorremediação
permite avaliar melhor as características morfo-fisiológicas e genéticas. Neste
sentido, a obtenção de representantes de dois gêneros de fungos melanizados nas
condições já expostas, reforçam ainda mais o caráter ubiquitário desses fungos,
presentes mesmo em ambientes inóspitos e improváveis de sobrevivência.
65
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APÊNDICES
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APÊNDICE 1– Meios de Cultura e Soluções
Meiosde Cultura
Sabouraud
Peptona de caseína 5g
Peptona de carne 5g
Dextrose 40g
Ágar bacteriológico 15g
Água destilada 1000mL
Esterilizado a 121°C por 15 minutos
Mycosel
Peptona de soja 10g
Extrato de levedura 10g
Glicose 10g
Ágar 15g
Água destilada 1000mL
Antibióticos Cloranfenicol 0,4g
Ciclo hexemide 0,05g
Esterilizado a 121°C por 15 minutos
MEA 2%
Extrato de malte 20g
Ágar 10g
Água destilada 1000mL
Esterilizado a 121°C por 15 minutos
MEA 2% com ABTS
Extrato de malte 20g
Ágar 10g
ABTS 1g
Água destilada 1000mL
Esterilizado a 121°C por 15 minutos
Caldo MEA2%
Extrato de malte 20g
Água destilada 1000mL
Esterilizado a 121°C por 15 minutos
Meio Mineral
NaCl 5g
K2HPO4 1g
(NH4)SO4 1g
MgSO4.7 H2O 0,2g
KNO3 3g
Água destilada 1000mL
Esterilizado a 121°C por 15 minutos
Meio Mineral Glicosado
NaCl 5g
K2HPO4 1g
(NH4)SO4 1g
MgSO4.7 H2O 0,2g
KNO3 3g
Glicose 30g
Água destilada 1000mL Esterilizado a 121°C por 15 minutos
Soluções
Lactofenol sem azul de algodão
Fenol 20g
Glicerol 40mL
Ácido lático 20mL
Água destilada 20mL
Tampão TBE 10X
Tris Base 108g
Ácido Bórico 55g
EDTA 0,5M pH8 40mL Água Deionizada 1L
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APÊNDICE 2 – Tabela com os valores de crescimento (cm) dos isolados de fungos melanizados em ágar MEA 2% sob as diferentes condições de crescimento