SANDY VIVIANNE RUBIO ROMAN GUASAVE, SINALOA; MEXICO DICIEMBRE DEL 2017 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA Potencial biotecnológico de hidrolizados proteicos de semillas de frijol y análisis in silico de la familia de genes de faseolina, su principal proteína de reserva TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE PRESENTA
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SANDY VIVIANNE RUBIO ROMAN
GUASAVE, SINALOA; MEXICO DICIEMBRE DEL 2017
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN
PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA
Potencial biotecnológico de
hidrolizados proteicos de semillas de
frijol y análisis in silico de la familia
de genes de faseolina, su principal
proteína de reserva
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN
RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Biotecnología Agrícola en el
Laboratorio de Interacción Microorganismo-Planta del Centro Interdisciplinario de
Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad Sinaloa del
Instituto Politécnico Nacional (IPN), bajo la dirección de la Dra. Melina López Meyer y
del Dr. José Luis Acosta Rodríguez. El autor Sandy Vivianne Rubio Roman
agradece el apoyo otorgado por el IPN a través del programa de becas
institucionales y del programa BEIFI, así como a CONACYT por el apoyo económico
otorgado durante la realización de los estudios de Maestría.
AGRADECIMIENTOS
A mis directores de tesis: Dra. Melina López Meyer y Dr. José Luis Acosta
Rodríguez, por la paciencia y apoyo. Dra. Meli le agradezco todo su tiempo
dedicado a mí, su paciencia y sus palabras de aliento cuando me miraba
preocupada. No pude llegar a un mejor lugar, le admiro en lo académico y sobre todo
por su calidad humana.
A mi comité tutorial: Dra. Guadalupe Arlene Mora Romero, Dr. Sergio Medina
Godoy y Dr. Juan Pablo Apún Molina, por todas las aportaciones para el desarrollo
del presente trabajo.
Muchas gracias a usted Dr. Ignacio Eduardo Maldonado Mendoza, por su sincero
interés y tiempo dedicado en la presente tesis.
Al gran equipo que somos en el Lab. IMP, gracias por su valiosa ayuda en todos mis
experimentos, por esos cafés en las mañanas y escucharme cantar todos los días.
A mi familia, Mamá y Papá lo más valioso que tengo, gracias por siempre creer en
mí, por apoyarme en todo, por llorar y reír conmigo.
A mi compañero de Laboratorio los fines de semana Adrián SL, gracias por tú
paciencia, por siempre darme ánimos y por tu genuino interés en tratar de entender
mis experimentos.
Andreyna, Yoldia, Carolina, Paul y Alan me quedo con su amistad, muchas gracias
por todo de corazón. Compartimos tantos momentos de risa-sufre, siempre ideando
una nueva forma de acabar con el estrés, que si por las escaleras o del invernadero.
Nada hubiera sido lo mismo sin cada uno de ustedes, gracias por aparecer en mi
vida.
I
ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 1
II. ANTECEDENTES ......................................................................................................................... 3
2.1 Panorama actual y producción de frijol en México ........................................................... 3
FIM 227 RAELF---------------------------------------------- 231
Figura 2. Alineamiento de las secuencias polipeptídicas deducidas de los cDNAs de α y β faseolina con FIM. En rojo se muestra la región de homología de los genes α y β faseolina con FIM.
7.1.2 Diseño y pruebas de amplificación de los oligonucleótidos diseñados
Una vez identificado el gen de FIM se diseñaron oligonucleótidos específicos
para los genes α y β faseolina con el fin de confirmar la expresión de la β faseolina
en hojas de plantas de frijol micorrizadas. La ubicación de cada uno de los
oligonucleótidos diseñados se muestra en la Figura 3.
19
Figura 3. Gen de faseolina y ubicación de los oligonucleótidos específicos para el gen α (A1) y el β (B1, B2 y B3); entre paréntesis se indica el tamaño del fragmento amplificado esperado para cada par de oligos. Los bloques de colores representan los exones y las líneas azules los intrones. Las flechas rojas indican el inicio (izquierda) y final (derecha) de la traducción. Los números debajo de las barras indican la posición de las bases en donde inician y terminan los intrones y exones.
Primeramente, cada par de oligonucleótidos fue probado en reacciones de PCR en
punto final utilizando una muestra de DNA genómico de la variedad Azufrado
Regional 87 como control positivo con la finalidad de corroborar la obtención de un
amplicón del tamaño esperado.
En la Figura 4 se presenta la electroforesis en gel de los amplicones obtenidos para
los oligonucleótidos β1F/ β1R, β2F/ β2R, β3F/ β3R para el gen de la β faseolina, y
α1F/ α1R para el gen de la α faseolina; además se probó el par β3F/β1R (Figura 3).
Los oligonucleótidos probados amplificaron de manera apropiada el producto
esperado en el control de DNA, en el Cuadro 2 se presentan los tamaños esperados
de los amplicones obtenidos.
Figura 4. Análisis electroforético de productos de PCR punto final de ADN genómico de plantas de frijol. PCR utilizando los juegos de oligonucleótidos: 1) β1F/ β1R, 2) β2F/ β2R, 3) β3F/ β3R, 4) α1F/ α1R; y 5) β3F/β1R. M: Marcador de peso molecular (1Kb Plus, Invitrogen, Cat. 15628-019).
20
Cuadro 2. Tamaños esperados de los amplicones con los oligonucleótidos específicos para α y β faseolina.
7.1.3 Análisis de la expresión del gen de faseolina por PCR en punto final en
plantas de frijol Azufrado Regional 87 y Azufrado Higuera
Una vez corroborada la efectividad de los oligonucleótidos, se decidió probarlos en
cDNA obtenidos de hojas MIC (de plantas micorrizadas) y NO MIC (de plantas no
micorrizadas) de las variedades Azufrado Regional 87 y Azufrado Higuera. Este
tejido fue colectado a las seis semanas posteriores de la inoculación del HMA.
Inesperadamente, no se detectó ningún fragmento de amplificación para ninguno de
los pares de oligonucleótidos probados (β1F/ β1R, β2F/ β2R, β3F/ β3R, α1F/ α1R,
β3F/ β1R) (datos no mostrados).
Para explorar la posibilidad de que el gen pudiera estar siendo expresado en otro
tejido y la proteína transportada y acumulada en hoja, se obtuvo cDNA de raíces de
plantas MIC y NO MIC y se llevó a cabo PCR con los oligos específicos para los
genes α y β faseolina. Se probaron las variedades Azufrado Higuera y Azufrado
Regional 87. En ninguno de los casos se obtuvo amplificación (β1F/ β1R, β2F/ β2R,
β3F/ β3R, α1F/ α1R, β3F/ β1R) (datos no mostrados).
21
7.1.4 Análisis de la expresión del gen de faseolina por PCR en punto final en
cotiledones de semillas de frijol
A pesar de que los oligonucleótidos ya habían sido probados exitosamente en DNA
genómico, se decidió obtener RNA de cotiledones de semillas germinadas, en donde
se ha reportado una alta expresión de la faseolina a nivel de RNA (Burow-Mark,
1992).
Se obtuvo RNA de cotiledones de semillas cinco días posteriores a la germinación, y
a partir de este se sintetizó el cDNA, mismo que fue utilizado como templado en una
reacción de PCR utilizando oligonucleótidos específicos para β-faseolina. En la
Figura 5 se muestra la electroforesis en gel de los amplicones obtenidos. Los
oligonucleótidos probados amplificaron de manera apropiada el producto esperado
en cDNA de cotiledones, corroborando de esta manera la expresión del gen β-
faseolina en semillas germinadas, y confirmando que la metodología y los
oligonucelótidos utilizados eran adecuados.
Figura 5. Análisis electroforético de productos de PCR en punto final utilizando como templado cDNA de cotiledones de frijol var. Reg 87 (carriles 1 a 4), y DNA genómico de frijol Azufrado Regional 87 (carril 5). Se utilizaron los oligonucleótidos β1F/ β1R (carril 1); β2F/ β2R (carril 2); β3F/ β3R (carril 3), β3F/β1R (carril 4 y 5).
22
7.1.5 Análisis de la expresión del gen de faseolina por PCR en punto final en
plantas de frijol Azufrado Regional 87
En este ensayo se trabajó con tejido de Azufrado Regional 87 colectado cuatro
semanas posteriores a la inoculación del HMA R. irregularis. Se obtuvo el cDNA de
hojas de plantas MIC y NO MIC y se utilizó como templado en una reacción de PCR
utilizando el juego de oligonucleótidos específicos para β-faseolina. De los tres
juegos de oligonucleótidos probados (β1F/ β1R, β2F/ β2R y β3F/ β3R) únicamente el
juego β3F/ β3R amplificó de manera apropiada el producto esperado (Figura 6c).
Cada juego de oligonucleótidos fue diseñado en una región distinta del gen β-
faseolina. De manera adicional, se probó el par de oligonucleótidos β3F/β1R, cuyo
amplicón esperado era de 728 pb (ver Figura 3). También se probaron los
oligonucleótidos específicos para el gen α-faseolina, sin embargo, este gen tampoco
presentó amplificación. En la Figura 7 se muestran los amplicones obtenidos con
este juego de oligonucleótidos en cDNA de cotiledón y de DNA genómico, sin
embargo, no se observaron productos de PCR en las muestras de hojas.
23
Figura 6. Análisis electroforético de productos de PCR punto final utilizando como templado cDNA de hojas de frijol var. Azufrado Regional 87. a) β1F/ β1R, b) β2F/ β2R, c) β3F/ β3R y d) Factor de Elongación (EF 1α). MIC (carril 1); Hoja de planta NO MIC (carril 2); Cotiledón de frijol Azufrado Regional 87 (carril 3); ADN genómico de frijol Azufrado Regional 87 (carril 4).
M 1 2 3 4 a)
b)
c)
d)
24
Figura 7. Análisis electroforético de productos de PCR punto final utilizando como templado cDNA de hojas de frijol var. Reg 87. Carriles de 1 al 4 (αF/αR), carriles del 5 al 8 (β3F/ β1R). Carril 1 y 5, cDNA de hojas de plantas MIC; Carril 2 y 6, cDNA de hojas de plantas NO MIC; Carril 3 y 7, cDNA de cotiledón; Carril 4 y 8, DNA genómico.
7.1.6 Experimentos de confirmación de la amplificación con los oligonucleótidos
degenerados
Con el objetivo de corroborar la amplificación de la faseolina inducida por
micorrización (FIM) a partir de cDNA de hojas de plantas de frijol micorrizado, se
llevó a cabo un PCR con los oligonucleótidos degenerados originalmente utilizados
en un trabajo preliminar (Phas1 Forward: GGC TGA TGC TGA GTT ACT CCT;
Phas2 Reverse; CCN AMG CTG CTN AMG ACA TT). Para ésto, se llevó a cabo un
gradiente de temperatura de 30 a 54°C. Como se muestra en la Figura 8, en las
temperaturas de 32.7 y 35.9°C se observó una banda de amplificación, sin embargo,
dicho fragmento no corresponde a la banda esperada de 837 bp.
M 1 2 3 4 5 6 7 8
25
Figura 8. Análisis electroforético de productos de PCR punto final en gradiente de temperatura utilizando como templado cDNA de hojas de plantas MIC de frijol var. Azufrado Regional 87. Con el oligonucleótido específico Phas1 Forward y el degenerado Phas2 Reverse.
La expresión del gen β-faseolina ha sido estudiada en detalle y se conoce que
sucede muy específicamente en tejido embrionario en frijol (Li et al., 1999; 2001). Sin
embargo, se ha reportado también que el promotor de la β-faseolina puede activarse
en tejidos vegetativos expuestos a la fitohormona ABA siempre y cuando el factor de
transcripción ABI3 (PvAlf en frijol) esté siendo expresado (Li et al., 1999; Ng et al.,
2006).
Con base en esta información, se planteó el siguiente modelo: la condición de
micorrización podría estar causando un aumento en la concentración de ABA en los
tejidos de las plantas micorrizadas, así como un aumento en la expresión de PvAlf,
de tal manera que la β-faseolina se exprese en tejidos vegetativos como hoja.
Plantas no micorrizadas no estarían expresando PvAlf, por lo tanto, serían incapaces
de responder a un aumento en ABA y no expresarían el gen de la faseolina.
Para probar este modelo, cDNA proveniente de hojas de plantas MIC y NO MIC
fueron utilizado como DNA molde en reacciones de PCR con los oligonucleótidos
PvAlfFor/PvAlfREv. De igual manera, hojas de plantas MIC y NO MIC fueron
asperjadas con ABA (200 µM) y mantenidas por 24 h, para después congelarse en
nitrógeno líquido y procesarse. Sin embargo, en ninguno de los casos (hojas de
plantas MIC y NO MIC, tratadas con y sin ABA, fue detectada la expresión ni de
PvAlf, ni de β-faseolina (datos no mostrados).
oC
26
7.2 Experimento 1. Aplicación de hidrolizados de proteína de frijol
La sospecha de que la proteína β-faseolina u oligopéptidos derivados de su hidrólisis
pudieran estar participando en la inducción de defensa observada en hojas de
plantas micorrizadas contra patógenos foliares llevó a la idea de probar de manera
exógena la adición de hidrolizados de esta proteína a hojas de plantas de frijol, y con
esto, la inducción de defensa.
Para esto se diseñó un primer ensayo de infección de S. sclerotiorum en plantas de
frijol de tres variedades (Azufrado Higuera, Azufrado Regional 87 y Azufrasin),
micorrizadas y no micorrizadas. A las seis semanas post-inoculación de las plantas
de frijol con el HMA R. irregularis, se les aplicó HID-1 (proteína hidrolizada de
semilla de frijol Azufrado Higuera), teniendo un control para cada variedad
micorrizada y no micorrizada con H2O destilada.
7.2.1 Porcentaje de colonización
En el Cuadro 3 se presentan los porcentajes de colonización de las plantas
colonizadas con R. irregularis y utilizadas en el ensayo de infección con S.
sclerotiorum en donde se observa que los porcentajes de colonización fueron muy
similares para las tres variedades de frijol.
Cuadro 3. Porcentaje de colonización micorrízica de tres variedades de frijol empleadas para el ensayo de infección en hoja desprendida. El inóculo consistió en 500 esporas y 100 mg de raíces transformadas de zanahoria colonizadas con R. irregularis por planta.
Tratamiento Colonización (%) DS*
Azufrado Higuera/ HID-1 43.33 9.60
Azufrasin/ HID-1 39.33 16.00
Azufrado Regional 87/ HID-1 43.66 1.52
Azufrado Higuera/ Control 42.00 9.53
Azufrasin/ Control 39.00 2.64
Azufrado Regional 87/ Control 44.33 12.09
*Desviación estándar
27
7.2.2 Peso fresco de raíces y parte aérea
En ninguna de las variedades de frijol estudiadas, se observó efecto de la
micorrización en el crecimiento, ya que cada una de las plantas tuvo un crecimiento
similar en las plantas MIC y NO MIC, tanto en raíces como en tejido aéreo (Figura
9).
a)
b)
Figura 9. Peso fresco (g) de parte aérea y de raíces de plantas en ensayo de hojas desprendidas a) Peso fresco (g) de parte aérea, b) Peso fresco (g) de raíces. Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.
a a
b
a a
b
0
2
4
6
8
10
12
14
a
ab
bc
ab
ab
c
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Az. Higuera Azufrasin Az. Regional
NO MIC
MIC
Pe
so f
resco (
g)
28
7.2.3 Ensayo de infección con S. sclerotiorum en hoja desprendida de plantas MIC y
NO MIC
Las plantas MIC y NO MIC (control, sin hidrolizados) fueron utilizadas en un ensayo
de infección con S. sclerotiorum en hojas desprendidas. La Figura 10 muestra las
lesiones ocasionadas por S. sclerotiorum a 36 horas post- inoculación con el
patógeno. En este experimento se observó que la micorrización indujo tolerancia en
la variedad Azufrado Higuera y Azufrasin con respecto al control no micorrizado. Sin
embargo en la variedad Azufrado Regional 87 no se observó este efecto de manera
significativa, aunque sí se pudo observar una tendencia.
Figura 10. Diámetros de lesión 36 horas posteriores de inoculación con S. sclerotiorum en plantas de frijol micorrizadas (MIC) y no micorrizadas (No MIC) de las variedades a) Azufrado Higuera, b) Azufrasin y c) Azufrado Regional 87. Los tratamientos representados por barras, con la misma letra, no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.
Diá
me
tro d
e le
sió
n (
mm
)
29
7.2.4 Ensayo de infección con S. sclerotiorum en hoja desprendida de plantas MIC
y NO MIC tratadas con hidrolizados de semillas de frijol
Se aplicaron hidrolizados provenientes de semillas de frijol variedad Azufrado
Higuera. Los resultados se muestran en la Figura 11. El efecto del tratamiento con el
hidrolizado proteico dependió de la variedad a la que fue aplicado. Para Azufrado
Higuera, el tratamiento causó una menor área de lesión en hojas de plantas NO MIC,
pero no se observaron diferencias en las plantas MIC. En contraste, las hojas de las
variedades Azufrasin y Azufrado Regional 87 MIC respondieron al tratamiento con
los hidrolizados mostrando una menor área de lesión, pero no las NO MIC.
30
Figura 11 . Diámetros de infección 36 horas posteriores a la inoculación con S. sclerotiorum en hojas de plantas de frijol micorrizadas (MIC, barras verdes), no micorrizadas (NO MIC, barras amarillas), con hidrolizado aplicado (HID-1) y tratamientos control sin hidrolizado (Control) de las variedades a) Azufrado Higuera, b) Azufrasin y c) Azufrado Regional 87. Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.
a
c
ab b
0
2
4
6
8
10 Azufrado Higuera
a a a
b
0
2
4
6
8Azufrasin
NO MIC
MIC
a a
a
b
0
1
2
3
4
5
6
Control HID-1
Azufrado Regional 87
a)
c)
b)
Diá
me
tro d
e le
sió
n (
mm
)
31
Figura 122. Diámetros de infección 36 horas posteriores a la inoculación con S. sclerotiorum en plantas de frijol micorrizadas (MIC), no micorrizadas (NO MIC) con tratamiento de hidrolizado (barras rojas) y tratamientos control (agua) (barras azules) de las variedades Azufrado Higuera, Azufrasin y Azufrado Regional 87. Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.
7.3 Experimento 2. Aplicación de hidrolizados de proteína de frijol
En el Experimento 1, los porcentajes de colonización en las plantas de las tres
variedades de frijol fueron relativamente altos, sin embargo no se logró observar una
clara respuesta a la micorrización en el ensayo de infección de Azufrado Regional
87. Esta variedad ha sido ampliamente estudiada en nuestro grupo de trabajo y está
comprobado que la micorrización es capaz de inducir defensa. El Experimento 1 se
llevó a cabo a las seis semanas de colonización, a este tiempo, las plantas de frijol
ya están en plena floración. Con el objetivo de descartar la posibilidad de que en esta
etapa fenológica la respuesta de inducción de defensa por micorrización ya no se
a
abc
bcd
ab
bcd
d
e
dc
d
bcd
e
e
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Az, Higuera Azufrasin Az. Regional87
Az, Higuera Azufrasin Az. Regional87
Dia
me
tro d
e la lesió
n (
mm
)
Control
HID-1
NO MIC
36 horas posteriores a la inoculación de S. sclerotiorum
MIC
32
observe, se decidió repetir el ensayo de colonización pero en esta ocasión, el ensayo
de infección con S. sclerotiorum en hoja desprendida se llevó a cabo a las cuatro
semanas de colonización, de manera similar a como ha sido llevado a cabo en
trabajos previos (Mora-Romero, 2008; 2015). Este ensayo se realizó con plantas de
frijol Azufrado Regional 87 MIC y NO MIC. En este Experimento 2 se probaron
hidrolizados de semillas de dos variedades de frijol diferentes, Azufrado Higuera
(HID-1) y el de frijol Azufrado Regional 87 (HID-2), mismos que fueron aplicados a
las cuatro semanas de colonización micorrízica. Las plantas control fueron tratadas
con agua.
7.3.1 Porcentaje de colonización
El Cuadro 4 presentan los porcentajes de colonización de plantas colonizadas con
R. irregularis y utilizadas en el Experimento 2 de aplicación de hidrolizados de
proteína de frijol.
Cuadro 4. Porcentaje de colonización en plantas de frijol empleadas para el Experimento 2 de infección en hoja desprendida. El inóculo micorrízico consistió en 500 esporas de R. irregularis.
Tratamiento Colonización (%) DS*
Control 6.34 3.18
HID-1 5.26 3.05
HID-2 1.67 0.48
*Desviación estándar
33
7.3.2 Peso fresco de raíces y parte aérea
En las plantas utilizadas en este ensayo no se detectaron diferencias significativas en
el peso fresco de parte aérea o raíces de las plantas MIC y NO MIC de la variedad
Azufrado Regional 87 en los tres tratamientos (Figura 13).
Figura 13. Peso fresco (g) de parte aérea y de raíces de las plantas utilizadas en el ensayo de hojas desprendidas a) Parte aérea (hojas y tallos), b) Raíces. Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.
7.3.3 Ensayo de infección con S. sclerotiorum en hoja desprendida de plantas MIC
y NO MIC
La Figura 14 muestra el curso temporal del desarrollo de las lesiones ocasionadas
por S. sclerotiorum en la variedad de frijol Azufrado Regional 87 MIC y NO MIC sin la
adición de hidrolizado alguno. En este experimento se observó que la micorrización a
partir de la inoculación con 500 esporas de R. irregularis induce tolerancia con
respecto al control NO MIC a las cuatro semanas posteriores de la inoculación del
HMA.
a a
0
1
2
3
4
5
6
7 a
a
0
1
2
3
4
5
6
7
NO MIC
MIC
Pe
so f
resco (
g)
a) b)
34
Figura 14. Cinética de desarrollo de las lesiones en hojas de plantas de frijol Azufrado Regional 87 micorrizadas (MIC) y no micorrizadas (NO MIC) (sin adición de hidrolizado). Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.
7.3.4 Ensayo de infección con S. sclerotiorum en hoja desprendida de plantas MIC
y NO MIC tratadas con hidrolizados de semillas de frijol
En este experimento, el hidrolizado HID-1 (obtenido de semilla de Azufrado Higuera)
tuvo efecto en las plantas de Regional 87 NO MIC induciendo una defensa
equivalente a la observada en las plantas las micorrizadas. Por su parte el
hidrolizado HID-2 (obtenido de semillas de Azufrado Regional 87) mostró inducción
de protección en ambas condiciones, MIC y NO MIC, pero de manera más intensa
con respecto a HID-1 (Figura 15).
a
a
a a
a
a
b b
0
5
10
15
20
25
30
35
24horas 36horas 48horas 52horas
Diá
me
tro d
e le
sió
n (
mm
)
NO MIC
MIC
35
Figura 15. Diámetros de lesión a las 48 horas posteriores a la inoculación con S. sclerotiorum en hojas de plantas de frijol MIC y No MIC sin hidrolizado, así como MIC y NO MIC con los hidrolizados HID-1 (de semilla de frijol Azufrado Higuera) y HID-2 (de semilla de frijol Azufrado Regional 87). Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.
a
b
c
b b
c
0
5
10
15
20
25
30
Control HID-1 HID-2
NO MIC
MIC
36
VIII. DISCUSION
La comparación de la secuencia aminoacídica de faseolina del PDB (Protein
Database Data Bank) con el genoma de frijol disponible en el GeneBank (NCBI)
arrojó la existencia de tres secuencias homólogas principales. Dos de las secuencias
homólogas principales correspondieron a los genes previamente descritos como α y
β faseolina (Slightom et al., 1983; 1985). La tercera secuencia, aunque presenta
regiones homólogas, no tiene la estructura típica de los otros dos genes de
faseolinas. Las faseolinas poseen dos sitios de glicosilación y eso hace que puedan
tener mucha diversidad a nivel postraduccional, y también a nivel de funcionalidad.
Además, hay evidencia que sugiere que las faseolina pueden estar también
reguladas por proteólisis dando como resultado fragmentos polipeptídicos
posiblemente funcionales (Li et al., 1999). Es por esto que, a nivel de proteínas, la
familia de las faseolinas pareciera estar formada por alrededor de 6 a 10 miembros.
Sin embargo, el análisis in silico aquí presentado indica que son únicamente dos
genes de faseolina en el genoma del frijol. Toda la diversidad adicional observada a
nivel de proteína se deriva de modificaciones postraducccionales de los transcritos
expresados en estos dos genes.
De manera interesante, el análisis in silico, arrojó que ninguno de los parálogos
identificados correspondió al último exón de los genes de las faseolinas, mismos que
ya habían sido identificados mediante la clonación de los genes y sus
correspondientes cDNAs (Slightom et al., 1983; 1985). En la versión del genoma
actualmente liberado, en la secuencia que correspondería al último exón, aparecen
regiones de varias decenas de “Ns”. Es posible que estas correspondan a una región
del genoma con una estructura que represente dificultades para su secuenciación.
Versiones posteriores mejoradas del genoma de frijol posiblemente resuelvan estas
incosistencias.
Una vez corroborada la identidad de la FIM como una β-faseolina, se procedió a
tratar de detectar y cuantificar el gen a nivel de transcripción en tejido foliar de
plantas micorrizadas.
37
Las faseolinas son acumuladas a nivel de transcrito y de proteína en los embriones
de frijol (Sun et al., 1981), sin embargo, su acumulación en hoja u otros tejidos
vegetativos no se ha reportado en esta especie. La faseolina de frijol, sin embargo,
ha podido ser expresada a nivel de transcrito y de proteína en plantas transformadas
de tabaco en donde el gen de la β-faseolina fue clonado bajo la regulación del
promotor constitutivo 35SCaMV (Li et al., 1999). De manera interesante, en dicho
trabajo se observó que aunque el nivel de transcrito en hojas, tallos, y nódulos era
muy abundante, la acumulación de proteína era mucho menor en estos tejidos que
en embriones.
También, ha sido reportado que el promotor de la β-faseolina está regulado por la
acción conjunta entre un factor de transcripción denominado PvAlf en frijol (o ABI3 en
Arabidopsis) y la fitohormona ABA. A esta conclusión se llegó ya que la adición de
ABA solo fue capaz de inducir la transcripción del gen en plantas que expresaban
ectópicamente el gen PvAlf (Ng et al., 2006). Por lo tanto, la detección en tejido foliar
de una faseolina inducida por micorrización resulta relevante.
Desafortunadamente, en este trabajo no se pudieron replicar los resultados
preliminares obtenidos previamente en los cuales se identificó a una proteína tipo
faseolina en hojas de plantas micorrizadas. Con el objetivo detectar el gen de la
faseolina supuestamente inducida por micorrización, se usó cDNA extraído de hojas
de plantas micorrizadas de frijol, y utilizando los oligos degenerados (Phas1Forward
y Phas2Reverse) se llevaron a cabo PCRs bajo un gradiente de temperaturas de 30
a 54 °C para la temperatura de hibridización (Figura 8). Sin embargo, y en contraste
a lo observado en experimentos preliminares, solo se logró detectar una banda en
las reacciones con temperatura de anillamiento de 32.7 y 35.9 °C de alrededor de
500 bp, cuando el fragmento esperado era de alrededor de 850 pb.
Se utilizaron también los oligonucleótidos específicos tanto para β-faseolina como
para α-faseolina. En este caso, solamente el fragmento de 124 pb obtenido con los
oligos B3F/B3R fue amplificado; sin embargo, este producto era amplificado tanto en
cDNA de hojas plantas micorrizadas como no micorrizadas. Se tiene la certeza que
los oligonucelótidos son capaces de amplificar el fragmento esperado ya que los
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controles en donde se usaba cDNA de cotiledones o DNA genómico amplificaban
productos del tamaño predicho (Figuras 4, 5).
Derivado del reporte de Ng et al. (2006), se hipotetizó que quizás la condición de
micorrización podría estar induciendo la expresión del factor de transcripción PvAlf,
pero quizás los niveles alcanzados de ABA no era suficientes para inducir la
expresión del gen de la faseolina. Entonces, se decidió hacer un experimento en el
que plantas no micorrizadas y micorrizadas fueron tratadas con ABA por 24 h. Este
tejido fue utilizado para aislar RNA y sintetizar cDNA, con el cual se hicieron PCRs
con los genes específicos de faseolinas y también de PvAlf. Desafortunadamente, en
ninguno de los casos se observó producto de amplificación (resultados no
mostrados).
Una posible explicación a estos resultados negativos puede deberse al hecho de que
los niveles de micorrización de las plantas de frijol eran bajos. Sin embargo,
decidimos utilizar este material vegetal ya que sí se observó la inducción de defensa
por micorrización. Por lo tanto, y a manera de explicación alternativa, quizás, la
expresión de la faseolina pueda estar asociada a un nivel alto de micorrización y a
una etapa fisiológica también definida. Sin duda, se necesitan análisis adicionales
para tratar de corroborar los resultados observados con anterioridad. Por otro lado,
los logros alcanzados en el análisis in silico de este trabajo permiten conocer con
mayor detalle la estructura de los genes que codifican para la principal proteína de
reserva de frijol, la faseolina.
En este trabajo, también se exploró el potencial biotecnológico de la aplicación de
hidrolizados proteicos de semillas como potencial inductor de defensa contra S.
scleorotiorum. Primeramente se evaluó el comportamiento de diferentes variedades
ante S. sclerotiorum, comparando la respuesta de cada variedad bajo condiciones
de micorrización y no micorrización. En el ensayo preliminar se observó que las
lesiones ocasionadas por el patógeno fueron menores en Azufrado Higuera y
Azufrasin en la condición micorrízada, por su parte en la variedad Azufrado Regional
87 no se observó este mismo efecto no habiendo diferencias significativas
estadísticamente entre la condición MIC y NO MIC.
39
En estudios previos, la variedad Azufrado Regional 87 había mostrado inducción de
resistencia por micorrización (Mora-Romero et al., 2016), donde Azufrado Higuera
no mostró inducción de tolerancia por micorrización mientras que Azufrado Regional
87 sí lo mostró. En el Experimento 2 la variedad Azufrado Regional 87 presentó
inducción de tolerancia por micorrización ante S. sclerotiorum no obstante los
porcentajes de colonización del HMA fueron mucho más discretos que los obtenidos
en el bioensayo preliminar y en el Experimento 1, siendo 6.43% y 44.33%,
respectivamente.
No existe a la fecha información que sustente si la bioprotección sistémica contra S.
sclerotiorum dependa del grado de colonización con hongos micorrízicos
arbusculares, o si es suficiente un porcentaje mínimo de colonización para encender
el mecanismo de bioprotección (Mora-Romero, 2008), aunque estos resultados
sugieren que es el caso.
Los resultados obtenidos pudieran explicarse tomando en cuenta otros factores
como el estado fisiológico de las plantas, ya que para en el Experimento 1 las plantas
tenían seis semanas de edad cuando fueron expuestas a la infección por S.
sclerotiorum, mientras que en el Experimento 2 tenían cuatro semanas.
En cuanto a los tratamientos con hidrolizados proteicos, en el Experimento 1 las
plantas MIC de las variedades Azufrasin y Azufrado Regional 87 tratadas con HID-1
(hidrolizado de proteína de Azufrado Higuera) mostraron un halo de lesión menor con
respecto a los otros tratamientos, mientras que en el Experimento 2 los tratamientos
que desarrollaron menores halos de lesión fueron las plantas NO MIC, donde solo se
evaluó en la variedad Azufrado Regional 87. En Azufrado Higuera, HID-1 indujo una
respuesta de defensa de manera importante en las plantas no micorrizadas, lo cual
no fue observado en las otras variedades.
Ya que Azufrado Regional 87 es la variedad que en estudios previos ha respondido a
la inducción de defensa por micorrización, en el Experimento 2 se utilizó solamente
esta variedad para probar los hidrolizados HID-1 (hidrolizado de proteína de Azufrado
Higuera) y el HID-2 (hidrolizado de proteína de Azufrado Regional 87). Estos dos
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hidrolizados indujeron una respuesta de defensa contra S. sclerotiorum, sin embargo,
el HD2 fue más efectivo para disparar la respuesta de defensa (Figura 15).
Una comparación de la composición proteica de las semillas de Azufrado Regional
87 y Azufrado Higuera arroja que 33 proteínas están presentes de manera cualitativa
(esto significa que una proteína está presente en un genotipo y en otro no) y 50 de
manera cuantitativa (que están presente en mayor o menor abundancia) (Camacho
et al., 2010), lo cual sugiere que los dos hidrolizados contienen péptidos
diferenciales, mismo que pudiera explicar sus distintos efectos. A la fecha existen
muchos estudios sobre la aplicación de hidrolizados proteicos a plantas, pero no
como inductores de protección contra patógenos sino como bioestimulantes los
cuales mejoran la eficiencia de los nutrientes, la tolerancia al estrés abiótico y la
calidad de los cultivos (Colla et al., 2014)
Existe considerable evidencia del potencial que pueden tener algunos extractos de
plantas o compuestos derivados de plantas como disuasivos comerciales de hongos
patógenos (Shuping, 2017), pero poco se sabe sobre el uso de hidrolizados de
proteína para este fin. Dichos estudios están mayormente dirigidos a compuestos
fenólicos, taninos, alcaloides, entre otros (Gurjar et al., 2012).
El método de extracción de proteínas utilizado en este trabajo no descarta la
posibilidad de arrastrar otros compuestos. La ventaja de los extractos de plantas es
que con frecuencia contienen una mezcla de productos químicos que pueden
trabajar en sinergia para inhibir el crecimiento de hongos fitopatógenos. Muchos
extractos de plantas contienen también más de un compuesto antifúngicos (Masoko,
2005). Así que no podemos descartar la posibilidad de que en los hidrolizados de
proteína se encuentren presentes otros compuestos y que estos de manera
autónoma causen el efecto protector ante S. sclerotiorum.
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IX. CONCLUSIONES
1. El análisis in silico demuestra que la familia de la faseolina está constituida
únicamente por dos genes ubicados en el cromosoma 7 del genoma de frijol
de tal manera que las variantes proteicas observadas por otros autores deben
ser el resultado de modificaciones postranscripcionales y postraduccionales.
2. En este trabajo no se logró detectar la expresión del gen de faseolina
previamente detectado en hojas de plantas micorrizadas. Es posible que el
nivel de expresión en el tejido utilizado no haya sido suficiente para ser
detectado.
3. Hidrolizados proteicos de semillas de frijol son capaces de inducir defensa en
tejido foliar de plantas de frijol al ser aplicados de manera exógena. La
efectividad de los hidrolizados parece depender de las condiciones de
micorrización, el nivel de colonización micorrízica, el estado fenológico de la
planta y la variedad de frijol tratada y utilizada para la obtención del
hidrolizado.
4. Los hidrolizados de semillas de frijol tienen potencial de aplicación
biotecnológica para la inducción de defensa en frijol contra S. sclerotiorum.
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X. RECOMENDACIONES
Continuar con la determinación de la expresión del gen de faseolina en hojas
de plantas de frijol micorrizadas, en plantas que presente porcentajes de
colonización micorrízica más altos.
Sintetizar de nuevo los oligonucleótidos degenerados del trabajo previo para
corroborar su funcionalidad.
Diseñar nuevos oligonucleótidos para el gen β-faseolina buscando que estos
abarquen distintas zonas del gen.
Continuar realizando experimentos de aplicación de hidrolizados buscando
determinar el tiempo óptimo para su aplicación y cuidando siempre realizarlos
en la misma etapa fenológica de la planta.
Realizar un ensayo de dosis respuesta de los hidrolizados para optimizar su
aplicación.
Realizar una purificación de faseolina y un hidrolizado de ella para aplicarla a
plantas micorrizadas y no micorrizadas, y confirmar si el efecto observado en la
aplicación de los hidrolizados es por acción de la faseolina.
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XI. BIBLIOGRAFIA
1. Azcón, C., y Barea, J. M. 1996. Arbuscular mycorrrhizas and biological control
of soil-borne plant pathogens-an overview of the mechanisms involved.
Mycorrhiza. 6:457-464.
2. Bollini, R., Vitale, A. 1981. Genetic variability in charge microheterogeneity and
polypeptide composition of phaseolin, the major storage protein of Phaseolus
vulgaris; and peptide maps of its three major subunits, Physiol. Plant. 52: 96–
100.
3. Burow, Mark., et al., 1992. Developmental control of the β-phaseolin gene
requires positive, negative, and temporal seed-specific transcriptional
regulatory elements and a negative element for stem and root expression. The