RESEARCH POSTER PRESENTATION DESIGN © 2015 www.PosterPresentations.com Le dosage de l’hémoglobine A1c, principale forme d’hémoglobine glyquée caractérisée par la fixation non enzymatique de glucose à l’extrémité N-terminale (val) des chaînes β de la globine, constitue aujourd’hui un élément essentiel de la prise en charge du patient diabétique. Sa valeur reflète de façon rétrospective la glycémie moyenne des 4 à 8 semaines passées , en raison de sa formation cumulative et irréversible. C’est pourquoi il est nécessaire d’obtenir des taux d’HbA1c fiables, et donc d’utiliser des méthodes performantes, validées et traçables à la méthode de référence internationale de l’IFCC. Différents interférents sont habituellement rencontrées lors du dosage de l’HbA1c: - L’ Hb glyquée labile (LA 1c ) , proportionnelle à la glycémie et intervenant particulièrement en cas de diabète déséquilibré ou de découverte de diabète. - L’ Hb carbamylée (cHb), obtenue après fixation d’acide isocyanique (dérivé de l’urée ), formée préférentiellement chez les patients souffrant d’insuffisance rénale chronique. - Une Hb fœtale élevée. - Certains variants de l’hémoglobine. Dérivés de l’ Hb: - Une étude antérieure avait démontré l’absence d’interférence de l’Hb glyquée jusqu’à LA1c = 5.9% et de l’Hb carbamylée jusqu’à 2,5 %, avec le Variant II. Cependant, les auteurs ne citent pas les conditions pour considérer la différence significative ou non significative. En analysant leurs résultats, on voit que l’écart permis était 0.2% d’HbA1c, et non pas 0.5%. - La limite technique sur l’automate Tosoh G8 : LA1c+cHb<5. HbF : - Malgré que la limite de validation technique annoncée dans l’insert du kit du Variant II soit à 10%, l’interférence (sous-estimation) n’est cliniquement importante que lorsque HbF ≥ 20% (biais relatif moyen = -0.33%). - Tosoh G8: absence d’interférence jusqu’à 30%. Variants de l’Hb: - Pas d’interférence en cas d’hétérozygotie HbS, HbC, HbD, HbE et Hb O-Arab (Variant II). - Sur-estimation en cas d’hétérozygotie Hb Hope (Variant II), Hb Raleigh, Hb Graz, Hb Sherwood Forest (évalués sur l’ancienne trousse du Variant ). - Sous-estimation en cas d’hétérozygotie Hb Lepore, HbJ Baltimore (Variant II), Hb G Philadelphia, Hb O Podova, Hb Camden (évalués sur l’ancienne trousse du Variant). - Pas d’interférence en cas d’hétérozygotie d’Hb Hope, Hb Raleigh, Hb Lepore et Hb G Philadelphia (Tosoh G8). - Autres variants rares dont l’interférence avec le dosage de l’HbA1c par les méthodes de chromatographie par échange d’ions est connue : K, Bart’s, H, N, I, Deer Lodge, Okayama, Marseille/Long Island, Andrew-Minneapolis, Osier, Fukuyama, Tatras, Lisbon, Malmo, Tacoma, Funnin-Lubbock, Olomuc, Hifiyama, Le Lamntin, Graz, Hokueto. INTRODUCTION Pour le Variant II : LA1c: Pas d’interférence (la limite de 8,6% n’est pratiquement jamais atteinte). cHb: Pas d’interférence si respect de la limite de validation technique (cHb≤2.8%). HbF: Présence d’une légère sous-estimation si HbF >10%, qui n’est cliniquement importante que lorsque HbF ≥ 20%. Variants de l’Hb: l’effet dépend du pattern de migration de chacune des formes glyquée et non glyquée sur le chromatogramme Résultats reportables (HbS, HbC, HbD, HbE et Hb O-Arab) ou non reportables (Hb Hope, Hb Lepore, Hb J Baltimore). Nous recommandons le dosage de l’HbA1c sur le Tosoh G8 si: - cHb > 2.8% (valeur associée à des taux d’urémie élevée > 260 mg/dL chez des patients IR) - HbF entre 10 et 30%. - Détection à l’état hétérozygote d’un variant de type Hb Hope, Hb Raleigh, Lepore et Hb G Philadelphia. Cas particulier des insuffisants rénaux: Malgré tous ses inconvénients chez les IR, l’HbA1c reste le marqueur de contrôle glycémique à long-terme préféré par les cliniciens. De même qu’il est utilisé dans les essais cliniques pour les études de corrélation avec les complications du diabète. Chez cette catégorie de patients, le monitoring du diabète peut également être assuré par dosage de la glycohémoglobine totale. Un pourcentage de 0.063% de cHb est considéré généralement équivalent à 1 mmol/L d’urée (6mg/dL). Mais en routine, des difficultés sont rencontrées dans l’interprétation de la valeur de l’HbA1c, à cause de: la fluctuation du taux d’urée (insuffisance aigue vs. chronique ? Prélèvement pré- ou post- dialyse ?), l’érythropoïèse accélérée (injections d’EPO ?), la durée de vie diminuée des GR, les transfusions sanguines répétées, l’anémie d’origine médicamenteuse/ ferriprive. En présence d’un variant de l’Hb à l’état hétérozygote , le monitoring du diabète peut également être fiablement assuré par dosage de l’HbA1c par méthode d’électrophorèse capillaire ou immuno-essai ou bien de la glycohémoglobine totale. En présence d’un variant de l’Hb à l’état homozygote , il est recommandé d’utiliser un autre marqueur tel que la fructosamine (ADA), sauf si protéinurie, pertes protéiques par voie digestive, ictère, cirrhose hépatique, dysfonction thyroïdienne, administration de glucocorticoïdes. Ce marqueur n’est pas influencé par le raccourcissement de la durée de vie des GR (en cas d’anémie hémolytique, drépanocytose, hémorragie..). OBJECTIFS CONCLUSIONS & DISCUSSION Insert de Kit HPLC 270-210NU CD rom manuel d’instruction du Variant II BIORAD E. Lavalard et al. Evaluation de l’analyseur Variant II® équipé de la nouvelle trousse 270-2101 NU (Bio-Rad) pour le dosage de l’HbA1c. Biol Clin 2009 ; 67 (1) : 55-65. Jaisson S. et al. Comparaison des interférences analytiques sur le dosage de l’HbA1c par deux analyseurs de chromatographie liquide haute press ion. Ann Biol Clin 2011 ; 69 (1) : 63-9. Lynn Bry . Effects of Hemoglobin Variants and Chemically Modified Derivatives on Assays for Glycohemoglobin. Clinical ChemistryFebruary 2001 vol. 47 no. 2 153-163. Qing Li et al. Haemoglobin A1c measurement in patients with Chronic Kidney Disease. Clinical Biochemistry 47 (2014) 481–484. Marijn Speeckaert. Are there better alternatives than haemoglobin A1c to estimate glycaemic control in the chronic kidney disease population? Nephrol Dial Transplant (2014) 29: 2167-2177. Rohlfing CL et al. The Effect of Elevated Fetal Hemoglobin on Hemoglobin A1c Results. Five Common Hemoglobin A1c Methods Compared With the IFCC Reference. Am J Clin Pathol. 2008 May;129(5):811-4. Jaisson S et al. Interference of the most frequent haemoglobin variants on quantification of HbA1c: comparison between the LC-MS (IFCC reference method) and three routinely used methods. Diabetes Metab. 2013 Sep;39(4):363-9. Chia-Ni Lin Todd J. Effects of hemoglobin C, D, E, and S traits on measurements of HbA1c by six methods. Clinica Chimica Acta 413 (2012) 819–821. Emery Department of Pathology, University of Utah Health Sciences Center, Salt Lake City, UT, United States. Randie R. Little, et al. Effects of Hemoglobin (Hb) E and HbD Traits on Measurements of Glycated Hb (HbA1c) by 23 Methods. Clinical Chemistry 54:8 1277–1282 (2008). Randie R. Little. Effects of 49 Different Rare Hb Variants on HbA1c Measurement in Eight Methods. Journal of Diabetes Science and Technology. 2015, Vol. 9(4) 849 –856. 27 hemoglobin variants that interfere with measurement of glycated hemoglobin by ion-exchange chromatography. Color Atlas of Hemoglobin disorders. College of American Pathologists, 2003. Chicago. Cas W. Weykamp et al. The Analytical Goals for Hemoglobin A1cMeasurement in IFCC Units and National Glycohemoglobin Standardization Program Units Are Different Clinical Chemistry 57:8 (2011). http:// www.ngsp.org http:// www.uptodate.com: Management of hyperglycemia in patients with type 2 diabetes and pre-dialysis chronic kidney disease or end-stage renal disease. REVUE DE LA LITTERATURE REFERENCES Interférences analytiques observées dans le dosage de l’HbA1c - Vérifier expérimentalement l’influence de l’Hb glyquée labile (LA1c) et de l’Hb carbamylée (cHb) sur le dosage de l’HbA1c sur l’automate Variant II (BioRad). - C onfronter les résultats aux données de la littérature, et revoir ce qui a déjà été publié comme études portant sur les interférences causées par les dérivés de l’Hb (LA1c et cHb), l’Hb fœtale et les variants de l’Hb, notamment avec les méthodes de séparation utilisant le principe de chromatographie liquide haute pression. - Établir des limites techniques pour la validation des résultats d’HbA1c dans notre laboratoire. - Envisager des alternatives pour le dosage de l’HbA1c, en cas de dépassement des limites techniques pour les dérivés de l’Hb et l’Hb fœtale, et en cas de détection d’un variant de l’Hb (évaluation du Tosoh G8). METHODOLOGIE A. Les essais expérimentaux ont porté sur l’observation des effets de la glycation et de l’élimination de l’Hb glyquée labile, ainsi que de la carbamylation in vitro d’échantillons parvenant au laboratoire pour des analyses de routine. Glycation : Incubation à 37°C dans une solution glucosée à 0.5M (10 g/dL). Carbamylation : Incubation des GR (lavés x3) pendant 3h, à 37 °C, dans du tampon phosphate de sodium 0,15M (pH 7,4) contenant des concentrations croissantes de KCNO (0.625 à 5 mmol/L). B. Les articles révisés portent sur des études comparatives, notamment avec la méthode de référence IFCC (RP-HPLC/MS ou RP-HPLC/CE). L’évaluation de la présence ou non d’une interférence significative est basée sur le critère du « biais relatif moyen » de la méthode par rapport à celle de référence, pour chaque facteur interférent. RESULTATS Les résultats des essais sur le Variant II montrent : L’absence d’interférence significative de l’Hb glyquée labile jusqu’à 8.6%. L’absence d’interférence significative de l’Hb carbamylée jusqu’à 2.8%. NB : Nous avons jugé la présence d’une interférence significative si l’écart par rapport au témoin excédait l’erreur totale admissible TE*, ce qui correspond à ~ 0.5% d’HbA1c (NGSP) ou 5 mmol/mol (IFCC). *TE = 6.7% (méthodes NGSP) ; 8.6% (méthodes IFCC). Laboratoire Hospitalier Universitaire de Bruxelles - Site Anderlecht Service de Chimie Médicale [email protected] Najla El Bizri, MD; Béatrice Gulbis, MD, PhD; Frédéric Cotton, PharmD, PhD Figure 1. Aspect des chromatogrammes obtenus sur l’automate Variant II avant et après glycation in vitro pour des échantillons de sang total contenant un taux d’HbA1c de 6,2 % (A), de 7.3% et 9.5% (B). Figure 2. Aspect des chromatogrammes obtenus sur l’automate Variant II avant et après carbamylation in vitro (T 3h) pour des échantillons de sang total contenant un taux d’HbA1c de 6% (A), 9.2% (B) et 13.6% (C). Tableau 1. Influence de la carbamylation in-vitro sur le dosage de l’HbA1c : résultats à des valeurs croissantes de KCNO. A B A B C Figure 3. Aspect des chromatogrammes sur le Variant II en présence de variants de l’hémoglobine (résultats reportables; non reportables).