POLYMERASE CHAIN REACTION - dhiantika.staff.ugm.ac.iddhiantika.staff.ugm.ac.id/files/2011/04/PCR-LDW.pdfPolymerase Chain Reaction Tehnik PCR merupakan metode amplifikasi (penggandaan)

POLYMERASE CHAIN REACTION

LUCIA DHIANTIKA WITASARI

1dhiantika.staff.ugm.ac.id

Polymerase Chain Reaction

Tehnik PCR merupakan metode amplifikasi(penggandaan) fragmen DNA secara in vitro.

PCR is an iterative process, consisting of three elements: 

1. denaturation of the template by heat2. annealing of the oligonucleotide primers to the 

single‐stranded target sequence(s)3. extension of the annealed primers by a 

thermostable DNA polymerase. 

2dhiantika.staff.ugm.ac.id

Essential Components of Polymerase Chain Reactions

• A thermostable DNA polymerase to catalyze template‐dependent synthesis of DNA. • Taq polymerase 

• Primers : A pair of synthetic oligonucleotides to prime DNA synthesis. 

• Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) • dATP, dTTP, dCTP, and dGTP

• Divalent cations• All thermostable DNA polymerases require free divalent cations — usually Mg2+ 

for activity. 

• Buffer to maintain pH• Tris‐Cl, adjusted to a pH between 8.3 and 8.8 at room temperature,

• Monovalent cations• KCl

• Template DNA

3dhiantika.staff.ugm.ac.id

Primer Design

Length: 16 to 25 bases; rarely for efficient amplification is there a need to 

use longer primers.

GC content: should mirror the content of the amplicon. The 3' end should be "weak"; no G or C as the end base. 

T m : should be balanced, annealing temperatures are usually 5° to 10°C lower than the T m .– The melting temperatures of oligos (generally valid for oligos in the 18–24 base 

range) can be estimated using the formula: 

Tm = 2(A+T) + 4(G+C).

Absence of complementarity: 3'‐end, primer‐dimer, internal hairpin structures.

Orientation and placement: important more in RT‐PCR experiments (placement at the 3' or 5' end, or spanning intron/exon junctions)

4dhiantika.staff.ugm.ac.id

PCR cycle

5dhiantika.staff.ugm.ac.id

6dhiantika.staff.ugm.ac.id

dhiantika.staff.ugm.ac.id 7

A. Double strand DNA

B. Denature96º

50º

C. Anneal primers

50º

D. Polymerase binds

72ºTaq

Taq

dhiantika.staff.ugm.ac.id 8

72ºTaq

Taq

E. Copy strands

1

2

3

4

F. Denature

96º

First round of cDNA 

synthesis (4 strands)

Taq

Taq

dhiantika.staff.ugm.ac.id 9

1

2

3

4

50ºG. Anneal primers

dhiantika.staff.ugm.ac.id 10

1

2

3

4

Taq

Taq

Taq

Taq

72º

H. Polymerase binds

dhiantika.staff.ugm.ac.id 11

1

2

3

4

Taq

Taq

Taq

Taq

I. Copy strands

72º

Second round of cDNA 

synthesis (8 strands)

dhiantika.staff.ugm.ac.id 12

1

2

3

4

J. Denature at 96ºAnneal primers at 50º

dhiantika.staff.ugm.ac.id 13

1

2

3

4

72º

K. Bind polymerase (not shown) and copy strands

Third round of cDNA 

synthesis (16 

strands)

dhiantika.staff.ugm.ac.id 14

1

23

4

L. Denature at 96ºAnneal primers at 50º

dhiantika.staff.ugm.ac.id 15

1

23

4

M. Copy strands at 72º

Fourth round of cDNA 

synthesis (32 

strands)

72º

dhiantika.staff.ugm.ac.id 16

1

2

3

4

cDNA strands (32) are now shown as lines

dhiantika.staff.ugm.ac.id 17

1

23

4

After 5 rounds there are 32 

double strands of which 24 (75%) are 

are same size

dhiantika.staff.ugm.ac.id 18

RT‐PCR

Reverse transcriptase (RT)-PCR adalah amplifikasi fragmen DNA yang diperoleh dari fragmen mRNA. Produk yang dihasilkan adalah cDNA.

dhiantika.staff.ugm.ac.id 19

Double strand cDNA

AAAAA

TTTTTRT

AAAAA

TTTTTRT

RTAAAAA

TTTTT

Oligo dT primer is bound to mRNA

Reverse transcriptase (RT) copies first cDNA

strand

Reverse transcriptase digests and 

displaces mRNA and copies second strand of cDNA

Conversion of mRNA to cDNA by Reverse Transcription

dhiantika.staff.ugm.ac.id 20

Amplifikasi frgamen DNA yang sudah diklonkan kedalam vektor denganmenggunakan primer yang mengenali urutan nukleotida pada vektor.

dhiantika.staff.ugm.ac.id 21

Kloning produk PCR yang menghasilkan fragmen DNA dengang beberapa basa yang tidak berpasangan.