Polimerase Chain Reaction (PCR).ppt

Polimerase Chain Reaction (PCR)Polimerase Chain Reaction (PCR)

Tahun 1985, Kary Mullis, CaliforniaTahun 1985, Kary Mullis, CaliforniaMetode untuk meng-amplifikasi (melipat Metode untuk meng-amplifikasi (melipat

gandakan) fragment DNA (Gen) gandakan) fragment DNA (Gen) Dibutuhkan :Dibutuhkan :

DNA atau RNADNA atau RNAOligonucleotidprimer (PRIMER)Oligonucleotidprimer (PRIMER)Enzym Enzym Taq-Taq-PolimerasePolimeraseCampuran dari 4 Basa Nukleotida Campuran dari 4 Basa Nukleotida

(d’NTPs)(d’NTPs)10 x Reactions Buffer10 x Reactions Buffer

Larutan MgClLarutan MgCl22

Alat : Thermal CyclerAlat : Thermal Cycler

Prinsip : perobahan temperatur secara Prinsip : perobahan temperatur secara otomatis dengan waktu yang telah otomatis dengan waktu yang telah ditentukanditentukan

Dapat diatur (Program)Dapat diatur (Program)Contoh : 95 °C------ DenaturasiContoh : 95 °C------ Denaturasi

55 °C------ Hybridisasi 55 °C------ Hybridisasi (Annealing)(Annealing)72 °C------ Synthese DNA 72 °C------ Synthese DNA (Extension) (Extension)

Lama reaksi, bervariasi tergantung panjang Lama reaksi, bervariasi tergantung panjang fragment DNA (2 min. : < 1000 Nukleotida)fragment DNA (2 min. : < 1000 Nukleotida)

DNADNA

DNA di-isolasi dari sel (darah atau jaringan)DNA di-isolasi dari sel (darah atau jaringan)DNA menjadi “template” atau “matrix” untuk DNA menjadi “template” atau “matrix” untuk

proses amplifikasiproses amplifikasiSense : 5’- ATG(Start) -GGT-TCT-GTT-Sense : 5’- ATG(Start) -GGT-TCT-GTT-

GCT-GCT-TGG-TAA(Stop)- 3’GCT-GCT-TGG-TAA(Stop)- 3’Antisense : 3’ - TAC-CCA-AGA-CAA-CGA-Antisense : 3’ - TAC-CCA-AGA-CAA-CGA-

CGA-ACC-ATT- 5 ‘CGA-ACC-ATT- 5 ‘Exon dan/atau Intron dapat berfungsi Exon dan/atau Intron dapat berfungsi

sebagai Matrix untuk amplifikasisebagai Matrix untuk amplifikasi

RNARNA

Single strand (Uracil pengganti Thymin)Single strand (Uracil pengganti Thymin) Transkripsi dari DNA mRNATranskripsi dari DNA mRNA Mengandung informasi genetik dari Exon Mengandung informasi genetik dari Exon Dengan Enzym Reverse Transkriptase Dengan Enzym Reverse Transkriptase

diperoleh DNA dari RNAdiperoleh DNA dari RNA cDNAcDNA Reaksi PCR nya disebut RT-PCRReaksi PCR nya disebut RT-PCR

Taq-PolimeraseTaq-Polimerase

Klenow - DNA Polymerase dari E.ColiKlenow - DNA Polymerase dari E.Coli1988 : Taq-Polymerase dari Bakteri 1988 : Taq-Polymerase dari Bakteri

Thermus aquaticusThermus aquaticusHybridisasi dan Polimerisasi berlangsung Hybridisasi dan Polimerisasi berlangsung

pada temp. 50-70 °C pada temp. 50-70 °C Perhatikan : Buffer yang digunakan Perhatikan : Buffer yang digunakan

(10 x RB) dan diperlukan MgCl(10 x RB) dan diperlukan MgCl2 2

PrimerPrimer

Sequence dari Nukleotida tertentu (Intron Sequence dari Nukleotida tertentu (Intron atau Exon) : 20 – 30 bpatau Exon) : 20 – 30 bp

Prinsip : merupakan complementare dari Prinsip : merupakan complementare dari kedua strand DNA (Forward Primer dan kedua strand DNA (Forward Primer dan Reverse Primer).Reverse Primer).

Dari kedua Primer ini disinthese DNA yang Dari kedua Primer ini disinthese DNA yang baru dan seterusnya berfungsi sebagai baru dan seterusnya berfungsi sebagai matrix untuk siklus berikutnya.matrix untuk siklus berikutnya.

Penentu bagi fragment DNA yang akan Penentu bagi fragment DNA yang akan diamplifikasi diamplifikasi

PCR-REACTION

PCR-Reaction

PCR Product (Amplifikat)PCR Product (Amplifikat)

Gel-elektrophorese (Agarose) Gel-elektrophorese (Agarose) Southern Blot (Hybridisasi dengan Southern Blot (Hybridisasi dengan

Sonde DNA spesifik)Sonde DNA spesifik)Dot - Blot (deteksi : Enhanced Chemie Dot - Blot (deteksi : Enhanced Chemie

Luminescense = ECL)Luminescense = ECL)Denaturating Gradient Gel Denaturating Gradient Gel

Electrophorese (DGGE) atau Pulse Electrophorese (DGGE) atau Pulse Field Gel Electrophorese (PFGE) Field Gel Electrophorese (PFGE)

Enzym Restriksi : Restriction Enzym Restriksi : Restriction EndonucleaseEndonuclease

Sequence analysis (DNA Sequencing)Sequence analysis (DNA Sequencing)

RER

freeribosomescytoplasmic

proteins

ProteinTraffic

Aplikasi teknologi DNAAplikasi teknologi DNA

INFEKSI SALURAN CERNA :Membedakan jenis : pathogen – non

pathogen (Eschericia coli)Untuk bakteri yang sulit dikultur oleh

karena memerlukan syarat tertentu (Campylobacter)

Membedakan jenis bakteri dari toxin yang diproduksinya (E. coli dan Shigela sp.)

Subklas bakteri : Campylobacter, Helicobacter

Mengidentifikasi jenis Rotavirus (A, B, C)

Aplikasi teknologi DNAAplikasi teknologi DNA

Mycobacterium tuberculosis :Membedakan jenis atypic, dengan

mikroskop hal ini tidak mungkinKultur : waktu yang lama dan bakteri harus

banyak (terutama untuk sensitivity test)Diagnose cepat dibutuhkan, mis. pada

penderita AIDS.Ditemui jenis yang multi drug resistant

(MDR)Diagnosa dengan PCR dan Hybridisasi

(contoh : dot-blot)

Carcinogenesis (Colorectal Cancer)

Produk dari gen untuk therapy dan prophylaxis :

ErythropoietinInsulinHormon pertumbuhanFaktor pembekuan darah VIIIPlasminogen aktivatorVaksin Hepatitis B

Penerapan Teknologi Gen/DNA dalam Therapy

Aplikasi gen dalam Forensik• Sebelum teknologi DNA diterapkan (1978)

biasanya digunakan protein, misalnya antigen gol.darah, HLA, dll.

• 1985 : DNA Polymorphismus.

• Nov.1987 : DNA sebagai barang bukti di pengadilan di Inggris.

• Sampai akhir 80-an : lebih dari 1000 perkara dibantu oleh bukti-bukti DNA

• Juga dapat menentukan Paternity

• Profil DNA tiap individu berbeda