VALIDASI METODE ANALISIS RESIDU DIFENOKONAZOL DALAM BUAH MELON (Cucumis melo L.) SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh: Florentina Silviana Devi NIM: 118114149 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta 2015 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
138
Embed
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIrepository.usd.ac.id/2726/2/118114149_full.pdf · 11. Teman-teman FSM-D dan FST-B 2011 selaku teman-teman kelas yang telah memberikan banyak
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
VALIDASI METODE ANALISIS RESIDU DIFENOKONAZOL DALAM
BUAH MELON (Cucumis melo L.)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Florentina Silviana Devi
NIM: 118114149
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta
2015
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
VALIDASI METODE ANALISIS RESIDU DIFENOKONAZOL DALAM
BUAH MELON (Cucumis melo L.)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Florentina Silviana Devi
NIM: 118114149
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta
2015
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
“ Hidup untuk bermimpi, Hidup untuk berusaha, Hidup untuk bersyukur dan
kembalilah pada sebuah mimpi, usaha dan syukur”
Karya ini kudedikasikan untuk orang tua, keluarga, teman-teman dan
almamaterku Universitas Sanata Dharma.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan atas berkat karunia yang telah dilimpahkan
sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “VALIDASI METODE
ANALISIS RESIDU DIFENOKONAZOL DALAM BUAH MELON (Cucumis melo
L.)” sebagai tugas akhir untuk mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.).
Selama pelaksanaan penelitian penulis mendapatkan banyak dukungan
motivasi, bantuan arahan, bimbingan, kritik, saran dan doa dari berbagai pihak. Maka
dari itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih, terutama kepada:
1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku pembimbing utama skripsi yang telah
memberikan bimbingan, arahan, kritik, saran, doa, semangat motivasi, dan
bantuan lainnya sejak awal hingga akhir penelitian.
2. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt, Selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta
3. Jeffry Julianus, M.Si dan F. Dika Octa riswanto, M.Sc., selaku dosen penguji
yang memberikan kritik dan saran untuk membangun skripsi ini.
4. Sanjayadi M.Si., yang telah banyak memberikan arahan, bimbingan, kritik,
saran, doa, membantu dalam optimasi kesesuaian sistem GC-ECD yang
digunakan serta memberi semangat motivasi dan dukungan sejak awal hingga
akhir penelitian.
5. Nina setiawati, M.Sc., Apt. selaku kepala laboratorium Universitas Sanata
Dharma yang memberikan perijinan untuk menggunakan laboratorium.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
6. Seluruh dosen dan karyawan fakultas farmasi Universitas Sanata Dharma atas
bantuan selama proses pembelajaran menempuh jenjang S1 Farmasi.
7. Bapak Lukas Sumari dan mamak Katarina Katrin selaku orang tua yang selalu
mendoakan, mendukung, dan memberi motivasi sehingga penulis dapat
B kemudian ditambahkan 2 µL DCB add hingga 200 µL dengan pelarut
heksan kemudian diinjeksikan ke dalam kromatografi gas sebanyak 2
µL.
e. Pembuatan larutan kurva baku adisi .Diambil sebanyak 20µL ; 15µL ;
13 µL ; 10µL; 5µL ; 3µL ; 2µL; 1µL dari larutan intermediet stok B
kemudian ditambahkan 2 µL DCB ke dalam flakon berisi ekstrak
matriks yang telah kering add hingga 200 µL dengan pelarut heksan
kemudian diinjeksikan ke dalam kromatografi gas sebanyak 2 µL.
f. Pencucian flakon wadah sampel supernatan. Flakon dicuci
menggunakan akuades kemudian aseton dilanjutkan dengan metanol
dan dikeringkan dalam oven.
g. Pencucian syringe. Syringe dicuci menggunakan aseton kemudian
metanol dan dilanjutkan dengan 5 µL standar difenokonazol. Diulangi
hingga 3 kali.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
4. Optimasi Clean-Up SPE C18
a. Penentuan Kapasitas Solid Phase Extraction (SPE) C18. Ditimbang
dalam tabung sentrifugasi, 5 gram buah melon yang telah
dihomogenkan kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS.
Gojog larutan selama 1 menit kemudian vortex selama 2 menit dan
disentrifugasi selama 5 menit dalam 5000 rpm. Supernatan yang
terbentuk pada lapisan paling atas diambil sebanyak 1 mL dimasukan
dalam flakon dan dikeringkan dalam oven 60°C hingga tercapai bobot
tetap. Replikasi 3 kali. Kemudian ditimbang dan dihitung rata-rata
berat setelah dikeringkan.
b. Optimasi Washing SPE. Sebanyak 5 gram buah melon yang telah
dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung sentrifugasi,
kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan
asetonitrril sebanyak 5mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian
vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan
kecepatan 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil semuanya
dan dimasukan dalam flakon. Dilakukan reekstraksi dengan
menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam tabung sentrifugasi
yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan selama 1
menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan
yang terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan
digabung ke dalam flakon supernatant sebelumnya kemudian
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
ditambahkan 2 µL Standar stok B dan dikeringkan di atas hotplate
dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan
dalam 0,5 mL akuabides selanjutnya di-degassing dengan
ultrasonifikator selama 5 menit. Aplikasikan sampel yang telah di-
degassing ke dalam kolom SPE. Washing SPE C18 dengan berbagai
macam komposisi pelarut, antara lain: 5 mL akuabides tanpa fraksinasi
; 5 mL metanol 5% dengan 5 fraksinasi ; 5 mL UPW 100% dengan 5
fraksinasi. Selanjutnya cuci ekstrak dalam flakon dengan 3 mL
metanol dan elusikan dalam kolom SPE kemudian ditampung dalam
flakon baru untuk dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas
nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 200 µL heksan
dan ditambahkan DCB kemudian diambil 2µL untuk diinjeksikan ke
dalam sistem GC-ECD.
c. Optimasi Elusi SPE. Sebanyak 5 gram buah melon yang telah
dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung sentrifugasi,
kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan
asetonitrril sebanyak 5mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian
vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan
kecepatan 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil semuanya
dan dimasukan dalam flakon. Dilakukan reekstraksi dengan
menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam tabung sentrifugasi
yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan selama 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan
yang terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan
digabung ke dalam flakon supernatan sebelumnya kemudian
ditambahkan 2µL Standar stok B dan dikeringkan di atas hotplate
dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan
dengan 1 mL akuabides kemudian di-degassing dengan
ultrasonifikator selama 5 menit selanjutnya aplikasikan sampel ke
dalam kolom SPE C18. Washing dengan menggunakan akuabides
sebanyak 5 mL kemudian keringkan kolom dengan bantuan gas
nitrogen. Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan (1
mL ; 2 mL ; 3 mL ; 4 mL ; 5 mL) metanol. Masukan metanol ke dalam
flakon untuk mencuci ekstrak, kemudian aplikasikan ke dalam kolom
SPE. Eluat yang keluar dari SPE ditampung dalam flakon. Sampel
dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel
yang telah kering dilarutkan dengan 200 µL heksan dan ditambahkan
DCB kemudian diambil 2µL untuk diinjeksikan ke dalam sistem GC-
ECD.
5. Optimasi kelayakan SPE untuk digunakan lebih dari satu kali. Sebanyak 5 gram
buah melon yang telah dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung
sentrifugasi, kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan
asetonitril sebanyak 5 mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian vortex selama
2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
Supernatan yang terbentuk diambil semuanya dan dimasukan dalam flakon.
Dilakukan reekstraksi dengan menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam
tabung sentrifugasi yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan
selama 1 menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan yang
terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan digabung ke dalam
flakon supernatan sebelumnya lalu ditambahkan (7 µL ; 10 µL) Standar stok C
dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah
kering dilarutkan dengan 0,5 mL akuabides kemudian diultrasonifikasi selama 5
menit. Sampel yang telah di-degassing dengan ultrasonifikator diambil dengan
pipet Pasteur untuk dimasukan ke dalam SPE. Washing sampel dalam flakon
berisi ekstrak dengan menggunakan akuabides sebanyak 5 mL dan diaplikasikan
dalam kolom SPE C18 lalu keringkan kolom dengan bantuan aliran nitrogen.
Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan metanol. Metanol
digunakan untuk mencuci flakon berisi sisa ekstrak, cuci hingga semua ekstrak
tercuci bersih, aplikasikan ke dalam kolom SPE C18. Eluat yang keluar dari SPE
ditampung dalam flakon dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas
nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 200 µL heksan dan
ditambahkan DCB kemudian diambil 2µL untuk diinjeksikan ke dalam sistem
GC-ECD.
6. Validasi Metode Analisis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
Validasi metode analisis merupakan serangkaian proses yang dilakukan untuk
membuktikan bahwa metode analisis memenuhi persyaratan yang telah ditentukan,
yang sesuai dengan tujuan penggunaannya. Perbedaaan langkah kerja validasi metode
dengan uji kesesuaian sistem adalah kurva baku yang digunakan. Kurva baku yang
digunakan dalam validasi metode analisis adalah kurva baku metode adisi dengan
menggunakan matriks ekstrak buah melon sedangkan pada uji kesesuaian sistem
kurva baku yang digunakan adalah kurva baku solven. Di bawah ini merupakan
langkah kerja secara umum untuk mendapatkan ekstrak buah melon yang siap diadisi:
Sebanyak 5 gram buah melon yang telah dihomogenkan dengan blender
ditimbang dalam tabung sentrifugasi, kemudian ditambahkan campuran garam
QuEChERS tambahkan asetonitrril sebanyak 5 mL. Gojog larutan selama 1 menit
kemudian vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan
5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil semuanya dan dimasukan dalam
flakon. Dilakukan reekstraksi dengan menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke
dalam tabung sentrifugasi yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan
selama 1 menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan yang
terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan digabung ke dalam flakon
supernatan sebelumnya kemudian ditambahkan 2 µL Standar stok B dan dikeringkan
di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan
dengan 0,5 mL akuabides kemudian didegassing selama 5 menit. Sampel yang telah
di-degassing dengan ultrasonifikator diambil dengan pipet Pasteur untuk
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
diaplikasikan ke dalam kolom SPE. Washing sampel dalam flakon berisi ekstrak
dengan menggunakan akuabides sebanyak 5 mL lalu keringkan kolom dengan
bantuan aliran nitrogen. Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan
metanol. Metanol digunakan untuk mencuci flakon berisi sisa ekstrak, cuci hingga
semua ekstrak tercuci bersih, lalu sedikit demi sedikit ekstrak tersebut diaplikasikan
ke dalam kolom SPE C18. Eluat yang keluar dari SPE ditampung dalam flakon dan
dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen.
Ekstrak yang didapatkan digunakan sebagai matriks untuk melakukan validasi
metode analisis. Parameter validasi metode yang dinilai adalah sebagai berikut :
a. Presisi (keterulangan) sistem GC-ECD. Presisi dapat ditentukan dari nilai
CV. Parameter presisi dapat diperoleh dengan menginjeksikan 2 µL
larutan ekstrak melon yang sudah diadisi standar difenokonazol stok B
1ul, 3ul, 5ul, 7ul, 10ul, 13ul, 15ul, 20ul, ke dalam sistem GC-ECD
sebanyak 3 kali. Respon yang berupa luas puncak difenokonazol dari
masing-masing konsentrasi larutan baku yang diperoleh dihitung nilai
rata-rata, SD dan %CV.
b. Linearitas hubungan konsentrasi baku difenokonazol dengan respon
sistem GC-ECD. Koefisien korelasi (r) merupakan parameter yang
diperlukan untuk menentukan linearitas hubungan massa baku
difenokonazol terhadap respon sistem GC-ECD yang telah optimal.
Koefisien korelasi (r) diperoleh dengan menginjeksikan 2 µL larutan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
ekstrak melon yang sudah diadisi standar difenokonazol 0,053 ; 0,0789 ;
0,105 ; 0,132 ; 0,184 ; 0,263 ; 0,395 ;0.526 ng/µL ke dalam sistem GC-
ECD. Linearitas hubungan antara massa difenokonazol yang diinjeksikan
terhadap respon alat, diplotkan dalam bentuk kurva baku dan dihitung
parameter statistiknya seperti intersep (a), slope (b), dan koefisien korelasi
(r) dengan menggunakan program powerfit.
c. Sensitivitas sistem GC-ECD. Sensitivitas sistem GC-ECD yang telah
optimal dapat diketahui dengan menghitung nilai IDL dan slope. Kedua
parameter sensitivitas tersebut dapat ditetapkan dengan menginjeksikan 2
µL larutan baku difenokonazol dengan konsentrasi kurva baku adisi ke
dalam sistem GC-ECD. Nilai IDL dan slope dapat dihitung dari
persamaan kurva baku hasil injeksi.
G. Analisis Hasil
1. Uji kesesuaian instrument GC-ECD
a. Analisis hasil optimasi sistem GC-ECD. Analisis hasil optimasi sistem GC-
ECD dapat dilihat pada kromatogram yang dihasilkan. Optimasi kecepatan
alir gas, inisial temperatur, suhu injektor, suhu kolom, suhu detektor dan suhu
oven yang optimal akan memberikan pemisahan puncak senyawa yang
optimum.
b. Analisis Kinerja instrumen GC-ECD. GC-ECD yang telah optimal untuk
analisis kadar residu difenokonazol, dibuktikan oleh nilai Rs, TF, N, dan tR
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
yang memenuhi syarat-syarat batasan yang harus dicapai sebagaimana telah
dijelaskan pada beberapa teori .
1) Waktu retensi (tR).Waktu retensi dari masing-masing senyawa dapat
dilihat pada kromatogram yang dihasilkan. Keajegan rasio tR/standar
internal dan rasio AUC standar/DCB dari penginjekan 6 kali.
Kejegannya dihitung dengan rumus % RSD:
%RSD = 100-%recovery (Harmita,2004).
2) Daya pisah (resolusi). Resolusi dalam penelitian ini ada 2 yaitu
resolusi awal dan resolusi akhir. Resolusi dapat dihitung dengan
rumus:
Rs=
Keterangan : tR= waktu retensi W1 dan W2 = rata-rata lebar zona
3) Tailing factor (TF). Tailing factor atau TF dapat diterima apabila
memiliki nilai <1,2. Jika TF lebih >1,2 maka puncak kromatogram
tersebut mengalami tailing/ pengekoran (Dolan et al,2002)
TF=
4) Jumlah lempeng teoritik (N). Jumlah lempeng teoritik atau N dapat
dihitung dengan rumus :
N= 16(
2
Keterangan : tR: waktu retensi Wb=lebar dasar puncak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
c. Analisis hasil kinerja instrumen GC-ECD secara Kuantitatif. Analisis hasil Uji
Kesesuaian Sistem GC-ECD secara kuantitatif menghitung parameter-
parameter yang dibutuhkan, berikut ditentukan syarat-syarat nilai parameter
dari nilai CV, r, IDL, dan slope yang harus dicapai agar suatu sistem GC-ECD
dapat dinyatakan sesuai untuk penentuan kadar difenokonazol.
1) Linearitas
Linearitas ditentukan dari nilai koefisien korelasi (r) yang diperoleh
dari kurva baku solven hasil plot antara rasio luas puncak
difenokonazol/DCB dan massa standar baku yang diinjeksikan
kedalam regresi linear dengan persamaan y = a + bx dengan
menggunakan powerfit.
2) Sensitivitas
Sensitivitas alat dapat ditentukan dengan menghitung nilai slope, IDL,
IQL dengan rumus :
Slope dapat diperoleh dari persamaan regresi linear y=a+bx (b=slope;
a=intersep)
IDL dapat dihitung dengan rumus:
3,3 ×
Keterangan: Sa standar deviasi dari intersep kurva baku dan b : slope
k=3,3.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
3) Presisi (keterulangan)
Nilai presisi atau keterulang dapat diperoleh dengan menghitung
%kesalahan acak (%KV) dengan rumus:
Kesalahan Acak (%KV)=
x 100%
4) Percent Difference (%D)
Percent Difference (%D) dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut
% D=
x 100 %
d. Analisis hasil Optimasi Preparasi Sampel. Pengecekan kadar air dalam buah
melon.Kadar air didalam melon dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Kadar air =
x 100%
e. Validasi metode analisis Hasil modifikasi QuEChERS dan clean-up
1) Linearitas
Linearitas suatu kurva baku ditentukan oleh nilai koefisien korelasi (r).
Koefisien korelasi dapat diperoleh dengan mengeplotkan data antara
rasio luas puncak difenokonazol/standar internal DCB sebagai sumbu
y dengan konsentrasi difenokonazol sebagai sumbu x ke dalam
program Powerfit® sehingga didapatkan persamaan regresi linear y=
a + bx.
2) Selektifitas. Data kromatogram antara sampel sebelum dan sesudah
SPE dibandingkan selain itu resolusi antara puncak analit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
difenokonazol dengan puncak terdekat dihitung (ICH Harmonised
Tripartite,2005).
3) Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus :
Perolehan kembali (recovery) =
× 100%
4) Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus :
Kesalahan Acak (%RSD) =
× 100%
5) Sensitivitas. Limit of Quantitation(LOQ) dihitung dengan rumus :
10 ×
Keterangan: Sa standar deviasi dari intersep kurva baku dan b : slope
k=10
6) Limit of Detection (LOD). Limit of Detection (LOD) suatu sistem
GC-ECD dapat dihitung dengan menggunakan persamaan regresi
linear suatu kurva baku. Berikut adalah rumus untuk menghitung
LOD:
LOD= 3,3 ×
Keterangan: Sa standar deviasi dari intersep kurva baku dan b : slope,
k=3,3 (ICH Harmonised,2005).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
H. Rancangan Penelitian
1. Metode Adisi
Pada metode adisi dilakukan adisi jalur A, B, dan C untuk membuktikan
hipotesis 1.
Sampel blanko
Adisi A: Sampel +
standard (Ekstraksi)
Adisi B: Sampel
+standard
(Cleanup)
Adisi C: Sampel
+ standard
(Determinasi_
Sampel
sesungguhnya
Kesalahan
ekstraksi +
cleanup +
determinasi
Kesalahan
cleanup +
determinasi
Kesalahan
determinasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
2. Proses Preparasi Sampel : Ektraksi dengan Metode QuEChERS, Clean-up
SPE C18 dan Determinasi GC-ECD
sampling melon dilakukan secara acak dari beberapa pasar di Yogyakarta
Preparasi sampel secara kuartering, kemudian blender dan ditimbang sebanyak 5 gram sampel dalam seuah tabung sentrifugasi
tambahkan 5 mL pelarut asetonitril dan campuran garam QuEChERS kemudian gojog kuat selama 1 menit, vortex selama 2 menit dan lakukan sentrifugasi selama 5 menit dalam 5000
rpm.
supernatan pada lapisan yang paling atas yang atas diambil. lakukan reekstraksi dengan menambahkan 5 ml asetonitril ke dalam tabung sentrifugasi, gojog, vortex dan sentrifugasi. supernatan yang terbentuk dimasukan dalam 1 flakon supernatan
awal.
keringkan supernatan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen.
tambahkan 500 µL akuabides ke dalam flakon yang beerisi ekstrak kemudian lakukan degassing selama 5 menit.
aplikasikan hasil degassing ke dalam kolom SPE yang telah di conditioning dengan 5 mL metanol dan 5 mL akuabides.
washing SPE dengan 5 mL akuabides
dan elusi sampel dalam kolom SPE dengan 3 mL metanol. tampung eluat yang keluar dalam sebuah flakon kemudian keringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen.
larutkan ekstrak dalam 100 µL heksan ambil 2 µL untuk diinjeksikan ke dalam GC-ECD. analisis kromatogram yang dihasilkan. untuk membuktikan Hipotesis 3.
Tahap 1 : Proses Sampling
dan ekstraksi
Tahap 2 : Proses Cleanup
Tahap 3: Proses Determinasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3. Fraksinasi Elusi SPE C18 Metanol
melon melon melon
Potong melon secara
kuartering dan blender
Timbang 5 gram melon yang
telah diblender
Tambahkan campuran garam
QuEChERS :
2 gram MgSO4
0,5 gram NaCl
0,5 gram Na3Sitrat
0,25 gram Na2HCitR
55
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
Tambahkan 5 ml asetonitril
Gojog 1 menit dan vortex 2
selama menit
Sentrifugasi selama 5
menit dalam 5000rpm
Ambil semua supernatan. lakukan
reekstraksi dan gabung supernatan yang
terbentuk dan Tambahkan 50 µL standar A
Uapkan di atas hotplate
dengan bantuan gas nitrogen
Tambahkan 1mL akuabides
Degassing selama 5 menit
Loading pada SPE yang telah
di conditioning
Fraksinasi masing-masing 1
mL
Washing dengan 5 mL
akuabides
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
57
Keringkan
1 5 2 3 4
Larutkan dengan 200 µL heksan
Dan tambah 2 µL DCB. Ambil 2 µL
kemudian injeksikan ke dalam GC-ECD
Analisis hasil untuk membuktikan
HIPOTESIS 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
58
4. Optimasi Washing SPE
melon melon melon
Potong melon secara
kuartering dan blender
Timbang 5 gram melon
yang telah diblender
Tambahkan campuran
garam QuEChERS :
2 gram MgSO4
0,5 gram NaCl
0,5 gram Na3Sitrat
0,25 gram Na2HCitR
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
59
Tambahkan 5 ml asetonitril
Gojog 1 menit dan vortex 2 selama menit
Sentrifugasi selama 5 menit dalam 5000rpm
Ambil supernatant lapisan atas yang terbentuk.
Lakukan reekstraksi dengan 5 mL asetonitril.
Tambahkan 50 µL standar larutan A
Uapkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen
Tambahkan 0,5mL akuabides
Degassing selama 5 menit
Loading pada SPE yang telah di conditioning
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
60
B
Washing dengan
5% MeOH
Washing dengan
100 %UPW
Elusikan dengan 3
mL MeOH
Washing dengan
5% MeOH
Tampung hasil
Tampung hasil eluat
Keringkan dan larutkan dalam 200 uL heksan
tambahkan 2 uL DCB
Kemudian injeksikan eluat hasil elusi dan
tampungan washing
A
Analisis hasil kromatogram yang didapatkan
untuk membuktikan Hipotesis 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61
5. Uji Kelayakan SPE untuk Digunakan lebih dari 1 kali
melon melon melon
Potong melon secara
kuartering dan blender
Timbang 5 gram melon
yang telah diblender
Tambahkan campuran
garam QuEChERS :
2 gram MgSO4
0,5 gram NaCl
0,5 gram Na3Sitrat
0,25 gram Na2HCitR
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
62
Tambahkan 5 ml asetonitril
Gojog 1 menit dan vortex 2 selama
menit
Sentrifugasi selama 5 menit
dalam 5000rpm
Ambil 5 ml supernatant lakukan
reekstraksi
Uapkan di atas hotplate dengan
bantuan gas nitrogen
Tambahkan 1mL akuabides
Degassing selama 5 menit
Loading pada SPE yang telah di
conditioning
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
63
Washing dengan 3 mL
akuabides
Washing dengan 3 mL
akuabides
Elusi dengan 3 mL metanol
Tamping eluat dan keringkan diatas
hotplate dengan gas nitrogen
Cuci SPE dengan 30 mL metanol
dan 10 mL akuabides
Loading sampel ke-2 dan 3
dengan langkah seperti diatas
Larutkan sampel dalam 200 uL
heksan kemudian injeksikan ke GC-
ECD dan analisis kromatogram
Dan analisis hasil
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
64
BAB IV
PEMBAHASAN
Penelitian yang berjudul “Validasi Metode Analisis Residu Difenokonazol
pada Buah Melon (Cucumis melo L.)” dilakukan untuk membuktikan bahwa metode
ini dapat digunakan untuk analisis difenokonazol dengan dasar QuEChERS (Quick
Easy Cheap Effective Rugged And Safe). Metode ini merupakan hasil modifikasi dari
metode analisis baku AOAC 2007.01 yang merupakan metode analisis multi residu
dengan dasar preparasi sampel QuEChERS. QuEChERS sendiri merupakan ekstraksi
dengan asetonitril, clean-up dengan SPE yang didispersikan kedalam ekstrak dan
karena kesetimbangan yang terjadi pada dispersive SPE hanya satu kali diperlukan
suatu instrumen yang selektifitasnya tinggi untuk determinasi yaitu LC MS/MS.
Determinasi menggunakan LC MS/MS menjadi kendala untuk menerapkan metode
ini di Indonesia. Pada umumnya laboratorium tresida pestisida di Indonesia tidak
memiliki instrumen tersebut, juga alternatif metode baku analisis residu
difenokonazol dalam buah melon belum tersedia hingga saat ini. Salah satu tujuan
penelitian ini adalah untuk mengatasi masalah tersebut yaitu dengan melakukan
modifikasi pada tahapan cleanup dan instrumen untuk determinasinya. Difenokonazol
merupakan suatu senyawa yang memiliki banyak atom klorida, oksida, dan N dengan
elektronegativitas yang tinggi yang dapat dideteksi dengan GC-ECD, sehingga
instrumen GC-ECD digunakan untuk mendeterminasi residu pestisida difenokonazol
dalam buah melon. GC-ECD kurang selektif apabila dibandingkan dengan LC
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
65
MS/MS, sehingga perlu adanya suatu penyesuaian, terutama pada tahap clean-up.
Clean-up dengan SPE kolom dapat memberikan kesetimbangan yang jauh lebih
banyak sehingga ekstrak yang didapat lebih bersih.
Penelitian ini dimulai dari uji kesesuaian sistem GC-ECD diikuti dengan
optimasi preparasi sampel kemudian dilanjutkan dengan validasi penuh metode
analisis.
Gambar 4. Struktur difenokonazol
(EFSA, 2011).
A. Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD
1. Optimasi instrumen GC-ECD
Optimasi Instrumen ini dilakukan untuk mengetahui dan mendapatkan
kondisi optimum dari instrumen GC-ECD yang akan digunakan, sehingga
instrumen mampu memisahkan analit target dari koekstraktan matriks yang
menggganggu. Parameter yang dioptimasi meliputi penetapan tipe kolom yang
digunakan, tekanan gas/kecepatan alir (flow rate) gas pembawa baik pada kolom,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
66
detektor, inlet kolom, suhu injektor, kolom, oven dan detektor. Pada penelitian ini
gas pembawa yang digunakan adalah nitrogen dengan kualitas Ultra High Pure
(UHP) dengan tipe kolom C18. Berdasarkan optimasi yang dilakukan, didapatkan
kondisi GC-ECD yang optimal sebagai berikut :
Tabel III. Hasil optimasi kondisi GC-ECD
Parameter Kondisi optimum
1. Injector (split)
Suhu injector 230ºC
Volume injector 2uL
2. Oven
Panjang kolom 12-50 m
Fase diam 5%-phenyl-methylpolysiloxane
Temperature Terprogram 100 C (3 menit)
30ºC/menit, 245ºC (30 menit)
30ºC/menit, 260ºC(15 menit)
3. Detektor
Detektor ECD63
Ni
Suhu detektor 295ºC
4. Gas
Gas N2 UHP
Flowrate gas 1mL/menit
2. Kinerja instrumen GC-ECD
Instrumen GC-ECD yang telah optimal akan menghasilkan kinerja yang
optimum. Penentuan kinerja GC-ECD baik secara kualitatif maupun kuantitatif
ditunjukkan melalui kromatogram yang dihasilkan. Kromatogram memberikan
informasi berupa puncak-puncak senyawa-senyawa yang ada dalam matriks, dari
hasil tersebut diharapkan instrumen mampu memisahkan antara puncak senyawa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
67
difenokonazol dengan koekstraktan matriks. Berikut kromatogram hasil kinerja GC-
ECD yang diperoleh pada penelitian ini:
a. Kinerja Pemisahan dengan GC-ECD
Gambar 5. Kromatogram kurva baku difenokonazol dalam
pelarut heksan
Gambar 5 menunjukan bahwa instrumen mampu memisahkan
difenokonazol dari senyawa lainnya. Kinerja pemisahan dengan GC-
ECD dapat dievaluasi berdasarkan nilai N, Rs, dan TF yang
dihasilkan. Berikut tabel nilai rata-rata yang didapat dari hasil 6 kali
penginjekan standar dengan konsentrasi yang sama:
DC
B
Difen
ok
on
azo
l
Azo
xy
strob
in
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
68
Tabel IV. Nilai rata-rata N, Rs, dan TF puncak baku difenokonazol
Parameter Nilai rata-rata
N 42500,088
Rs awal 11,423
Rs akhir 6,809
TF 0,833
Nilai rata-rata N dalam Tabel IV diperoleh dengan
menginjeksikan sebanyak enam kali standar difenokonazol dalam
pelarut heksan dengan konsentrasi 0,526 µg/mL ke sistem GC-ECD.
Jumlah lempeng teoritis (N) menggambarkan jumlah kesetimbangan
yang terjadi dalam sebuah kolom. Semakin tinggi nilai N, semakin
banyak kesetimbangan yang terjadi di dalam kolom. Menurut Grob,
nilai jumlah plat teoritik (N) yang dipersyaratkan adalah lebih dari
7000. Nilai rata-rata yang didapat pada penelitian ini lebih dari 7000
yaitu sebesar 42500,088 sehingga diharapkan frekuensi terjadinya
kesetimbangan analit dalam fase diam dan fase gerak dapat
memungkinkan tercapainya pemisahan difenokonazol secara
sempurna.
Resolusi (Rs) merupakan perbedaan antara waktu retensi 2
puncak yang saling berdekatan dibagi dengan rata-rata lebar puncak.
Sistem GC-ECD dapat dikatakan memiliki kinerja pemisahan yang
baik apabila dapat memberikan nilai Rs <1,5 . Pada Rs lebih dari 1,5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
69
, GC-ECD mampu memberikan pemisahan puncak yang baik. Nilai
Rs yang diperoleh pada penelitian ini adalah sebesar 11,423 untuk
resolusi awal dan 6,809 untuk resolusi akhir. Resolusi awal ialah
rasio puncak difenokonazol dengan puncak terdekat yang memiliki
tR sebelum puncak difenokonzole (puncak DCB), sedangkan
resolusi akhir ialah rasio puncak difenokonazol dengan puncak
terdekat yang memiliki tR setelah puncak difenokonazol (puncak
azoxystrobin). Berdasarkan hasil resolusi awal dan akhir seperti
yang telah ditunjukan pada tabel di atas, dapat dikatakan bahwa
sistem GC-ECD dalam penelitian memiliki kinerja pemisahan yang
baik.
Puncak yang memberikan nilai TF>1 menunjukan bahwa
puncak tersebut mengalami pengekoran (tailing). Semakin besar
harga TF maka kolom yang dipakai semakin kurang efisien. Pada
penelitian ini diperoleh nilai TF rata-rata sebesar 0.833 sehingga
dapat dikatakan bahwa efisiensi kolom sistem GC-ECD untuk
analisis senyawa difenokonazol cukup baik.
Pada kromatogram di atas senyawa difenokonazol
muncul sebagai puncak pada tR 25,88 dan 25,708. Hal ini karena
difenokonazol memiliki sifat diastereoisomer cis dan trans dengan
dua cincin C kiral pada strukturnya (EFSA,2011). Adanya dua
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
70
isomer yang memiliki cincin C kiral ini menyebabkan struktur
difenokonazol dapat berputar untuk mencapai posisi stabil. Dua
isomer yang berbeda ini memiliki sifat fisika kimia yang berbeda
dan akan terdeteksi oleh ECD pada tR yang berbeda
(Fessenden,1986).
Pada analisis residu pestisida tidak jarang ditemukan suatu
senyawa yang memiliki multi-peak. Kuantifikasi senyawa multi-
peak seperti difenokonazol dapat dilakukan dengan menggunakan
AUC peak terbesar atau dengan menjumlahkan AUC kedua peak
(USDA,2015). Pendekatan yang lebih sering dilakukan ialah dengan
menjumlahkan AUC peak difenokonazol yang muncul untuk
memperoleh residu keseluruhan. Pendekatan ini lebih sering
diterapkan untuk meminimalkan kesalahan kuantifikasi (Cajka,
2007). Pada penelitian ini kuantifikasi dilakukan dengan
menjumlahkan AUC dua peak difenokonazol yang muncul.
b. Kinerja instrumen GC-ECD secara Kualitatif
Kinerja instrumen GC-ECD secara kualitatif dapat dilihat dari
parameter %RSD dan keajegan tR serta luas area difenokonazol.
CCPR menyatakan bahwa spesifikasi persyaratan untuk %RSD>20%.
Hasil %RSD dalam penelitian ini memenuhi spesifikasi persyaratan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
71
Tabel V. Nilai %RSD
Kadar (ng)
Rasio
difenokonazol/DCB
Rasio AUC
difenokonazol/DCB
0.789
1,208 1,538
1,219 1,317
1,218 1,575
1,224 1,821
1,208 1,538
Rata-rata 1,215 1,558
SD 0,007 0,179
%RSD 0,591 11,514
c. Kinerja instrumen GC-ECD secara Kuantitatif
Pada penelitian ini evaluasi optimasi uji kesesuaian sistem juga
dilakukan untuk kinerja instrumen GC-ECD secara kuantitatif.
Evaluasi ini dilakukan dengan menghitung nilai koefisien korelasi
untuk linearitas, kisaran linearitas, slope, IDL untuk sensitivitas,
presisi area standar/standar internal dan %CV untuk akurasi.
Parameter-parameter tersebut diperoleh dari seri kurva baku solven.
1) Linearitas
Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva
kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi
(x). Kurva baku untuk mencari linearitas dalam penelitian ini
menggunakan kurva baku solven yang menghubungkan antara respon
yang berupa rasio luas puncak difenokonazol/standar internal (DCB)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
72
(y) dengan konsentrasi difenokonazol yang diinjeksikan (x). Besarnya
konsentrasi yang akan diukur berbeda-beda yaitu dimulai dari 0,105-
1,052 ng sesuai kisaran sampel yang akan ditetapkan dan ditambah
standar internal dekaklorobifenil (DCB) dengan konsentrasi 0,0001
mg/mL. Penambahan standar internal dekaklorofenil (DCB) dilakukan
secara konstan yaitu 1 µL dalam 100 µL. Dekaklorofenil (DCB)
berperan sebagai faktor koreksi kesalahan yang terjadi dalam sistem
GC-ECD. Data yang diperoleh kemudian diolah sehingga didapatkan
hasil akhir berupa persamaan regresi linear dengan R2 sebesar 0,999
seperti pada gambar berikut ini :
Gambar 6. Kurva baku solvent antara rasio luas puncak
difenokonazol/DCB vs kadar difenokonazol
Batas nilai R2 yang dipersyaratkan dalam uji kategori
impurities, yaitu ≥0.9900 pada kadar maksimum 1 ppb (AOAC, 2005).
y = 2.1034x + 0.0135 R² = 0.9995
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200
rasi
o lu
as p
un
cak
dif
eno
con
azo
le/s
tan
dar
inte
rnal
kadar yang ditambahkan (ng)
Difenokonazol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
73
Berdasarkan pada hasil penelitian diatas metode hasil modifikasi
QuEChERS ini memiliki linearitas yang cukup baik.
2) Sensitivitas
Sensitivitas suatu sistem GC-ECD dinyatakan dalam nilai
sebuah Instrument Detection Limit (IDL). IDL didefinisikan sebagai
konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi,
meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sinyal yang berbeda
signifikan dari blanko adalah intersep+3s intersep, oleh karena itu
nilai IDL difenokonazol dalam penelitian ini adalah konsentrasi
difenokonazol yang memberikan sinyal sebesar intersep + 3s intersep.
Pada penelitian ini nilai IDL diperoleh dari 3 kurva baku dengan 7
konsentrasi terendah. Kurva baku pada kisaran linearitas 0,053-0,526
ng memiliki nilai IDL sebesar 0,01 g/g.
Tabel VI. Uji sensitivitas
Replikasi Persamaan Linearitas Sa0 Slope
(b)
IDL
(ng/µL)
I F(x) = 0,15707 + 3,03655
x
0,997 0,0297 3,037 0,015
II F(x) = 0,02169 + 2,06485
x
0,999 0,0132 2,065 0,010
III F(x) = -0,07459 + 3,78718 x 0,890 0,183 3,787 0,072
Instrument Quantitation Limit merupakan konssentrasi terkecil
dari kurva baku. IQL dapat diterima keterulangannya dengan nilai
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
74
%RSD<20%. GC-ECD pada penelitian ini memiliki kemampuan
mendeteksi nilai IQL sebesar 0,053 ng.
3) Presisi
Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis yang
diekspresikan sebagai simpangan baku relative dari sejumlah sampel
yang berbeda signifikan secara statistik. Nilai presisi secara kuantitatif
dinyatakan dalam suatu nilai Respon Faktor, dalam penelitian ini
antara rasio jumlah luas area puncak difenokonazol/standar internal
(DCB) dengan konsentrasi standar difenokonazol. Berikut ini adalah
hasil presisi dari masing-masing dalam penelitian ini :
Tabel VII. Nilai Response factor
Kadar
(ng)
Nilai RF
R1 R2
0,053 5,236 2,156
0,105 4,763 2,214
0,158 3,861 2,393
0,210 3,936 2,185
0,263 3,849 2,097
0,368 3,369 2,155
0,526 3,317 2,088
0,789 3,527 2,123
1,052 3,656 2,122
Rata-
rata 3,946 2,170
SD 0,646 0,093
%RSD 16,367 4,273
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
75
Suatu metode dapat dikatakan baik jika memiliki presisi % RF
<20% pada konsentrasi maksimum 1ppb (CCPR,2003). Berdasarkan
literatur tersebut, presisi penelitian ini dapat diterima dan dikatakan
cukup baik.
4) Akurasi
Kedekatan hasil injeksi antara larutan standar kurva baku
dengan nilai sebenarnya yang digunakan untuk melihat akurasi dalam
penelitian ini dinyatakan dalam percent difference (%D). Syarat
Percent Difference dapat dinyatakan baik apabila nilainya ≤20%
(United State Departement of Agriculture Agricultural Marketing
Service, Sciene & Technology Pesticide Data Program,) Nilai %D
menggambarkan perbedaan antara % analit terukur dengan analit yang
sebenarnya dari sampel. Hasil % D dalam penelitian ini diperoleh :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
76
Tabel VIII. Nilai %D
Kadar
(ng)
Kadar yang
ditemukan
(ng)
% D
0,053 0,044 15,568
0,105 0,102 2,757
0,158 0,172 9,216
0,210 0,212 0,808
0,263 0,257 2,461
0,368 0,374 1,532
0,526 0,521 0,896
0,789 0,801 1,495
1,052 1,071 1,788
Rata-rata
1,497
SD
0,608
%RSD
0,407
Berdasarkan pada tabel VI di atas, nilai %D difenokonazol masuk
kriteria persyaratan yaitu %D < 20% .
Kesimpulan : Berdasarkan pada nilai presisi, akurasi, kisaran dan
linearitas kurva baku serta IDL dan IQL yang dicapai, GC-ECD dapat
digunakan dalam penetapan kadar residu fungisida difenokonazol.
B. Preparasi Sampel dengan Metode QuEChERS
Preparasi sampel merupakan tahapan penting dalam suatu analisis. Optimasi
pada tahapan preparasi sampel perlu dilakukan dengan tujuan mendapatkan hasil
optimal. Pada penelitian ini optimasi dilakukan terhadap cara kerja preparasi matriks
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
77
sampel melon dengan metode modifikasi QuEChERS dan optimasi fase diam SPE
C18.
1. Optimasi ekstraksi matriks buah melon
a. Pengecekan kadar air dalam buah melon
Suatu sampel yang digunakan dalam suatu penelitian harus memiliki
kesempatan yang sama untuk dijadikan sampel, sehingga sampling dilakukan
secara acak. Sampel yang dimaksud dalam penelitian ini adalah buah melon
dari beberapa pasar di Yogyakarta. Sampling analytical portion untuk buah
melon dilakukan dengan metode kuartering dan dihomogenkan dengan
blender.
Tujuan dari pengecekan kadar air dalam buah melon adalah untuk
menentukan perlu atau tidaknya tambahan air dalam proses homogenisasi
sampel dengan blender. Proses preparasi sampel dengan metode QuEChERS
mempersyaratkan bahwa kadar air harus >80% tidak diperlukan tambahan air
(Anastasiades). Pada penelitian ini kadar air yang terkandung dalam buah
melon sangat tinggi yaitu lebih dari 90% sehingga tidak perlu adanya
penambahan air dalam homogenisasi sampel.
Tabel IX. Kadar air dalam buah melon
Awal (gram) Berat akhir setelah oven (gram) Selisih
R1 10,068 0,402 9,666
R2 10,007 0,845 9,162
Rata-rata 9,378
% kadar air 93,78%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
78
1) Ekstraksi dan clean-up dengan metode modifikasi QUECHERS
Metode yang digunakan untuk preparasi sampel pada penelitian ini
adalah metode QuEChERS yaitu ekstraksi dengan pelarut asetonitril dan
campuran garam QuEChERS, clean-up dengan SPE yang didispersikan ke
dalam ekstrak dan dideterminasi.
Pada metode QuEChERS, garam-garam yang digunakan adalah
Magnesium sulfat, Natrium Klorida, Natrium Sitrat dan disodium sitrat
hydrogenate sesquihydrate. Masing-masing garam memiliki kegunaan
yang berbeda, magnesium sulfat anhidrat berfungsi untuk menarik air,
natrium klorida berfungsi sebagai agen salting out effect, sedangkan
natrium sitrat dan disodium sitrat hydrogenate seshydrate ditambahkan
untuk mengontrol pH antara 4-6 (Leung phenoomenex,2012-UCT).
pH sampel dijaga antara 4-6, hal ini dkarenakan pada kisaran pH
4-6 jumlah koekstraktan dalam hasil ekstraksi lebih sedikit dibandingkan
dengan jumlah koekstraktan pada raw material.
Sampel yang telah ditambahkan garam dalam tabung sentrifuge
ditambahkan pelarut asetonitril kemudian di gojog dan di vortex.
Penggojogan bertujuan untuk memecah gumpalan matriks sampel untuk
memperoleh luas permukaan yang besar sehingga kesetimbangan yang
optimum akan lebih mudah tercapai.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
79
Sampel memiliki partikel dengan ukuran dan berat jenis yang
bebeda-beda, untuk memisahkan senyawa yang memiliki ukuran dan
berat jenis yang berbeda dilakukan sentrifugasi. Optimasi sentrifugasi
perlu dilakukan untuk mendapatkan waktu dan kecepatan sentrifugasi
yang optimum.Pada penelitian ini optimasi sentrifugasi dilakukan pada
kecepatan 5000 rpm selama 5, 10.Dan 15 menit. Hasil akhir menunjukan
bahwa selisih supernatan yang terbentuk dari 3 waktu yang berbeda diatas
tidak berbeda signifikan, sehingga waktu yang paling singkat yaitu 5
menit yang digunakan untuk preparasi sampel selanjutnya.
Tabel X. Hasil optimasi lama sentrifugasi
Waktu sentrifugasi
dalam 5000 rpm (menit)
Jumlah supernatant
(mL)
5 4,0
10 4,0
15 4,2
Ada 3 lapisan yang terbentuk setelah sampel disentrifugasi,
berdasarkan berat jenisnya asetonitril (0,789 g/cm3) berada pada
lapisan yang paling atas sedangkan air (1 g/cm3) berada di lapisan
bawah. Difenokonazol memiliki kelarutan yang cukup tinggi dalam air
yaitu 15 mg/L sehingga untuk mengurangi kelarutannya dalam air
sampel ditambahkan garam NaCl yang berfungsi untuk memberikan
salting out effect. Lapisan asetinitrik diambil untuk di analisis
selanjutnya. Pada penelitian ini dilakukan reekstraksi sampel untuk
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
80
mengantisipasi tertinggalnya analit difenokonazol karena masih
tertahan di dalam matriks sampel. Reekstraksi bertujuan
memaksimalkan ekstraksi analit, sehingga %recovery yang diperoleh
lebih baik. Total supernatan yang diperoleh dari 5 gram sampel
tersebut dikeringkan dengan nitrogen untuk kemudian di clean-up
dengan SPE C18 dan dideterminasi dengan GC-ECD.
a. Optimasi Clean-up dengan SPE C18
Melon merupakan matriks yang kompleks, sebagian besar
kandungan melon bersifat polar salah satu contohnya vitamin C
dan karbohidrat. Senyawa yang menjadi analit target pada
penelitian ini adalah difenokonazol. Clean-up menjadi salah satu
tahapan penting untuk meminimalisir kandungan matriks yang
mengganggu analit target. Clean-up merupakan praperlakuan
sampel yang bertujuan untuk memisahkan analit dari komponen-
komponen matriks yang mungkin menggangu pada saat
pengukuran atau deteksi analit. Clean-up dalam penelitian ini
menggunakan SPE C18 sistem fase terbalik. Clean-up dengan
metode Solid Phase Extraction (SPE) praktis dan hemat pelarut
(Watson,1999). Strategi yang digunakan dalam penelitian ini
diharapkan fase gerak atau pelarut mampu menahan semua residu
analit difenokonazol dalam sebuah SPE C18 dengan ikatan lemah
sehingga analit dapat terelusi. Senyawa-senyawa yang cenderung
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
81
lebih polar akan ikut terelusi dengan fase gerak. Akuabides
digunakan sebagai fase gerak saat washing sedangkan metanol
digunakan sebagai fase gerak saat elusi. Berdasarkan pada sifat
fisika-kimia, difenokonazol memiliki kelarutan sebesar 15 mg/L
di dalam air sedangkan dalam metanol sebesar 500 g/L, yang
berarti kelarutannya lebih tinggi dalam metanol.
Optimasi clean-up yang dilakukan dalam penelitian ini
adalah optimasi penentuan kapasitas SPE C18, washing dan elusi
SPE C18.
a) Penentuan kapasitas SPE C18
Penentuan kapasitas SPE C18 yang akan digunakan
dalam penelitian dilakukan dengan menimbang berat
ekstrak untuk setiap 1 ml. Hasil penimbangan tersebut
didapatkan bahwa 1 ml sampel yang telah dikeringkan
dalam oven, memiliki bobot sebesar 2,5 mg. Persyaratan
yang harus dipenuhi yaitu bahwa sampel yang akan
diloadingkan ke dalam SPE tidak boleh 5% melebihi berat
catdrige, sehingga SPE yang digunakan dalam penelitian
ini adalah harus lebih dari 50 mg. Semakin besar SPE yang
digunakan kapasitas efisiensi penjerapan analit semakin
besar. Penelitian ini menggunakan SPE C18 denga berat
400 mg.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
82
Tabel XI. Penentuan kapasitas SPE (Sigmaaldrich).
Bobot
sampel
Volume SPE Minimum
volume eluat
Kapasitas SPE
yang
digunakan
50-100 mg 1 mL 100-200 uL 2,5-10 mg
500mg 3 mL 1-3 mL 25-100 mg
0,5-0,1 g 6 mL 2-6 mL 25-100 mg
2 g 12 mL 10-20 mL 0,1-0,2 g
5 g 20 mL 20-40 mL 1,25-2,5 g
10 g 60 mL 40-100 mL 0,5-1 g
Berdasarkan pada optimasi uji kualitatif pencucian
SPE, SPE layak untuk digunakan berulang sebanyak 3 kali
dengan syarat setiap kali selesai pemakaian, SPE dicuci
dengan 10 ml metanol dan 10 ml akuades. Berikut ini
adalah data dari penentuan kapasitas SPE C18:
Tabel XII. Optimasi penentuan kapasitas SPE C18
R1 R2 R3 R4 Rata-rata (gram)
Berat awal
zat(gram/ml)
0,793 0,788 0,796 0,792
Berat setelah
oven (gram)
0,003 0,003 0,003 0,001 0,0025
b) Optimasi washing SPE C18
Optimasi SPE C18 juga dilakukan pada tahap washing.
Fraksinasi washing dilakukan dengan memvariasi pelarut
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
83
yang digunakan yaitu 5% MeOH dan 100% UPW. Pada
fraksinasi dengan pelarut 5% MeOH sampel diadisi dengan
2 µl larutan standar intermediet A. Berikut grafik luas
puncak (AUC) difenokonazol dengan hasil optimasi
washing dengan pelarut 5% MeOH dan 100% UPW:
Gambar 7. Luas puncak difenokonazol yang diperoleh dari hasil
Fraksinasi setelah washing dengan 5% MeOH (washing 1) vs 100% UPW
(washing 2)
Diagram diatas menjelaskan bahwa eluat setelah washing
dengan 5% MeOH menghasilkan luas puncak yang lebih
kecil dibandingkan washing dengan 100% UPW.Artinya
senyawa pada saat washing dengan 5% MeOH, analit
difenokonazol banyak yang hilang ikut tercuci sehingga
saat diinjeksikan eluat menghasilkan respon luas puncak
1 2
AU
C
fraksinasi setelah washing
160506 568132,5
Washing 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
84
yang lebih rendah dibandingkan dengan eluat setelah
washing menggunakan 100% UPW.
c) Optimasi elusi SPE C18
Optimasi elusi SPE C18 dilakukan dengan fraksinasi
menggunakan pelarut metanol dan konsentrasi adisi 2µL
larutan standar stok A yang memiliki konsentrasi sebesar
0,526 g/L. Berikut grafik fraksinasi elusi dengan pelarut
metanol :
G
Gambar 8. Luas puncak hasil elusi difenokonazol
dalam SPE C18 per mL metanol
1 2 3 4 5
AU
C
jumlah Metanol untuk elusi (ml)
342216,75 336295
82787 0 30562,5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
85
Gambar diatas menjelaskan bahwa dengan 3 mL
pelarut MeOH sudah cukup untuk mengelusi analit yang
diharapkan.
d) Optimasi kelayakan penggunaaan SPE secara berulang
Penggunaan SPE berulang dalam penelitian ini
didasarkan pada hasil optimasi yang menyatakan bahwa
SPE C18 400 gram dapat digunakan tidak lebih dari tiga
kali. Optimasi dilakukan dengan mengaplikasikan standar
difenokonazol 0,789 ng ke dalam sebuah SPE yang sama
sebanyak tiga kali. Tujuan dari optimasi ini adalah untuk
melihat %perolehan kembali. Diharapkan bahwa
penggunaan SPE berulang tidak mempengaruhi perolehan
kembali dari masing-masing sampel.
Tabel XIII. %Recovery optimasi kelayakan penggunaan
SPE berulang
Massa
(ng)
AUC
DCB
AUC
difenokonazol Ratio % Recovery % Kesalahan
0,789 16110,5 30015,1 1,863 110,743 10,74292
0,789 20158,1 36603,9 1,816 109,349 9,349369
0,789 25368,2 46977,3 1,852 107,309 7,309574
Rata-Rata 1,8437 109,134 9,133954
SD 1,727
% RSD 1,583
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
86
Berdasarkan pada data diatas didapatkan % kesalahan
≤20% yang berarti bahwa data optimasi memenuhi kriteria
persyaratan dan bahwa SPE dapat digunakan 3 kali
(AOAC,2005).
Hasil optimasi clean-up dengan SPE C18 pada
penelitian ini adalah sebagai berikut:
Tabel XIV. Hasil optimasi clean-up SPE C18
Optimasi Hasil
Kapasitas SPE C18 ≥ 50 mg, yang digunakan 400
mg
Washing SPE 5 mL akuades
Elusi SPE 3 mL metanol
C. Validasi Metode Analisis
Validasi metode adalah serangkaian proses yang dilakukan untuk
membuktikan bahwa metode analisis memenuhi persyaratan yang telah ditentukan,
yang sesuai dengan tujuan penggunaannya. Kriteria validasi metode analisis residu
pestisida untuk suatu modifikasi metode analisis yang sudah ada adalah LOD, LOQ,
recovery dalam penelitian ini recovery ekstraksi maupun clean-up, determinasi analit
dan kisaran kalibrasi (CCPR,2014).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
87
Pada penelitian ini parameter validasi metode yang diukur adalah linearitas,
kisaran linearitas, selektivitas, sensitivitas, akurasi, presisi, dan LOQ. Kinerja clean-
up dan GC-ECD dievaluasi dalam penelitian ini. Clean-up dilakukan dengan
menggunakan SPE C18, untuk menguji kinerja clean-up SPE C18 yang telah
teroptimasi dilakukan adisi pada ekstrak blanko melon sebelum dilakukan SPE dalam
penelitian ini disebut Adisi B. Selanjutnya untuk menguji kinerja GC-ECD dalam
menetapkan difenokonazol dalam matriks ekstrak melon bersih ( setelah melalui
clean-up SPE C18) dilakukan adisi standar pada ekstrak bersih pada penelitian ini
disebut adisi C. Apabila kedua uji ini memenuhi persyaratan % recovery yang
dipersyaratkan dalam CCPR yaitu 70-120%, dilakukan penetapan akurasi pada
metode analisis ini. Pada penelitian ini LOQ metode teroptimasi ditetapkan pada
konsentrasi terendah yang telah memenuhi kriteria akurasi dan presisi.
1) Adisi C
Penambahan standar adisi ekstrak melon setelah clean-up dilakukan dan
tepatnya sebelum sampel diinjeksikan ke dalam GC. Adisi jalur C bertujuan untuk
menguji kinerja GC-ECD dalam menetapkan difenokonazol dalam matriks
ekstrak buah melon.Berdasarkan pada kromatogram hasil injeksi sampel yang
diadisi, puncak difenokonazol dapat terpisah secara sempurna dari senyawa-
senyawa koekstraktan matriks yang mengganggu. Secara kuantitatif melihat
presisi dan akurasi dari kinerja GC-ECD pada adisi jalur C, nilai recovery standar
yang ditambahkan dan %D dihitung.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
88
Tabel XV. Nilai %Recovery dan %D metode adisi C
Kadar yang ditmbahkan
(ng) Recovery
I Recovery
II Recovery
III Rata-rata Recovery %Kesalahan
0,158 66,957 87,274 104,076 86,102 13,898
0,263 81,126 73,215 107,023 87,121 12,879
0,368 85,421 68,960 119,607 91,329 8,671
0,526 85,161 64,120 115,857 88,380 11,620
0,684 84,574 66,968 112,946 88,162 11,838
Tabel XVI. Nilai %D metode adisi C
Kadar yang
ditambahkan
(ng) Replikasi I Replikasi II Replikasi III
0,158 8,462 17,648 13,491
0,263 5,890 2,365 0,152
0,368 3,017 1,487 2,578
0,526 2,607 6,888 5,088
0,684 6,082 1,486 9,857
1) Adisi B
Pada adisi jalur B, adisi ekstrak melon dilakukan sebelum clean-up
dengan SPE C18. Tujuan dari adisi jalur B adalah untuk menguji kinerja clean-
up dengan kolom SPE C18. Kinerja clean-up dengan kolom SPE C18 dapat
dievaluasi dengan nilai recovery kadar yang ditambahkan dan %D yang
menggambarkan akurasi dan presisi dari adisi jalur B.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
89
Tabel XVII. Nilai %Recovery metode adisi B
Massa
(ng)
Recovery
I
Recovery
II
Recovery
III
Rata-rata
Recovery %kesalahan
0,105 81,001 111,599 131,955 108,185 8,185
0,158 69,174 115,640 131,309 105,375 5,375
0,263 91,151 134,959 113,055 13,055
0,368 106,512 112,022 133,738 117,424 17,424
0,526 114,330 120,759 130,603 121,897 21,897
Tabel XVIII. Nilai %D metode adisi B
Massa
(ng) Replikasi I Replikasi II
Replikasi
III
0,105 20,261 5,381 6,301
0,158 8,512 0,784 2,437
0,263 8,090 4,029
0,368 3,478 10,569 4,544
0,526 2,781 6,052 3,134
0,684 3,559 8,682 0,749
2) Adisi A
Pada adisi jalur A, adisi dilakukan sebelum sampel di clean-up dengan
SPE C18. Tujuan dari adisi jalur A adalah untuk menguji keseluruhan proses
dari ekstraksi menggunakan QuEChERS dan kinerja clean-up dengan kolom
SPE C18. Parameter yang teroptimasi pada adisi jalur adisi A adalah akurasi dan
presisi. Berikut ini adalah tabel perolehan kembali atau %recovery dari kadar
yang ditambahkan dan % D selama proses ekstraksi berlangsung :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
90
Tabel XIX. Nilai %Recovery dan %D metode adisi A
Massa
(ng)
Recovery
I
Recovery
II
Recovery
III
Rata-rata
Recovery %Kesalahan
0,158 109,398 105,163 95,641 103,401 3,401
0,263 76,027 68,882 68,881 71,263 28,737
0,368 79,829 82,448 85,051 82,442 17,558
0,526 101,006 101,476 95,322 99,268 0,732
0,684 88,578 97,674 159,756 115,336 15,336
Massa (ng) Replikasi I
Replikasi II Replikasi III
0,158 28,198 25,193 19,320
0,263 12,010 19,238 16,663
0,368 9,949 9,854 3,845
0,526 11,129 5,828 3,871
0,684 2,921 0,557 68,208
Dari metode adisi tahap A, B, dan C dapat disimpulkan kesalahan dari
masing-masing tahap. Pada tahap A atau metode adisi untuk melihat kinerja
metode analisis sampel blanko yang di fortifikasi memiliki kesalahan ekstraksi
sebesar 0,133% pada LLMV. Pada metode tahap B, sampel blanko yang
difortifikasi sebelum clean-up memiliki kesalahan sebesar 8,753%, dan pada
tahap C memiliki kesalahan sebesar 8,670%.
a) Linearitas
Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh
hasil-hasil uji proposional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang
diberikan. Linearitas kurva baku adisi menghubungkan antara rasio
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
91
respon luas puncak difenokonazol/standar internal (DCB) sebagai
sumbu y dengan konsentrasi difenokonazol sebagai sumbu x. Hasil
plot kurva baku adisi pada kisaran linearitas 0,105-0,684 ng tersebut
diperoleh slope koefisien korelasi (r) sebesar 0,974. Menurut
Association of Official Analytical Chemist (AOAC, 2005 ) dari suatu
metode dikatakan linear apabila >0.9900. Berdasarkan pada kriteria
tersebut nilai koefisien korelasi yang didapat tidak mencapai
spesifikasi persyaratan yang telah ditetapkan oleh AOAC, hal ini
karena konsentrasi pada penelitian ini sangat kecil mencapai kadar
ppb.
Gambar 9. Linearitas kurva adisi
y = 1.0133x - 0.0034
R² = 0.9743
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.700
0.800
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800
rasi
o A
UC
/DC
B
massa (ng)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
92
b) Selektivitas
Selektivitas merupakan kemampuan untuk mengukur analit yang
dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen
lain di dalam matriks sampel. Selektivitas dilakukan untuk matriks
yang kompleks dalam hal ini matriks melon dikategorikan sebagai
matriks yang kompleks, karena di dalam matriks tersebut tidak hanya
terdapat analit target. Optimasi clean-up dengan SPE C18 dapat
meningkatkan selektivitas. Dengan optimasi clean-up, senyawa-
senyawa koekstraktan dalam matriks yang mengganggu dapat
diminimalisir sehingga difenokonazol dapat terpisah sempurna dari
senyawa-senyawa tersebut. Gambar 10 merupakan kromatogram
sampel setelah di clean-up dengan SPE C18. Terlihat bahwa pada
kromatogram sebelum clean-up puncak yang terdeteksi sangat rimbun
sedangkan pada kromatogram setelah clean-up puncak-pucak
koekstraktan matriks berkurang.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
93
Gambar 10.kromatogram kurva adisi
Adanya pemisahan yang baik puncak difenokonazol dengan impurities
lain dibuktikan dengan nilai Rs, TF, N, dan keajegan tR yang ada
dalam Tabel berikut ini :
Tabel XX. Nilai N, Rs, dan tR dari kurva adisi A
Replikasi N Rs awal Rs akhir Tr
1 358888,330 1,732 5,636 29,342
2 123879,864 1.436 4,543 28,064
3 79651,139 3,252 5,312 27,396
4 80304,476 1,211 4,186 27,506
5 63957,803 1,809 1,710 29,459
6 68941,955 1,236 4,224 30,193
d
i
f
e
n
o
k
o
n
a
z
o
l
D
C
B
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
94
c) Akurasi
Ketelitian suatu metode analisis terhadap nilai yang terukur dengan
nilai yang diperoleh atau nilai sebenarnya dapat dilihat dengan
menghitung akurasi.Standar internal DCB ditambahkan sebagai faktor
koreksi analit yang hilang. Akurasi diekspresikan dalam %recovery
atau persen perolehan kembali. Tabel XXI di bawah menunjukan hasil
%recovery pada kisaran 0,263-0,789 ng yang diperoleh dalam
penelitian ini :
Tabel XXI. Hasil % recovery pada kisaran 0,263-0,684 ng
Massa
(ng)
Recovery
I
Recovery
II
Recovery
III
Rata-rata
Recovery %Kesalahan
0,158 109,398 105,163 95,641 103,401 3,401
0,263 76,027 68,882 68,881 71,263 28,737
0,368 79,829 82,448 85,051 82,442 17,558
0,526 101,006 101,476 95,322 99,268 0,732
0,684 88,578 97,674 159,756 115,336 15,336
Persen perolehan kembali (%recovery) yang di persyaratkan menurut
CCPR yaitu 70-120%.Tabel menunjukan bahwa dari 3 replikasi diatas
%perolehan kembali senyawa residu difenokonazol memenuhi
persyaratan sehingga dapat dikatakan bahwa metode ini akurat.
d) Presisi
Presisi merupakan ukuran kedekatan anta serangkaian hasil analisis
yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran sampel dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
95
konsentrasi yang sama. Parameter presisi diekspresikan dengan %D.
Spesifikasi persyaratan %D dapat diterima apabila <20%. Hasil dari
%D yang diperoleh dalam penelitian ini disajikan dalam tabel
.Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa metode hasil
modifikasi QUEChERS memiliki presisi yang baik.
Tabel XXII. Hasil %D
Massa (ng) Replikasi I
Replikasi II Replikasi III
0,158 28,198 25,193 19,320
0,263 12,010 19,238 16,663
0,368 9,949 9,854 3,845
0,526 11,129 5,828 3,871
0,684 2,921 0,557
e) Sensitivitas
Limit of Quantification (LOQ) didefinisikan sebagai konsentrasi analit
terendah dalam sampel yang dapat dideteksi. LOQ menunjukan
sensitivitas dari suatu sistem GC-ECD. Semakin kecil LOQ maka
dapat dikatakan bahwa GC-ECD memiliki sensitivitas yang semakin
tinggi.
Konsentrasi difenokonazol yang harus terdeteksi dalam penelitian ini
adalah setengah dari nilai Batas Minimum Residu (BMR)
difenokonazol yang diketahui yaitu 0,035mg/kg (Codex,2014),
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
96
sehingga LOQ sistem GC-ECD harus lebih rendah dari konsentrasi
tersebut. LOQ yang didapat dalam penelitian ini adalah 0,002 µg/g.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
97
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Asetonitril mampu menjadi pelarut organik dalam proses ekstraksi
difenokonazol dalam buah melon, dengan kesalahan ekstraksi 0,133 pada
LLMV 7,364 ng/g.
2. SPE C18 merupakan metode clean-up yang baik dalam memisahkan
difenokonazol pada matriks buah melon. Recovery fortifikasi sebelum clean-
up dengan kolom SPE C18 113-121% dengan kesalahan 8,753% pada
LLMV.
3. Validasi metode analisis yang dilakukan pada sampel blanko dan sampel
yang di fortifikasi dilakukan pada instrument yang teroptimasi.
a. Kinerja kuantitasi GC teroptimasi adalah rata-rata %D<20%, linearitas
0,890-0,999 pada kisaran 0,053-0,526 ng, dengan IDL 0,01– 0,07ng/mL
dan IQL 1,06 ng/g.
b. Kinerja GC pada ekstrak blanko yang di fortifikasi pada kadarr 0,158-
0,684 ng sebelum diinjeksikan menghasilkan recovery sebesar 86-91%,
dengan kesalahan 8,670% pada LLMV.
c. Kinerja metode analisis sampel blanko yang difortifikasi 0,158-0,684 ng
memberikan recovery pada kisaran 71-115% dan LOQ 0,002 g/g.
Dengan demikian validasi metode analisis ini memenuhi spesifikasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
98
persyaratan untuk memantau kadar residu difenokonazol dalam buah
melon dibawah Batas Minimum Residu (BMR) yang diperbolehkan yaitu
0,7 mg/kg.
B. Saran
1. Perlu membandingkan hasil proses ekstraksi jika menggunakan PSA.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Certificate of Analysis Product Name: DECACHLOROBIPHENYL
purum p.a., >= 99.0 % T Product Number: 442537 Batch Number: WEBC0771Q Brand: Sigma-Aldrich CAS Number: 2051-24-3 Formula: C12Cl10 Formula Weight: 498,66 Quality Release Date: 23 OCT 2013 TEST SPECIFICATION RESULT APPEARANCE (COLOR) COLORLESS WHITE APPEARANCE (FORM) SOLID SOLID MELTING POINT >290,0°C >290,0 °C FLASH POINT >100,0 °C >100,0 °C
Dr. Claudia Geitner Manager Quality Control Buchs, Switzerland
Sigma-Aldrich warrants that at the time of the quality release or subsequent retest date this product conformed to the information contained in this publication. The currentspecification sheet may be available at Sigma-Aldrich.com. For further inquiries, please
contact Technical Service.Purchaser must determine the suitability of the productfor its particular use. See reverse side of invoice or packing slip for additional terms and conditions of sale.
Sigma-Aldrich Certificate of Analysis - Product 71635 Lot BCBM0371V
Page 1 of 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
108
Lampiran 4. Certificate of Analysis Asetonitril
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
109
Lampiran 5. Certificate of Analysis Heksan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
110
Lampiran 6. Certificate of Analysis Metanol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
111
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
112
Lampiran 7. Certificate of Analysis Magnesium Sulfat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
113
Lampiran 8. Certificate of Analysis Na2Hsitrat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
114
Lampiran 9. Certificate of Analysis Na3Sitrat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
115
Lampiran 10. Certificate of Analysis NaCl
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
116
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
117
Lampiran 11 . Certificate Of Analysis Formulasi Difenokonazol Donasi dari
PT Syngenta
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
118
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi berjudul “Validasi Metode Analisis Residu
Difenokonazol Pada Buah Melon (Cucumis melo L.)”
memiliki nama lengkap Florentina Silviana Devi. Penulis
dilahirkan di Pajar mataram Lampung pada tanggal 26
Juni1992 sebagai anak pertama dari dua bersaudara, dari pasangan Lukas
Sumari dan Katarina Katrin. Pendidikan formal yang pernah ditempuh oleh
penulis yaitu di TK Fransiskus Xaverius Pajar Mataram Lampung Tengah
(1997-1999), SD Negeri 3 Pajar Mataram Lampung Tengah (1999-2005),
SMP Negeri 2 Qurnia Mataram Lampung Tengah (2005-2008), SMA
Xaverius Pringsewu Lampung (2008-2011). Penulis melanjutkan
pendidikannya di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tahun
2011. Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma penulis aktif dalam berbagai kegiatan dan organisasi, antara lain
Pelepasan Wisuda Fakultas Farmasi „‟ Membuka Langkah Untuk Menggapai
Impian‟‟, Guest Lecture On Medicinal Chemistry By Dr. Rob Leurs (Vrije
Universeit, The Netherlands), Seminar Nasional „‟ Pemberdayaan Pasien Self
Management Diabetes Melitus Untuk Meningkatkan Kualitas Hidup‟‟. Hari
Aids Sedunia „‟ Kubangun Dan Kujaga Generasiku Bebas HIV AIDS‟‟
Pelaksanaan Pengembangan Kepribadian Mahasiswa.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI