Pharmakokinetisch/pharmakodynamische Untersuchung zur in vitro Aktivtität von Levofloxacin und Moxifloxacin gegenüber B. fragilis und E. coli in Mono- und Mischkultur Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von: Stefanie Rossi, geb. Hoffmann geboren am 18.03.1980 in Bad Langensalza angefertigt am: Institut für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der Universität Leipzig Betreuer: PD Dr. med. Reiner Schaumann Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 24.09.2013
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Pharmakokinetisch/pharmakodynamische Untersuchung zur in ... · Referat: Bei intraabdominellen Infektionen findet sich häufig ein polymikrobielles Erregerspektrum aus fakultativ
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Pharmakokinetisch/pharmakodynamische Untersuchung zur in vitro
Aktivtität von Levofloxacin und Moxifloxacin gegenüber
B. fragilis und E. coli in Mono- und Mischkultur
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. med.
an der Medizinischen Fakultät
der Universität Leipzig
eingereicht von:
Stefanie Rossi, geb. Hoffmann
geboren am 18.03.1980 in Bad Langensalza
angefertigt am:
Institut für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der Universität Leipzig
Betreuer:
PD Dr. med. Reiner Schaumann
Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom:
24.09.2013
"Wenn man denkt, es geht nicht mehr, hat man immer noch zwei Drittel seiner Kräfte."
Dr. Horst Köhler
Für David, Emma und Luis - Ich liebe Euch.
Inhaltsverzeichnis
I
I Bibliographische Beschreibung IV
II Abkürzungsverzeichnis V
1 Einleitung 1
1.1 Definition von Pharmakokinetik (PK) und Pharmakodynamik (PD) der
antimikrobiellen Therapie 1
1.2 Definition von Wirkmechanismus, Wirktyp, Wirkspektrum und Wirkintensität von
Antibiotika 1
1.3 Minimale Hemmkonzentration (MHK) 3
1.3.1 Methoden zur Bestimmung der MHK 3
1.3.2 Einteilung der Grenzwerte 4
1.4 Pharmakokinetisch/pharmakodynamisches Modell (PK/PD-Modell) 5
1.5 Postantibiotischer Effekt 7
1.6 Fluorchinolone 8
1.6.1 Levofloxacin 11
1.6.2 Moxifloxacin 13
1.7 Resistenzsituation, Formen und Mechanismen der Resistenz 15
1.8 Physiologische Bakterienflora des gastrointestinalen Trakts 17
1.9 Epidemiologie, Klinik und Therapie von intraabdominellen Infektionen 18
1.10 E. coli - Eigenschaften und Rolle als Krankheitserreger 21
1.11 B. fragilis - Eigenschaften und Rolle als Krankheitserreger 22
2 Zielstellung 24
3 Material 25
3.1 Geräte und Arbeitsplatz 25
3.2 Laborbedarf 25
3.3 Nährmedien zur Anzucht der verwendeten Bakterienkulturen und
Bakteriensuspensionen sowie Materialien zur Bestimmung der MHK 26
Inhaltsverzeichnis
II
4 Methoden 28
4.1 Untersuchte Bakterienstämme 28
4.2 Anzucht der Bakterienkulturen 28
4.3 Untersuchung zur Wachstumshemmung von vier E. coli Stämmen auf
supplementiertem Columbia-Gentamicin-Agar 29
4.4 Bestimmung der MHK von Levofloxacin und Moxifloxacin 29
4.5 PK/PD-Untersuchung von Levofloxacin und Moxifloxacin 30
4.6 Herstellung der Antibiotikasuspensionen 32
4.6.1 Herstellung der Inokula für die Versuche 33
4.6.2 Versuchsdurchführung 34
4.6.3 Ablesung der Versuchsergebnisse und Berechnung der Abtötungsraten 36
4.6.4 Berechnung der pharmakologischen Indizes 37
4.6.5 Statistische Datenanalyse 38
5 Ergebnisse 39
5.1 Wachstumshemmung von vier E. coli Stämmen auf supplementiertem Columbia-
Gentamicin-Agar und Beschreibung der Bakterienstämme 39
5.2 Ergebnisse der MHK-Bestimmung 40
5.3 Aktivität von Levofloxacin und Moxifloxacin im in vitro PK/PD-Modell 41
5.3.1 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier E. coli Stämmen in Monokultur unter
aeroben und anaeroben Bedingungen 41
5.3.2 Aktivität von Moxifloxacin gegenüber vier E. coli Stämmen in Monokultur unter
aeroben und anaeroben Bedingungen 42
5.3.3 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen in Monokultur 44
5.3.4 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli
Stamm ATCC 25922 in Mischkultur 44
5.3.5 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli
Stamm VA 4050 in Mischkultur 46
5.3.6 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli
Stamm BK 12944 in Mischkultur 48
5.3.7 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli
Stamm VA 6886 in Mischkultur 49
Inhaltsverzeichnis
III
5.3.8 Aktivität von Moxifloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli
Stamm VA 4050 in Mischkultur 51
5.3.9 Aktivität von Moxifloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli
Stamm BK 12944 in Mischkultur 52
5.3.10 Zusammenfassung der PK/PD-Untersuchung 54
5.3.11 Pharmakologische Indizes 54
6 Diskussion und Ausblick 57
7 Zusammenfassung der Arbeit 63
8 Literaturverzeichnis 65
9 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 76
10 Danksagung 77
11 Lebenslauf 78
12 Veröffentlichungen der Arbeit 80
Anhang 1-3 81
Bibliographische Beschreibung
IV
I Bibliographische Beschreibung
Stefanie Rossi, Assistenzärztin der Inneren Medizin
Pharmakokinetisch/pharmakodynamische Untersuchung zur in vitro Aktivtität von
Levofloxacin und Moxifloxacin gegenüber B. fragilis und E. coli in Mono- und Mischkultur
Universität Leipzig, Dissertation
92 S., 190 Lit., 25 Abb., 20 Tab., 3 Anlagen
Referat:
Bei intraabdominellen Infektionen findet sich häufig ein polymikrobielles Erregerspektrum
aus fakultativ und obligat anaeroben Bakterien. Natürliches Habitat der dabei am häufigsten
isolierten Erreger E. coli und B. fragilis ist der gastrointestinale Trakt. Durch Störungen der
Darmwandintegrität und nachfolgendem Eindringen der Bakterien in eine sterile Umgebung,
wie beispielsweise der Peritonealhöhle, kann es zur Infektion kommen. Die häufigste Form
der intraabdominellen Infektionen ist die sekundäre Peritonitis. Die Therapie erfolgt
chirurgisch, begleitet von einer antibiotischen Therapie. Dabei sind Kenntnisse über
Wirksamkeit und Empfindlichkeit der Erreger gegenüber den verwendeten Antibiotika von
entscheidender Bedeutung.
In dieser Arbeit wurden die MHK-Werte von vier B. fragilis und vier E. coli Stämmen für
Levofloxacin und Moxifloxacin bestimmt, wobei ein B. fragilis und drei E. coli Stämme
resistent gegenüber Levofloxacin und Moxifloxacin waren. Anschließend wurden mit einem
in vitro PK/PD-Modell die pharmakodynamischen Effekte von Levofloxacin und
Moxifloxacin in Mono- und Mischkulturen von B. fragilis und E. coli untersucht. Die
Monokulturversuche mit E. coli Stämmen wurden sowohl unter aeroben als auch anaeroben
Bedingungen durchgeführt. Durch die Untersuchung von Aktivität und Wirksamkeit von
Levofloxacin und Moxifloxacin in vitro können Aussagen über eine mögliche Verwendung
bei intraabdominellen Infektionen getroffen werden. Levofloxacin wirkte auf den sensiblen E.
coli Stamm nur unter aeroben Bedingungen bakterizid, nicht jedoch unter anaeroben
Bedingungen. Hingegen wirkte Moxifloxacin in aerober und anaerober Umgebung bakterizid
auf diesen E. coli Stamm. In den Mischkulturen zeigte Moxifloxacin eine bessere in vitro
Aktivität als Levofloxacin, wobei Moxifloxacin allerdings auch nur eine moderate Aktivität
hatte. Aufgrund der Ergebnisse könnte Moxifloxacin dennoch eine theraupeutische Option
bei der Behandlung intraabdomineller Infektionen bieten. Der Einsatz dieser Substanzen
sollte jedoch nicht unkritisch erfolgen.
Abkürzungsverzeichnis
V
II Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
ATCC American Type Culture Collection
ATP Adenosintriphosphat
AUC Fläche unter der Kurve (Area under the curve)
CAP Amulant erworbene Pneumonie (Community acquired
pneumonia)
CLSI Clinical Laboratory Standards Institute
Cmax Maximal erreichbare Plasmakonzentration
CYP450 Cytochrom P450
DIN Deutsches Institut für Normung
DNA Desoxyribonukleinsäure (Deoxyribonucleic acid)
EARSS European Antimicrobial Resistance Surveillance System
EUCAST European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing
FDA US Food and Drug Administration
GABA Gamma-Aminobuttersäure
h Stunde(n)
i intermediär
i.v. intravenös
IDSA Infectious Diseases Society of America
ISO International Standard Organisation
KBE Koloniebildende Einheit
l Liter
LEV Levofloxacin
LPS Lipopolysaccharid
mg Milligramm
MHK Minimale Hemmkonzentration
MHK50 Niedrigste Konzentration, welche die Vermehrung von
mindestens 50% der untersuchten Stämme hemmt
MHK90 Niedrigste Konzentration, welche die Vermehrung von
mindestens 90% der untersuchten Stämme hemmt
ml Milliliter
MOX Moxifloxacin
n Anzahl untersuchter Stämme
Abkürzungsverzeichnis
VI
NSAR Nichtsteroidale Antirheumatika
p.o. per os
PAE Postantibiotischer Effekt
PEG Paul-Ehrlich-Gesellschaft
PK/PD Pharmakokinetisch/pharmakodynamisch
r resistent
RMA Stammbezeichnung von B. fragilis Stämmen des R. M. Alden
Research Laboratory, Santa Monica, CA, USA
RNA Ribonukleinsäure (Ribonucleic acid)
s sensibel
SIS Surgical Infection Society
spp. Species
T>MHK Zeit oberhalb der MHK
vs. versus
WAL R Stammbezeichnung von B. fragilis Stämmen aus einer
internationalen Anaerobierstudie
ZNS Zentralnervensystem
Einleitung
1
1 Einleitung
Als Grundgedanke der antiinfektiven Therapie kann das Ehrlichsche Prinzip der selektiven
Toxizität Anwendung finden. Es beschreibt den selektiven Angriff der Antiinfektiva an
Strukturen der Mikroorganismen, welche beim Wirtsorganismus (Mensch) nicht oder in
wesentlich anderer Form vorkommen [119].
1.1 Definition von Pharmakokinetik (PK) und Pharmakodynamik (PD) der
antimikrobiellen Therapie
Die Pharmakologie der antimikrobiellen Therapie wird durch die Begriffe der
Pharmakokinetik und Pharmakodynamik beschrieben.
Der 1953 erstmalig von F. H. Dost verwendete Begriff der Pharmakokinetik beschreibt die
Konzentrationsveränderungen des Antibiotikums im Organismus in Abhängigkeit von der
Zeit. Endogene Prozesse wie Resorption, Verteilung, Biotransformation und Elimination
bedingen diese Veränderungen. Die Zusammensetzung des Antibiotikums, sowie
Applikationsart und -ort fallen ebenso unter diesen Begriff [45, 185].
Die Pharmakodynamik beschreibt die Beziehungen zwischen der Konzentration des
Antibiotikums und dem hervorgerufenen antimikrobiellen Effekt. Dadurch lassen sich
Parameter wie Wirkprofil, Wirkqualität, Effektivität der Wirkung und Wirkintensität
ermitteln.
Die pharmakodynamischen Effekte der Antibiotika lassen sich in vitro anhand folgender
Parameter analysieren:
� den morphologischen Veränderungen der Bakterien
� der intitialen Abtötungsrate
� der hemmenden Wirkung auf die Vermehrung
� dem postantibiotischen Effekt
� und der effektiven Zeit des erneuten Wachstums nach Antibiotikumexposition [68,
100].
1.2 Definition von Wirkmechanismus, Wirktyp, Wirkspektrum und Wirkinten sität
von Antibiotika
In der großen Gruppe der Antibiotika können Einteilungen nach Wirkmechanismus, Wirktyp,
Wirkspektrum und Wirkintensität vorgenommen werden [67, 119].
Einleitung
2
Der Wirkmechanismus liefert Aussagen über die Angriffspunkte der Antibiotika bei
Bakterienzellen und wird unterschieden nach [74, 165]:
� Hemmung der Zellwandsynthese (z. B. Betalaktam-Antibiotika oder
Glykopeptide)
� Störung der Zellwandpermeabilität (z. B. Polypeptide)
� Hemmung des bakteriellen Stoffwechsels (z. B. Folsäureantagonisten)
� Hemmung der Proteinbiosynthese (z. B. Aminoglykoside, Makrolide)
� Eingriff in die Synthese von Nukleinsäuren oder deren Schädigung (z. B.
Fluorchinolone oder Nitroimidazole).
Beim Wirktyp wird zwischen bakteriostatischem und bakterizidem Wirktyp unterschieden.
Als Bakteriostase wird die Hemmung des Bakterienwachstums bezeichnet. Zu einer Abtötung
der Mikroorganismen kommt es hierbei nicht. Ruhende Bakterien werden nicht beeinflusst.
Bakteriostatisch wirkende Antibiotika, wie Sulfonamide, Tetrazykline oder Chloramphenicol
wirken meist über die Beeinflussung der bakteriellen Proteinbiosynthese.
Kommt es zu einer Abtötung der Bakterienzelle, wird von Bakterizidie gesprochen. Die
Zerstörung der Mikroorganismen kann sowohl in der Vermehrungsphase als auch in der
Ruhephase erfolgen. Beispiele hierfür sind Penicilline, Aminoglykoside und Fluorchinolone.
Weiterhin unterscheidet man eine konzentrationsabhängige und eine weitgehend
konzentrationsunabhängige, zeitabhängige Bakterizidie [38, 89, 119]. Neben der direkten
antibakteriellen Wirkung können bestimmte Antibiotika indirekt antibakteriell durch
Modulation des Immunsystems wirken. Beispielsweise können Makrolide und
Fluorchinolone die Zytokinbildung beeinflussen und Rifampicin kann die T-Zell-Aktivierung
supprimieren [173].
Das Wirkspektrum beschreibt die Aktivität von Antibiotika gegenüber verschiedenen
Bakterienspezies. Hier wird zwischen sogenannten Schmalspektrum- und Breitspektrum-
Antibiotika unterschieden. Schmalspektrum-Antibiotika sind gegenüber wenigen
Bakterienspezies wirksam. Breitspektrum-Antibiotika wirken gegen unterschiedliche
Bakterienspezies [166].
Die Wirkintensität eines Antibiotikums wird durch die Minimale Hemmkonzentration (MHK)
beschrieben und durch die definierten Empfindlichkeitsstufen "sensibel, intermediär und
resistent" kategorisiert.
Einleitung
3
1.3 Minimale Hemmkonzentration (MHK)
Nach DIN 58940-1 ist die MHK definiert als geringste Konzentration eines Antibiotikums
(mg/l), die unter definierten in vitro Bedingungen in einem vorgegebenen Zeitintervall (18 ±
2 h) ein visuell erkennbares mikrobielles Wachstum verhindert [6]. Die minimale bakterizide
Hemmkonzentration (MBK) ist die geringste in vitro gemessene Konzentration, welche nach
6 h zu einem Absterben der Mikroorganismen führt. Eine bakterizide Wirkung liegt bei
Abtötungsraten von mindestens 99,9% vor [6, 166]. Die MHK liefert Aussagen zur aktuellen
Empfindlichkeitssituation in vivo. Es handelt sich um einen prädiktiven in vitro bestimmten
Wert zur wahrscheinlichen Wirkung des Antibiotikums. Es erfolgt häufig eine klinische
Einstufung in die Kategorien "sensibel", "intermediär" und "resistent". Die MHK90 ist die
Antibiotikumkonzentration, welche zur Hemmung von 90% der untersuchten Stämme führt.
Die MHK50 gibt die Konzentration an, welche das Wachstum von 50% der untersuchten
Erreger hemmt [14, 133, 185].
1.3.1 Methoden zur Bestimmung der MHK
Testverfahren müssen standardisiert sein, um reproduzierbare Testergebnisse zu erhalten. Auf
Initiative des Deutschen Instituts für Normung (DIN) gibt es inzwischen eine
Standardisierungsnorm für die Bestimmung der MHK (DIN EN ISO 20776-1). Die
Mikrodilutionsmethode gilt dabei als Referenzmethode der MHK-Bestimmung [5]. Bei
Verwendung unterschiedlicher Standards können sich Diskrepanzen in den Ergebnissen
ergeben. Daher ist die Angabe des verwendeten Standards erforderlich [167]. Die
gebräuchlichsten Methoden werden im Folgenden ausführlicher erläutert.
Dilutionstest Bei diesen geometrischen Verdünnungsreihen können quantitative Aussagen bezüglich der
Empfindlichkeit von Mikroorganismen gemacht werden. Man unterscheidet den
Agardilutionstest von dem Mikro- und Makrobouillondilutionstest. Beim Agardilutionstest
werden standardisierte Bakterienmengen auf entsprechend vorbereitetes Agarmedium geimpft
und nachfolgend inkubiert. Das Agarmedium besteht aus einem geeigentem Nährmedium,
welches mit verschiedenen Konzentrationen des zu testenden Antibiotikums versetzt ist. Zur
Kontrolle wird ein Agarmedium ohne Antibiotikum mit dem standardisiertem Inokulum
beimpft [9]. Vorteil des Agardilutionstestes ist die Möglichkeit der Verwendung mehrerer
verschiedener Bakterienstämme auf einem Agarmedium.
Einleitung
4
Bei der Bouillondilutionsmethode werden mehrere Behältnisse mit gleichen Volumina einer
geeigneten Bouillon sowie gleichen Volumina einer Wirkstofflösung mit allerdings
geometrisch abnehmender Antibiotikumkonzentration mit einem definierten Inokulum
beschickt. Die MHK ist festgelegt als niedrigste Konzentration, welche noch zu einer
sichtbaren Hemmung des Erregerwachstums führt [6, 112, 153].
Gradientendiffusionstest Der Gradientendiffusionstest wurde 1991 weltweit als Epsilometer-Test (Etest®) durch AB
Biodisk eingeführt. In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass sich vergleichbare
Ergebnisse zu den Verdünnungsreihen sowie den Diffusionstesten ergeben [19, 105]. Es wird
die einfache Handhabung des Agardiffusionstestes mit der Genauigkeit der Bouillondilution
verbunden, wodurch eine direkte Bestimmung der MHK erfolgen kann. Der Etest® ist ein
vorgefertigter und stabiler Antibiotikumgradient über 15 Verdünnungsstufen auf einem
Kunststoffträgermaterial [3]. Das Antibiotikum diffundiert in das Testmedium und kann das
Bakterienwachstum hemmen. Dabei bildet sich ein ellipsenförmiger Hemmhof um den
Teststreifen, wie in Abbildung 1 dargestellt. Die Endpunkte der Hemmhofellipse ergeben den
jeweiligen MHK-Wert.
Abbildung 1: Agarmedium mit 5 Etest®-Streifen und ellipsenförmigen Hemmzonen (aus Baker et al., 1991 [19])
1.3.2 Einteilung der Grenzwerte Nach DIN 58940-1 beschreibt der Grenzwert die MHK bzw. den Hemmhofdurchmesser
(HHD), anhand derer die Erreger nach den Empfindlichkeitsprädikaten oder
Bewertungsstufen "sensibel", "intermediär" und "resistent" voneinander getrennt werden [6].
Einleitung
5
Die Einteilung basiert primär auf pharmakokinetisch/ pharmakodynamischen Beziehungen,
welche durch Studien erhoben werden. Aber auch Faktoren wie Dosierung, unerwünschte
Wirkungen, Resistenzmechanismen sowie klinisches Outcome werden berücksichtigt [84].
Um einen Abgleich der Grenzwerte innerhalb von Europa zu erzielen, wurde die
Arbeitsgruppe des European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)
eingerichtet [85, 86]. Die EUCAST ist ein ständiges Kommittee der European Society for
Clinical Mirobiology and Infectious Diseases (ESCMID). Die Grenzwerte der EUCAST sind
im Internet unter http://www.eucast.org/ verfügbar [8]. Es gibt aber auch andere
Organisationen, die sich mit der Grenzwertfindung beschäftigen [41]. In Amerika werden die
Breakpoints durch das Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, vormals NCCLS =
National Committee of Clinical Laboratory Standards) herausgegeben [35]. Die EUCAST-
Grenzwerte sind häufig niedriger als die der CLSI. Teilweise sind die ausgegebenen
Grenzwerte bei beiden Komitees Bakteriengruppen-spezifisch. In Deutschland werden beide
Bewertungssysteme verwendet. Dabei ist dem klinisch tätigem Arzt meist nicht bekannt, nach
welchem System bewertet wurde [136]. Im Rahmen einer ISO-Arbeitsgruppe wurde als
weltweiter Standard zur Ermittlung der MHK die Mikrobouillondilution festgelegt [136].
"Als sensibel (s) gegen ein bestimmtes Antibiotikum wird ein Bakterienstamm dann
bezeichnet, wenn er in vitro von einer Konzentration dieses Wirkstoffs inhibiert wird, die mit
einer hohen therapeutischen Erfolgswahrscheinlichkeit assoziiert ist"[5] .
"Als intermediär (i) gegen ein bestimmtes Antibiotikum wird ein Bakterienstamm dann
bezeichnet, wenn er in vitro von einer Konzentration dieses Wirkstoffs inhibiert wird, die mit
einem unsicheren therapeutischen Ergebnis assoziiert ist. Ohne zusätzliche Berücksichtigung
weiterer Kriterien ist eine Beurteilung hinsichtlich eines Therapieerfolges durch das
entsprechende Antibiotikum nicht möglich" [5].
"Als resistent (r) gegen ein Antibiotikum wird ein Bakterienstamm dann bezeichnet, wenn er
in vitro von einer Konzentration dieses Wirkstoffs inhibiert wird, die mit einer hohen
Wahrscheinlichkeit des Therapieversagens assoziiert ist. Sind keine ausreichend hohen
Erfolgsraten durch das Antiinfektivum bei klinischen Studien zu erreichen, wird dieses
ebenfalls als "resistent" bezeichnet" [5].
1.4 Pharmakokinetisch/pharmakodynamisches Modell (PK/PD-Modell)
Die MHK ist ein wichtiger Parameter zur Quantifizierung der Aktivität eines Antibiotikums.
Da es sich um einen statischen Wert handelt, können keine Angaben über die Absterbekinetik
oder das Wachstumsverhalten der Erreger gemacht werden. Pharmakokinetische Faktoren des
Einleitung
6
Antibiotikums finden zudem keine Berücksichtigung [38, 59]. Die Interaktion zwischen
Antibiotikum und Bakterium in vitro kann zunächst durch eine Absterbekinetik simuliert
werden. Vorteil gegenüber der MHK ist die Bestimmung von Ausmaß und Geschwindigkeit
der Abtötung oder des Wachstums von Bakterien. Nachteilig ist die konstante
Antbiotikumkonzentration. Eine Möglichkeit zur vergleichenden Betrachtung von
Pharmakokinetik und Pharmakodynamik lässt sich durch PK/PD-Modelle erreichen [36].
PK/PD-Modelle bieten eine gute Möglichkeit zur Abschätzung der antimikrobiellen
Wirkintensität und Effekte durch Darstellung dynamischer Abtötungskurven. Somit lassen
sich Fragen der Dosierung und der Dosierungsintervalle (zeitabhängige vs.
Müller-Hinton-Agar BECTON, Dickinson and Company, Sparks,
USA, Le Pont de Claix, Frankreich
NaHCO3
MERCK EUROLAB GmbH, Darmstadt,
Deutschland
Schafblut, defibriniert OXOID GmbH, Wesel, Deutschland
Vitamin K1
SIGMA – Aldrich, Steinheim, Deutschland
Materialien
27
Um ein optimales Nährmedium für die Anzucht der Anaerobier zu haben, wurden 2 l
Columbia-Agar mit 100 ml Schafblut, 1 mg/l Vitamin K1, 5 mg/l Hämin und 1 ml/l 0,1%
NaHCO3 supplementiert.
Für die Herstellung des Columbia-Gentamicin-Agar wurden zu 2 l supplementierten,
autoklavierten und auf 50 °C abgekühlten Columbia-Agar 80 mg Gentamicin zugegeben. Das
Agarpulver wurde nach Angaben des Herstellers in der jeweils vorgeschriebenen Menge
destilliertem Wasser gelöst und für 15 min bei einer Temperatur von 121 °C autoklaviert.
Anschließend wurde der flüssige Agar auf etwa 50 °C abgekühlt und das Flüssigmedium in
Portionen zu je 20 ml unter sterilen Bedingungen in Kunststoffpetrischalen gegossen.
2 l Brucella-Bouillon wurden mit 1 mg/l Vitamin K1, 5 mg/l Hämin und 1 ml/l 0,1% NaHCO3
supplementiert.
Im Weiteren werden die genannten supplementierten Nährmedien nur noch als
supplementierter Columbia-Agar, supplementierter Columbia-Gentamicin-Agar und
supplementierte Brucella-Bouillon bezeichnet.
Methoden
28
4 Methoden
4.1 Untersuchte Bakterienstämme
Für die Versuche wurden B. fragilis und E. coli Stämme aus der Stammsammlung des
Instituts für Medizinische Mikrobiologie der Universität Leipzig verwandt. Bei den in Tabelle
7 aufgeführten Bakterienstämmen handelt es sich um Isolate von Patientenproben und einen
Referenzstamm. Die Isolate werden in Magermilch bei -80 °C gelagert.
Tabelle 7: Verwendete Bakterienstämme und deren Herkunft
Bakterienstamm Herkunft
E. coli ATCC 25922 Referenzstamm
E. coli VA 4050 Klinisches Isolat aus Rachenabstrich, Zustand nach
Herztransplantation
E. coli BK 12944 Klinisches Isolat aus Blutkultur,
hämatologisch/onkologische Erkrankung
E. coli VA 6886 Klinisches Isolat aus Gallenflüssigkeit, Klatskin-
Carcinom
B. fragilis RMA 6791 Klinisches Isolat aus Blutkultur
B. fragilis WAL R 13267 Klinisches Isolat, Entnahmeort unbekannt
B. fragilis RMA 5120 Klinisches Isolat aus Appendix vermiformis,
Appendizitis
B. fragilis RMA 0309 Klinisches Isolat aus Abdomen
Die Stämme mit der Bezeichnung RMA wurden freundlicherweise von E. J. C. Goldstein, R.
M. Alden Research Laboratory, Santa Monica, Kalifornien, USA, zur Verfügung gestellt.
Der WAL R 13267 Stamm stammt aus einer internationalen klinischen Anaerobierstudie. Bei
den E. coli Stämmen handelt es sich um einen Referenzstamm (E. coli ATCC 25922) sowie
klinische Isolate aus Patientenproben des Institutes für Medizinische Mikrobiologie der
Universität Leipzig.
4.2 Anzucht der Bakterienkulturen
Zur Anzucht der Bakterienstämme wurden für die E. coli Stämme Endo-Agar und für die B.
fragilis Stämme supplementierter Columbia-Agar verwendet. Die Bakterien wurden aus der
Methoden
29
gefrorenen Magermilchlösung mit einer sterilen Impfschlinge auf das entsprechende
Agarmedium übertragen. Die E. coli Stämme wurden für 24 h aerob auf Endo-Agar bebrütet.
Die B. fragilis Stämme wurden für 48 h unter anaeroben Bedingungen auf supplementiertem
Columbia-Agar bebrütet. Zur Kontrolle wurde beimpfter Agar aerob bebrütet.
4.3 Untersuchung zur Wachstumshemmung von vier E. coli Stämmen auf
supplementiertem Columbia-Gentamicin-Agar
In dieser Arbeit wurden Untersuchungen mit B. fragilis und E. coli Stämmen sowohl in
Mono- als auch in Mischkulturen durchgeführt.
Bei den Mischkulturen wuchsen sowohl B. fragilis und E. coli Kolonien gemeinsam auf dem
supplementierten Columbia-Agarmedium. Um die Ergebnisse besser auswerten zu können,
wurde eine mögliche Wachtumsunterdrückung der E. coli Kolonien auf supplementiertem
Columbia-Gentamicin-Agar untersucht. Es wurden Inokula aus E. coli und B. fragilis
Stämmen hergestellt und dann zu den verschiedenen Zeitpunkten 0, 0,5, 1, 2, 4, 6 und 8 h auf
den Columbia-Gentamicin-Agarmedium und den Columbia-Agarmedium ausgestrichen und
für 48 h anaerob inkubiert.
4.4 Bestimmung der MHK von Levofloxacin und Moxifloxacin
Die MHK von Levofloxacin und Moxifloxacin der untersuchten Bakterienstämme wurde mit
dem Etest nach Angaben des Herstellers bestimmt.
Es wurden 2-3 Bakterienkolonien vom jeweiligen Agarmedium in 10 ml präreduzierte,
supplementierte Brucella-Bouillon abgeimpft. Die Suspension mit den E. coli Stämmen
wurde für 24 h aerob bei 37 °C inkubiert. Bei den B. fragilis Stämmen erfolgte die
Durchführung unter anaeroben Bedingungen mit einer Inkubationszeit von 48 h bei einer
Temperatur von 37 °C.
Nach der Bebrütung wurde für das B. fragilis Inokulum ein McFarland Standardwert 1
eingestellt, welcher einer Bakteriendichte von 3 × 108 KBE/ml entspricht. Für das E. coli
Inokulum erfolgte nach Einstellung von McFarland 1 eine 20-fache Verdünnung. Die
Beimpfung erfolgte mittels eines sterilen Wattetupfers. Dabei wurde die gesamte Oberfläche
des Agarmediums in drei Richtungen gleichmäßig ausgestrichen. Für die Etest®-Versuche der
E. coli Stämme wurde Müller-Hinton-Agar und für die B. fragilis Stämme supplementierter
Columbia-Agar verwendet, wobei eine Präreduktion des Agarmediums von ungefähr drei
Stunden erfolgte. Die Etest-Streifen von Levofloxacin und Moxifloxacin wurden danach
Methoden
30
blasenfrei und zentral mittels einer Pinzette auf das Agarmedium aufgebracht. Die Ablesung
erfolgte bei den E. coli Stämmen nach 24 h aerober Inkubation und bei den B. fragilis
Stämmen nach 48 h anaerober Inkubation bei 37 °C. Am Schnittpunkt des Hemmhofes mit
dem Teststreifen konnte die minimale Hemmkonzentration abgelesen werden.
4.5 PK/PD-Untersuchung von Levofloxacin und Moxifloxacin
Ein Dosierungsintervall bei der Gabe einer bestimmten antibiotischen Dosis pro Tag ist
Grundlage der zeitlichen Durchführung des Versuches, da dieses Intervall abhängig von der
Halbwertszeit der jeweiligen Substanz ist. Die durchschnittlichen Dosiswerte sind nach Stille
et al. [166] in Tabelle 8 aufgelistet und beziehen sich auf eine normalgewichtige,
nierengesunde Person (ca. 75 kg Körpergewicht).
Tabelle 8: Tagesdosis und Dosierungshäufigkeit der Antibiotika (nach Stille et al. [166])
Antibiotika Tagesdosis und Dosierungshäufigkeit/Tag
Levofloxacin 1 bis 2 × täglich 0,25-0,5 g p.o. oder i.v. als Kurzinfusion
Moxifloxacin 1 × täglich 0,4 g p.o. oder i.v. als Kurzinfusion
Tabelle 9 zeigt eine Auflistung der pharmakokinetischen Eigenschaften der Antibiotika nach
Werten von Stille et al. sowie der Versuchsdauer im in vitro PK/PD-Modell [166].
Tabelle 9: Pharmakokinetische Eigenschaften der Antibiotika nach Stille et al. [166] und Versuchsdauer im in vitro PK/PD-Modell
Antibiotikum i.v. Gabe von Cmax (mg/l) t ½ e (h) Versuchsdauer (h)
Levofloxacin 0,5 g in 60 min 6,2 7-8 13
Moxifloxacin 0,4 g in 30 min 4,4 12 12
Die Halbwertszeit von Moxifloxacin entspricht der Versuchsdauer. Trotz der kürzeren
Halbwertszeit von Levofloxacin wurde zur besseren Vergleichbarkeit eine ähnlich lange
Versuchsdauer wie bei Moxifloxacin gewählt. Die Plasmakonzentration des entsprechenden
Antibiotikums über die Zeit gesehen, ist abhängig von der Eliminationshalbwertszeit und
ändert sich nach folgender Formel [119]:
Ct = C0 × e – k × t
C0 = Ausgangskonzentration zum Zeitpunkt t = 0 (mg/l)
Ct = Plasmakonzentration zum Zeitpunkt t (mg/l)
Methoden
31
k = Eliminationskonstante
k = ln2 / t ½ e
t ½ e = Eliminationshalbwertszeit
Das in Abbildung 6 dargestellte Konzentrations-Zeit-Diagramm zeigt einen linearen Abfall
der Konzentration über die jeweilige Versuchsdauer von 13 h für Levofloxacin und 12 h für
Moxifloxacin.
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
0 2 4 6 8 10 12
Zeit (h)
Kon
zen
tra
tion
(m
g/l)
Moxifloxacin
Levofloxacin
Abbildung 6: Konzentrations-Zeit-Diagramm als Exponentialfunktion Aus Gründen der Praktikabilität wurde der Versuch nach dem in Abbildung 7 dargestellten
unter aeroben Bedingungen bakterizid (Abtötungsrate >99,9%). Bei den E. coli Stämmen VA
4050, BK 12944 und VA 6886 lassen sich unter aeroben Versuchsbedingungen keine
signifikanten Unterschiede in den Wachstumskurven mit und ohne Antibiotikum feststellen
(p > 0,05).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130
2
4
6
8
10
EC VA 4050 LEV+ EC VA 4050 LEV-EC BK 12944 LEV+ EC BK 12944 LEV-EC ATCC 25922 LEV+ EC ATCC 25922 LEV-EC VA 6886 LEV+ EC VA 6886 LEV-
Zeit [h]
Log
10K
BE
/ml
Abbildung 9: Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier verschiedenen Stämmen von E. coli (EC) im in vitro PK/PD-Modell in Monokulturen mit und ohne Levofloxacin unter aeroben Bedingungen. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml. Auch unter anaeroben Bedingungen (Abb. 10) werden die KBE des E. coli Stammes ATCC
25922 durch Levofloxacin signifikant reduziert (p < 0,01). Dabei wirkt Levofloxacin jedoch
nicht bakterizid (Abtötungsrate 99,1%). Bei den E. coli Stämmen VA 4050, BK 12944 und
VA 6886 lassen sich auch unter anaeroben Versuchsbedingungen keine signifikanten
Unterschiede in den Wachstumskurven mit und ohne Levofloxacin feststellen (p > 0,05).
Ergebnisse
42
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 134
5
6
7
8
9
10
EC VA 4050 LEV+ EC VA 4050 LEV-EC BK 12944 LEV+ EC BK 12944 LEV-EC ATCC 25922 LEV+ EC ATCC 25922 LEV-EC VA 6886 LEV+ EC VA 6886 LEV-
Zeit [h]
Log
10K
BE
/ml
Abbildung 10: Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier verschiedenen Stämmen von E. coli (EC) im in vitro PK/PD-Modell in Monokulturen mit und ohne Levofloxacin unter anaeroben Bedingungen. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Levofloxacin unter aeroben Versuchsbedingungen
signifikant besser wirkt als unter anaeroben Versuchsbedingungen (p < 0,01).
5.3.2 Aktivität von Moxifloxacin gegenüber vier E. coli Stämmen in Monokultur unter
aeroben und anaeroben Bedingungen
Unter aeroben Versuchsbedingungen (Abb. 11) werden die KBE des E. coli Stammes ATCC
(Abtötungsrate >99,9%). Bei den E. coli Stämmen VA 4050, BK 12944 und VA 6886 lassen
sich unter aeroben Bedingungen zwischen den Versuchen mit und ohne Antibiotikum im
Wachstumsverhalten keine signifikanten Unterschiede feststellen (p > 0,05).
Auch unter anaeroben Bedingungen (Abb. 12) werden die KBE des E. coli Stammes ATCC
25922 durch Moxifloxacin signifikant reduziert (p < 0,01). Moxifloxacin wirkt auch hier
bakterizid (Abtötungsrate >99,9%). Bei den E. coli Stämmen VA 4050, BK 12944 und VA
6886 lassen sich auch unter anaeroben Bedingungen keine signifikanten Unterschiede in den
Wachstumskurven mit und ohne Moxifloxacin feststellen (p > 0,05).
Ergebnisse
43
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
1
2
4
6
8
10
EC VA 4050 MOX+ EC VA 4050 MOX-EC BK 12944 MOX+ EC BK 12944 MOX-EC ATCC 25922 MOX+ EC ATCC 25922 MOX-EC VA 6886 MOX+ EC VA 6886 MOX-
Zeit [h]
Log
10K
BE
/ml
Abbildung 11: Aktivität von Moxifloxacin gegenüber vier verschiedenen Stämmen von E. coli (EC) im in vitro PK/PD-Modell in Monokulturen mit und ohne Moxifloxacin unter aeroben Bedingungen. MOX+, mit Moxifloxacin; MOX-, Kontrolle ohne Moxifloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
1
2
6
7
8
9
10
EC VA 4050 MOX+ EC VA 4050 MOX-EC BK 12944 MOX+ EC BK 12944 MOX-EC ATCC 25922 MOX+ EC ATCC 25922 MOX-EC VA 6886 MOX+ EC VA 6886 MOX-
Zeit [h]
Log
10K
BE
/ml
Abbildung 12: Aktivität von Moxifloxacin gegenüber vier verschiedenen Stämmen von E. coli (EC) im in vitro PK/PD-Modell in Monokulturen mit und ohne Moxifloxacin unter anaeroben Bedingungen. MOX+, mit Moxifloxacin; MOX-, Kontrolle ohne Moxifloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich unter aeroben und anaeroben
Versuchsbedingungen für Moxifloxacin keine signifikanten Unterschiede in der Aktivität
ergeben (p > 0,05).
Ergebnisse
44
5.3.3 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen in Monokultur
Durch Levofloxacin werden die KBE der B. fragilis Stämme RMA 6791, RMA 5120 und
RMA 0309 (Abb. 13) signifikant reduziert (p < 0,01). Allerdings wirkt Levofloxacin nicht
Abbildung 13: Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) im in vitro PK/PD-Modell in Monokulturen mit und ohne Levofloxacin. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.
5.3.4 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli
Stamm ATCC 25922 in Mischkultur
In den Mischkulturen mit den B. fragilis Stämmen RMA 6791 und WAL R 13267 (Abb. 14)
bestehen keine signifikanten Unterschiede in den Wachstumsraten des E. coli Stammes
ATCC 25922 mit und ohne Antibiotikum (p < 0,05). Im Gegensatz dazu wird der E. coli
Stamm in der Monokultur durch Levofloxacin signifikant reduziert (p < 0,01). In den
Mischkulturen sind die Wachstumsraten der B. fragilis Stämme RMA 6791 und WAL R
13267 mit Levofloxacin signifikant niedriger (p < 0,01). In der Monokultur wirkt
Levofloxacin aber signifikant besser auf den B. fragilis Stamm RMA 6791 als in der
Mischkultur (p < 0,01). Dieser Unterschied besteht bei dem B. fragilis Stamm WAL R 13267
Abbildung 14: Aktivität von Levofloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 6791 und WAL R 13267 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) ATCC 25922 im in vitro PK/PD-Modell. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml
In den Mischkulturen mit den B. fragilis Stämmen RMA 5120 und RMA 0309 (Abb. 15)
werden die KBE des E. coli Stammes ATCC 25922 im Ansatz mit Levofloxacin reduziert
(Abtötungsraten 99,7% und 99,3%). Im Vergleich mit den Kontrollkulturen ohne
Antibiotikum ist diese Reduktion jedoch nicht signifikant (p > 0,05). Im Gegensatz dazu
reduziert Levofloxacin die KBE dieses E. coli Stammes in den Monokulturen signikant (p <
0,01). Weiterhin reduziert Levofloxacin die KBE der B. fragilis Stämme RMA 5120
(Abtötungsrate 75,4%) und RMA 0309 (Abtötungsrate 66,2%) in den Mischkulturen
signifikant (p < 0,01). Dabei wirkt aber Levofloxacin in der Monokultur signifikant besser auf
den B. fragilis Stamm RMA 0309 gegenüber der Mischkultur (p < 0,01). Dieser Unterschied
ist bei dem B. fragilis Stamm RMA 5120 nicht vorhanden (p > 0,05).
Abbildung 15: Aktivität von Levofloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 5120 und RMA 0309 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) ATCC 25922 im in vitro PK/PD-Modell. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.
5.3.5 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli
Stamm VA 4050 in Mischkultur
Für den E. coli Stamm VA 4050 ergibt sich in allen Ansätzen der Mischkulturen mit den B.
fragilis Stämmen (RMA 6791, WAL R 13267, RMA 5120, RMA 0309) kein signifikanter
Unterschied der Wachstumsraten mit und ohne Antibiotikum (p > 0,05). Allerdings ist die
Wachstumsrate dieses E. coli Stammes in Monokultur gegenüber den Mischkulturen (Abb. 16
und 17) mit Levofloxacin signifikant niedriger (p < 0,01).
Die Wachstumsrate des B. fragilis Stammes RMA 6791 in der Mischkultur (Abb. 16) ist mit
Levofloxacin signifikant niedriger (p < 0,01). Allerdings wirkt Levofloxacin in der
Monokultur signifikant besser auf den B. fragilis Stammes RMA 6791 als in der Mischkultur
(p > 0,01). Im Gegensatz dazu bestehen bei dem B. fragilis Stamm WAL R 13267 mit und
ohne Levofloxacin zwischen den Misch- und Monokulturen keine signifikanten Unterschiede
im Wachstumsverhalten (p > 0,05).
Ergebnisse
47
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 135
6
7
8
9
10
EC VA 4050 LEV+ EC VA 4050 LEV-BF RMA 6791 LEV+ BF RMA 6791 LEV-BF WAL R 13267 LEV+ BF WAL R 13267 LEV-
Zeit [h]
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10K
BE
/ml
Abbildung 16: Aktivität von Levofloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 6791 und WAL R 13267 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) VA 4050 im in vitro PK/PD-Modell. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.
In den Ansätzen mit Levofloxacin werden die KBE der B. fragilis Stämme RMA 5120
(Abtötungsrate 49,5%) und RMA 0309 (Abtötungsrate 94,2%) in den Mischkulturen (Abb.
17) signifikant reduziert (p < 0,01). Allerdings wirkt Levofloxacin in den Monokulturen
signifikant besser auf die Reduktion der KBE als in den Mischkulturen (p < 0,05).
Abbildung 17: Aktivität von Levofloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 5120 und RMA 0309 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) VA 4050 im in vitro PK/PD-Modell. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.
Ergebnisse
48
5.3.6 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli
Stamm BK 12944 in Mischkultur
In allen Ansätzen der Mischkulturen mit den B. fragilis Stämmen RMA 6791, WAL R 13267,
RMA 5120 und RMA 0309 ergeben sich für den E. coli Stamm BK 12944 keine signifikanten
Unterschiede in den Wachstumsraten mit und ohne Levofloxacin (p > 0,05). Die
Wachstumsrate dieses E. coli Stammes ist aber in den Monokulturen gegenüber den
Mischkulturen (Abb. 18 und 19) mit Levofloxacin signifikant niedriger (p < 0,01).
In der Mischkultur (Abb. 18) ist die Wachstumsrate des B. fragilis Stammes RMA 6791 mit
Levofloxacin signifikant niedriger (p < 0,01). Aber Levofloxacin wirkt in der Monokultur des
B. fragilis Stammes RMA 6791 signifikant besser im Vergleich mit der Mischkultur (p <
0,01). Im Gegensatz dazu bestehen bei dem B. fragilis Stamm WAL R 13267 mit und ohne
Levofloxacin zwischen den Misch- und Monokulturen keine signifikanten Unterschiede in
den Wachstumsraten (p > 0,05).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 135
6
7
8
9
10
EC BK 12944 LEV+ EC BK 12944 LEV-BF RMA 6791 LEV+ BF RMA 6791 LEV-BF WAL R 13267 LEV+ BF WAL R 13267 LEV-
Zeit [h]
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10K
BE
/ml
Abbildung 18: Aktivität von Levofloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 6791 und WAL R 13267 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) BK 12944 im in vitro PK/PD-Modell. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml. In der Mischkultur (Abb. 19) werden die KBE des B. fragilis Stammes RMA 5120 mit
Levofloxacin moderat (Abtötungsrate 26,3%), aber im Vergleich mit der Kontrollkultur ohne
Antibiotikum nicht signifikant reduziert (p > 0,05). Im Gegensatz dazu reduziert
Levofloxacin die KBE des B. fragilis Stammes RMA 0309 in der Mischkultur signifikant
(Abtötungsrate 75,1%; p < 0,01). Levofloxacin wirkt allerdings in den Monokulturen beider
Ergebnisse
49
B. fragilis Stämme signifikant besser auf die Reduktion der KBE als in den Mischkulturen (p
Abbildung 19: Aktivität von Levofloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 5120 und RMA 0309 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) BK 12944 im in vitro PK/PD-Modell. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.
5.3.7 Aktivität von Levofloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli
Stamm VA 6886 in Mischkultur
Für den E. coli Stamm VA 6886 ergibt sich in allen Ansätzen der Mischkulturen mit den B.
fragilis Stämmen RMA 6791, WAL R 13267, RMA 5120 und RMA 0309 kein signifikanter
Unterschied der Wachstumsraten mit und ohne Antibiotikum (p > 0,05). Allerdings ist die
Wachstumsrate des E. coli Stammes VA 6886 in Monokultur gegenüber den Mischkulturen
(Abb. 20 und 21) mit Levofloxacin signifikant niedriger (p < 0,01).
Die Wachstumsrate des B. fragilis Stammes RMA 6791 in der Mischkultur (Abb. 20) ist mit
Levofloxacin signifikant niedriger (p < 0,01). Aber Levofloxacin wirkt in der Monokultur
signifikant besser auf den B. fragilis Stamm RMA 6791 als in der Mischkultur (p < 0,01). Für
den B. fragilis Stamm WAL R 13267 bestehen im Gegensatz dazu mit und ohne Levofloxacin
zwischen den Misch- und Monokulturen keine signifikante Unterschiede in den
Wachstumskurven (p > 0,05).
Ergebnisse
50
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 135
6
7
8
9
10
EC VA 6886 LEV+ EC VA 6886 LEV-BF RMA 6791 LEV+ BF RMA 6791 LEV-BF WAL R 13267 LEV+ BF WAL R 13267 LEV-
Zeit [h]
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10K
BE
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Abbildung 20: Aktivität von Levofloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 6791 und WAL R 13267 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) VA 6886 im in vitro PK/PD-Modell. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.
Mit Levofloxacin werden die KBE des B. fragilis Stammes RMA 5120 in der Mischkultur
(Abb. 21) moderat reduziert (Abtötungsrate 40,5%). Im Vergleich mit der Kontrollkultur
ohne Antibiotikum ist diese Reduktion aber nicht signifikant (p > 0,05). Im Gegensatz dazu
kommt es in der Mischkultur mit Levofloxacin bei dem B. fragilis Stamm RMA 0309 zu
einer geringen, aber dennoch signifikanten Reduktion der KBE (p < 0,01; Abtötungsrate
7,8%). Allerdings wirkt Levofloxacin in den Monokulturen dieser beiden B. fragilis Stämme
signifikant besser auf die Reduktion der KBE als in den Mischkulturen (p < 0,05).
Abbildung 21: Aktivität von Levofloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 5120 und RMA 0309 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) VA 6886 im in vitro PK/PD-Modell. LEV+, mit Levofloxacin; LEV-, Kontrolle ohne Levofloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.
Ergebnisse
51
5.3.8 Aktivität von Moxifloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli
Stamm VA 4050 in Mischkultur
Für den E. coli Stamm VA 4050 lassen sich zwischen den Versuchen mit und ohne
Antibiotikum in den Mischkulturen mit den B. fragilis Stämmen RMA 6791, WAL R 13267,
RMA 5120 und RMA 0309 (Abb. 22 und 23) keine signifikanten Unterschiede im
Wachstumsverhalten feststellen (p > 0,05). Es bestehen ebenfalls keine signifikanten
Unterschiede im Vergleich der KBE dieses Stammes in Mono- und Mischkulturen im Ansatz
mit Moxifloxacin (p > 0,05).
Im Ansatz mit Moxifloxacin werden die KBE des B. fragilis Stammes RMA 6791 in der
reduziert Moxifloxacin die KBE des B. fragilis Stammes RMA 6791 in der Monokultur
signifikant besser als in der Mischkultur (p < 0,01). Bei dem B. fragilis Stamm WAL R 13267
bestehen mit und ohne Moxifloxacin zwischen den Misch- und Monokulturen keine
signifikanten Unterschiede im Wachstumsverhalten (p > 0,05).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 125
6
7
8
9
10
EC VA 4050 MOX+ EC VA 4050 MOX-BF RMA 6791 MOX+ BF RMA 6791 MOX-BF WAL R 13267 MOX+ BF WAL R 13267 MOX-
Zeit [h]
Log
10K
BE
/ml
Abbildung 22: Aktivität von Moxifloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 6791 und WAL R 13267 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) VA 4050 im in vitro PK/PD-Modell. MOX+, mit Moxifloxacin; MOX-, Kontrolle ohne Moxifloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.
Im Ansatz mit Moxifloxacin werden die KBE der B. fragilis Stämme RMA 5120
(Abtötungsrate 61,2%) und RMA 0309 (Abtötungsrate 60,8%) in den Mischkulturen (Abb.
23) signifikant reduziert (p < 0,01). Allerdings wirkt Moxifloxacin auch hier in den
Monokulturen signifikant besser auf die Reduktion der KBE als in den Mischkulturen (p
Abbildung 23: Aktivität von Moxifloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 5120 und RMA 0309 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) VA 4050 im in vitro PK/PD-Modell. MOX+, mit Moxifloxacin; MOX-, Kontrolle ohne Moxifloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.
5.3.9 Aktivität von Moxifloxacin gegenüber vier B. fragilis Stämmen und dem E. coli
Stamm BK 12944 in Mischkultur
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 125
6
7
8
9
10
EC BK 12944 MOX+ EC BK 12944 MOX-BF RMA 6791 MOX+ BF RMA 6791 MOX-BF WAL R 13267 MOX+ BF WAL R 13267 MOX-
Zeit [h]
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10K
BE
/ml
Abbildung 24: Aktivität von Moxifloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 6791 und WAL R 13267 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) BK 12944 im in vitro PK/PD-Modell. MOX+, mit Moxifloxacin; MOX-, Kontrolle ohne Moxifloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.
Für den E. coli Stamm BK 12944 ergeben sich zwischen den Versuchen mit und ohne
Antibiotikum in den Mischkulturen mit den B. fragilis Stämmen RMA 6791, WAL R 13267,
Ergebnisse
53
RMA 5120 und RMA 0309 (Abb. 24 und 25) keine signifikanten Unterschiede in den
Wachstumskurven (p > 0,05). Gleichfalls gibt es keine signifikanten Unterschiede der KBE
dieses E. coli Stammes zwischen Mono- und Mischkulturen in Anwesenheit von
Moxifloxacin (p > 0,05).
Im Ansatz mit Moxifloxacin werden die KBE des B. fragilis Stammes RMA 6791 in der
Abbildung 25: Aktivität von Moxifloxacin gegenüber zwei verschiedenen Stämmen von B. fragilis (BF) RMA 5120 und RMA 0309 in Mischkultur zusammen mit E. coli (EC) BK 12944 im in vitro PK/PD-Modell. MOX+, mit Moxifloxacin; MOX-, Kontrolle ohne Moxifloxacin. Nachweisgrenze: 101 KBE/ml.
Ergebnisse
54
5.3.10 Zusammenfassung der PK/PD-Untersuchung
Mit Levofloxacin kommt es unter aeroben und anaeroben Bedingungen in den Monokulturen
zu einer signifikanten Reduktion der KBE des E. coli Stammes ATCC 25922 (p < 0,01).
Allerdings wirkt Levofloxacin nur unter aeroben Versuchsbedingungen bakterizid auf diesen
Stamm. In den Monokulturen der E. coli Stämme VA 4050, BK 12944 und VA 6886 lassen
sich unter aeroben und anaeroben Versuchsbedingungen in den Ansätzen mit Levofloxacin
keine signifikanten Unterschiede in den Wachstumsraten feststellen (p > 0,05). Des Weiteren
kommt es in den Monokulturen mit Levofloxacin zu signifikanten Reduktionen der KBE der
B. fragilis Stämme RMA 6791, RMA 5120 und RMA 0309 (p < 0,01). In den Mischkulturen
bestehen bei den Versuchen mit und ohne Levofloxacin in Bezug auf die KBE des E. coli
inhibitory concentrations (MICs) of antibacterial agents by agar dilution. Clin Microbiol Infect 2000, 6(9):509-15.
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Erklärung
76
9 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige Hilfe
oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich versichere, dass
Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten
haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, und dass
die vorgelegte Arbeit weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer
anderen Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion oder eines anderen
Prüfungsverfahrens vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen
übernommene Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug
genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen
genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.
……………………………….. ………………………………………..
Datum Unterschrift
Danksagung
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10 Danksagung Ich möchte mich bei allen Menschen bedanken, die es mir ermöglicht haben, eine
Doktorarbeit anzufertigen und vor allem fertigzustellen.
In erster Linie möchte ich mich bei meiner großen Familie bedanken.
Lieber David, Danke, dass Du während der gesamten, wenn auch nicht immer leichten Zeit,
für mich da warst.
Liebe Mama, lieber Papa, liebe Oma, lieber Opa († 02.06.2012), Danke für Wochen, die Ihr
Emma zu Euch genommen habt, damit ich meine Arbeit schreiben konnte.
Ganz besonderer Dank gilt meiner Schwester Dana, die mich immer wieder aufgebaut hat
und mir viele hilfreiche Ratschläge gegeben hat.
Insbesondere gilt mein Dank PD Dr. med. Reiner Schaumann für die Bereitstellung des
Themas, die Unterstützung, Motivation und kritische Auseinandersetzung mit meiner Arbeit.
Ich bedanke mich bei Prof. Dr. med. Arne C. Rodloff für die Möglichkeit der Durchführung
meiner Doktorarbeit an seinem Institut.
Des Weiteren möchte ich bei den Mitarbeitern des Instituts für Medizische Mikrobiologie und
Infektionsepidemiologie der Universität Leipzig für Ihre Unterstützung und Hilfe bedanken.