PERCOBAAN VIPENENTUAN KADAR PROTEIN DALAM BAHAN MAKANAN SECARA
SPEKTROFOTOMETRI
A. Tujuan
Memahami dan melakukan penetapan kadar protein secara
spektrofotometri
B. Dasar Teori
1. Protein
Istilah protein berasal dari kata proteos yakni bahasa Yunani
yang berarti utama. Istilah ini dapat digunakan karena protein
merupakan zat paling penting dalam setiap organisme. Protein ini
merupakan molekul makro dengan berat molekul antara lima ribu
hingga jutaan gram per mol. Protein terdiri atas rantai-rantai
panjang asam amino yang terikat satu sama lain dengan ikatan
peptide. Hal inilah yang membuat protein ini lebih kompleks
daripada karbohidrat dan lemak dalam hal berat molekul dan
keanekaragamannya. Protein adalah bagian dari semua sel hidup dan
merupakan bagian terbesar dalam tubuh sesudah air (Sandjaja,
2009).Dalam kehidupan, protein memegang peranan penting. Proses
kimia dalam tubuh dapat berlangsung dengan baik karena adanya enzim
suatu protein yang dapat berfungsi sebagai biokatalis. Disamping
itu hemoglobin dalam butir-butir darah merah yang disebut
eritrosit. Eritrosit berfungsi sebagai pengangkut oksigen dari
paru-paru menuju keseluruh bagian tubuh yakni salah satu jenis
protein. Demikian pula zat-zat yang berperan untuk melawan bakteri
penyakit atau yang disebut dengan antigen yang merupakan pula jenis
protein (Poedjiadi, 2006)
Protein yang diperoleh dari makanan yang berasal dari hewan atau
tumbuhan. Protein yang berasal dari hewan disebut dengan protein
hewani, sedangkan protein yang berasal dari tumbuhan disebt dengan
protein nabati. Beberapa makanan sumber protein yakni daging,
telur, susu, ikan, beras, kacang, kedelai, gandum, jagung dan
buah-buahan (Sandjaja, 2009).
2. Analisis Protein pada Makanan
Penentuan kadar protein dalam bahan makanan dengan tujuan yang
beragam, diantaranya untuk menentukan kadar protein total dalam
bahan makanan, menentukan tingkat kualitas protein yang dipandang
dari sudut gizi dan menelaah protein sebagai salah satu bahan kimia
seperti yang dilakukan pada bidang biokimia. Penentuan kadar
protein total dalam bahan makanan dapat dilakukan dengan beberapa
metode antara lain yakni dengan metode spektrofotometri UV, metode
Kjeldahk, Lowry, Metode Biuret, metode turbidimetri, metode
pengecatan dan penentuan protein dengan titrasi formal (Maharani,
2010).Protein merupakan zat makanan yan amat penting bagi tubuh
karena disamping berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh juga
berfungsi sebagai zat pembangun dan pengakhir. Protein merupakan
sumber sejumlah asam amino yang mengandung unsur C, H, O dan N yang
tidak dimiliki oleh lemak atau karbohidrat. Molekul protein juga
mengandung fosfor dan belerang. Sebagai zat pembangun, protein
merupakan bahan pembentuk jaringan baru yang selalu terjadi didalam
tubuh. Pada masa kehamilan protein membentuk jaringan baru dan
embrio. Fungsi utama protein bagi tubuh adalah untuk membentuk
jaringan dan mempertahankan jaringan yang telah ada (Husni,
2008).Protein dapat juga dibagi menjadi dua golongan utama
berdasarkan bentuk dan sifat-sifat fisik tertentu, yaitu: a.
Protein globular
Protein globular rantai atau rantai-rantai polipeptida berlipat
rapat-rapat menjadi bentuk globular atau bulat yang padat, protein
globular biasanya larut didalam sistem larutan (air) dan segera
berdifusi, hampir semua mempunyai fungsi gerak dan dinamik. Hampir
semua enzim merupakan protein globular, seperti protein transport
pada darah, antibodi, dan protein penyimpan nutrien.
(Lehninger, 1982)Protein globular umumnya berbentuk bulat atau
elips dan terdiri dari atas rantai polipeptida yang berlipat. Pada
umumnya gugus R polar terletak disebelah luar rantai polipeptida,
sedangkan gugus R yang hidrofob terletak disebelah dalam molekul
protein.
(Poedjiadi, 2006)b. Protein Serabut
Bersifat tidak larut didalam air, merupakan molekul serabut
panjang, dengan rantai polipeptida yang memanjang pada satu sumbu,
dan tidak berlipat menjadi bentuk globular. Hampir semua protein
serabut memberikan peranan struktural atau pelindung. Protein
serabut ysng khas -keratin pada rambut dan wol, fibroin dari sutra
dan kolagen dari urat (Lehninger, 1982).
Peneraan jumlah protein secara empiris yang umum dilakukan
adalah dengan menentukan jumlah nitrogen (N) yang terkandung oleh
suatu bahan makanan. Cara penentuan ini dikembangkan oleh Kjeldahl,
seorang ahli kimia Denmark pada tahun 1883. Dalam penentuan protein
seharusnya hanya nitrogen yang berasal dari protein saja yang
ditentukan. Akan tetapi hal ini secara teknis sulit sekali
dilakukan dan mengingat jumlah kandungan senyawa lain selain
protein dalam bahan biasanya sangat sedikit, maka penentuan jumlah
N total ini tetap dilakukan untuk mewakili jumlah protein yang ada.
Kadar protein yang dapat ditentukan berdasarkan cara Kjeldahl ini
dengan demikian sering disebut sebagai kadar protein kasar
(Sumarni, 2002).
Pengukuran kadar protein dapat dilakukan secara kuantitatif dan
kualitatif. Cara kuantitatif dapat dilakukan dengan cara
spektrofotometri UV dan kolorimetri, cara Kjeldahl dan titrasi
Formol. Cara tak langsung ada dua metode, pertama yakni berdasarkan
pengikatan zat warna misalnya Bradfrod, Nynhidrin, Brom Cresol
Grren. Sedangkan metode yang lain adalah berdasarkan pengikatan
dengan tembaga, seperti metode Biuret, Lowry, metode BCA (Bicin
Croninic Acid) dan juga metode FeCl3.
(Katili, 2009)3. Spektrofotometri Spektrofotometri merupakan
suatu metode analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar
monokromatis oleh suatu laajur larutan berwarna pada panjang
gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi
difraksi dengan detector fototube. Alat yang digunakan disebut
dengan spektrofotometer. Komponen utama dari spektrofotometer yakni
sumber cahaya, pengatur intensitas, monokromator, kuvet, detector,
penguat dan indikator (Poedjiadi, 2006)
Penetapan kadar protein secara biuret dilakukan dengan bantuan
alat spektrofotometer. Prinsipnya adalah pengukuran serapan cahaya
oleh ikatan kompleks berwarna ungu yang terjadi bila protein
bereaksi dengan ion Cu2+ dalam suasana basa. Kemudian diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm, ini merupakan panjang
gelombang serapan maksimum untuk warna ungu.
Protein dapat ditetapkan kadarnya dengan metode biuret. Prinsip
dari metode biuret adalah ikatan peptida dapat membentuk senyawa
kompleks berwarna ungu dengan penambahan garam kupri dalam suasana
basa. Reaksi biuret terdiri dari campuran protein sodium hidroksida
(berupa larutan) dan tembaga sulfat. Warna violet adalah hasil dari
reaksi ini. Reaksi ini tidak terjadi pada makromolekul lainnya
(Carpette, 2005).C. Alat dan Bahan
1. Alat
a. Batang pengaduk
b. Corong kaca
c. Gelas kimia 50 mL dan 100 mL
d. Kaca arloji
e. Kuvet
f. Labu takar 25 mL; 100 mL; 250 mLg. Pipet ukur 15 mL; 100 mLh.
Pipet tetes
i. Propipet
j. Spektrofotometri uv-vis
k. Timbangan analitik
2. Bahan
a. Albumin standar
b. Aquades
c. NaOH 0,5 M
d. Pereaksi biuret
e. Sampel
1) Susu kedelai
2) Susu sapi
3) Telur ayam ras
4) Telur ayam kampung
5) Telur bebek
6) Telur puyuh
D.Bagan kerja
1. Penentuan kalibrasi
1 mL albumin standar (5g/dL)
Aquades ad. Tanda batas
Diambil
1 mL 2 mL 3 mL 4 mL 5 mL 200 ppm 400 ppm 600 ppm 800 ppm 1000
ppm
+ biuret 3 mL
+ aquades ad. tanda batas2. Penentuan protein
Air sampel
+ 1 gram putih telur
+ NaOH 0,5 M sebanyak 5 mL
+ aquades ad. Larut
+ biuret 3 mL
Didiamkan t = 10 menit
Suhu 37 - 38C
Diinkubator
Diukur absorbansi
3. Pembuatan pereaksi biuret Larutan A Larutan B
+ CuSO4 0,375 g + NaOH 10% 10 g
+ KH4C4 1,5 g
+ Aquades 50 mL + Aquades 50 mL
Dicampurkan
Dihomogenkan
E. Hasil Pengamatan
1. Tabel Hasil Pengamatan
a. Tabel panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang (nm)Absorbansi
540
545
550
555
5600,096
0,098
0,099
0,098
0,096
b. Tabel kurva standar
Konsentrasi (ppm)Absorbansi
200
400
600
800
10000,021
0,082
0,099
0,118
0,207
c. Tabel kadar protein
NoSampelAbsorbansiKadar (%)
1.
2.
3.
4.
5.
6.Susu kedelai
Telur bebek
Susu Sapi
Telur ayam kampung
Telur ayam ras
Telur puyuh0.240
0.019
0,749
0,030
0,022
0,00312,59
1,76
37,54
2,30
1,91
0,98
2. Perhitungan
a. Pembuatan larutan baku
1). 200 ppm
M1 . V1 = M2 . V2 2000 ppm . 1 mL = M2 . 10 mL
M2 = 200 ppm
2). 400 ppm
M1 . V1 = M2 . V2 2000 ppm . 2 mL = M2 . 10 mL
M2 = 400 ppm
3). 600 ppm
M1 . V1 = M2 . V2 2000 ppm . 3 mL = M2 . 10 mL
M2 = 600 ppm
4). 800 ppm
M1 . V1 = M2 . V2 2000 ppm . 4 mL = M2 . 10 mL
M2 = 800 ppm
5). 1000 ppm
M1 . V1 = M2 . V2 2000 ppm . 5 mL = M2 . 10 mL
M2 = 1000 ppm
b. Uji kuantitatif
NilaiA= - 0,017
B= 0,000204
r= 0,9565
Persamaan regresi kurva baku ialah y = 0,000204x 0,017
1). Susu kedelai
2). Telur bebek
3). Susu sapi
4). Telur ayam kampung
5). Telur ayam ras
6). Telur puyuh
3. Grafik
a. Kurva panjang gelombang maksimum
b. Kurva baku standar albumin
4. Reaksi
+ CuSO4 + NaOH
+ Na2SO4 + H2O
F. PembahasanPercobaan ini mengenai penentuan kadar protein
dalam bahan makanan secara spektrofotometri yang bertujuan untuk
memahami dan dapat melakukan penetapan kadar protein seara
spektrofotometri. Protein merupakan zat makanan yang paling
kompleks, terdiri dari karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen, sulfur
dan basa forfor. Protein merupakan makromolekul polipeptida yang
tersusun dari sejumlah L-asam amino yang dihubungkan oleh ikatan
peptida. Fungsi protein yaitu sebagai bahan bakar energi bagi
tubuh, sebagai zat pembangun dan memberbaiki sel-sel yang rusak,
untuk pertumbuhan, pemeliharaan jaringan, pembentukan senyawa tubuh
yang esensial. Protein juga mampu membentuk antibodi, sebagai
transportasi nutrien dan regulasi keseimbangan air. Fungsi protein
yang tidak kalah penting yakni sebagai katalik (mempercepat laju
reaksi). Protein dalam bahan pangan umumnya ditemukan pada
kacang-kacangan, produk daging, telur, susu dan makanan
laut.Penentuan kadar protein pada percobaan kali ini dilakukan
dengan cara menentukan panjang gelombang maksimum untuk pembuatan
kurva kalibrasi terlebih dahulu. Panjang gelombang maksimum
merupakan panjang gelombang dimana didapatkan absorbansi maksimum
pada sampel. Pemilihan panjang gelombang maksimum ini, ditentukan
dengan maksud untuk mendapatkan absorbansi maksimum dari suatu
larutan baku pada konsentrasi tertentu sehingga didapatkan kepekaan
yang tinggi untuk dapat ditentukan kurva kalibrasinya. Hukum
Lambert-Beer menyatakan hubungan linieritas antara absorban dengan
konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan
transmitan, dalam hukum Lambert-Beer tersebut ada beberapa
pembatasan, yaitu sinar yang digunakan dianggap monokromatis,
penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang yang
sama, senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung
terhadap yang lain dalam larutan tersebut, tidak terjadi
fluorensensi atau fosforisensi, dan indeks bias tidak tergantung
pada konsentrasi larutan kurva kalibrasi menunjukkan hubungan
antara konsentrasi baku dan absorbansi sehingga diperoleh persamaan
regresi linier. Persamaan regresi ini digunakan untuk menghitung
kadar protein didalam sampel. Larutan standar yang digunakan dalam
percobaan ini adalah albumin standar. Albumin standar digunakan
bertujuan sebagai pembanding antara sampel yang akan diuji. Larutan
stok adalah larutan yang dibuat diawal dengan konsentrasi tinggi
untuk mempermudah pembuatan larutan seri konsentrasi dengan
pengenceran. Tujuan dibuatnya larutan stok adalah untuk menghindari
penimbangan yang berulang-ulang dalam setiap pembuatan larutan seri
konsentrasi dan mempermudah pengerjaan. Pembuatan kurva kalibrasi
dilakukan dengan membuat seri konsentrasi dengan menggunakan
albumin standar yang diencerkan dengan aquadest dengan penambahan
pereaksi biuret. Tujuan dari pengenceran ini yaitu untuk menurunkan
konsentrasi albumin, karena jika terlalu tinggi maka, albumin yang
akan bereaksi dengan biuret akan terlalu pekat sehingga mengganggu
proses pembacaan absorbansi oleh spektrofotometer. Setelah
pembuatan larutan seri konsentrasi albumin standar maka dibuat
blanko standar yang berisi pereaksi biuret dengan aquades, fungsi
dari blanko yaitu untuk mengukur serapan pereaksi yang digunakan
sehingga jumlah serapan protein sendiri adalah nilai absorbansi
larutan standar atau sampel (mengandung pereaksi) dikurang dengan
serapan pereaksinya. Sedangkan larutan seri konsentrasi berfungsi
untuk menentukan kurva kalibrasi dimana masing-masing larutan seri
konsentrasi tersebut akan dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometer sehingga dapat ditentukan panjang gelombang
maksimum dan kurva kalibrasinya.Pada penentuan kurva kalibrasi ini
didapatkan nilai a = -0,17; b = 0,000204; dan nilai r = 0,9565,
sehingga didapat persamaan regresi linear y = 0,000204x 0,017.
Koefisien korelasi menunjukkan adanya hubungan proporsional antara
absorbansi dan konsentrasi larutan. Nilai r positif menunjukkan
korelasi yang berbanding lurus antara konsentrasi terhadap
absorbansinya pada rentang konsentrasi larutan standar tersebut.
Koefisien korelasi (r) dikatakan baik apabila mendekati 1. Nilai r
yang diperoleh pada percobaan berada dalam rentang nilai antara -1
R 1 dan mendekati 1, sehingga dapat dikatakan linearitas data yang
diperoleh antara konsentrasi dan absorbansi cukup baik dan metode
tersebut dapat digunakan untuk analisis kadar protein.Prinsip dari
spektofotometri berdasarkan hukum Lambert-Beer adalah apabila
cahaya monokromatik melalui suatu media maka serapan cahaya
tersebut diserap dan sebagian dipancarkan. Energi cahaya yang
diserap kemudian akan diubah menjadi listrik dan fotosel yang akan
dicatat, dimana besarnya energi listrik sebanding dengan sinar atau
cahaya yang masuk sehingga semakin tinggi intensitas cahaya yang
diserap.Metode biuret merupakan metode yang digunakan untuk
menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang mengandung ikatan peptida
(gugus amida). Uji biuret merupakan jenis pengujian untuk
identifikasi protein secara umum. Berarti uji Biuret akan selalu
memberikan hasil positif untuk semua jenis protein. Keuntungan dari
metode biuret ini adalah bahan yang digunakan relatif murah akan
tetapi kelemahan dari metode ini adalah sensitivitas terhadap bahan
yang diidentifikasi rendah sehingga diperlukan bahan dalam jumlah
yang tidak sedikit.Reagen biuret terdiri dari CuSO4, KI, Na-sitrat,
Na2CO3 dan NaOH. CuSO4 sebagai penyedia ion Cu2+ yang nantinya akan
membentuk kompleks dengan protein. KI berfungsi untuk mencegah
terjadinya reduksi pada Cu2+ sehingga tidak mengendap. Na-sitrat
dan Na2CO3 berfungsi sebagai buffer dan NaOH berfungsi sebagai
penyedia suasana basa. Suasana basa akan membantu membentuk Cu(OH)2
yang nantinya akan menjadi Cu2+ dan 2OH-. Hal ini membantu untuk
membentuk kompleks dengan nitrogen dari karbon dari ikatan peptida
dalam larutan basa. Perubahan pada warna sampel uji akan memberikan
hasil yang positif atau negatif.Prinsipnya adalah pengukuran
serapan cahaya oleh ikatan kompleks berwarna ungu yang terjadi bila
protein bereaksi dengan ion Cu2+ dalam suasana basa. Terjadinya
warna ungu terbentuk dari ikatan antara Cu2+ dan N, dimana Cu2+
sebagai asam lewis dan N sebagai basa lewis. Makin panjang suatu
ikatan peptida, maka warna ungu yang terbentuk makin jelas dan
makin pekat. Reagen Biuret adalah larutan berwarna biru muda, yang
berubah menjadi ungu bila bercampur dengan larutan yang mengandung
protein. Sebuah kompleks berwarna ungu terbentuk ketika ion tembaga
dari reagen biuret bereaksi dengan ikatan peptida pada rantai
polipeptida. Uji biuret ini dapat digunakan untuk mengetahui ada
atau tidaknya ikatan peptida dalam suatu senyawa sehingga uji
biuret dapat dipakai untuk menunjukan adanya senyawa
protein.Penentuan kadar protein dilakukan dengan menimbang sampel
dan kemudian diencerkan dengan aquades pada labu. Fungsi penambahan
aquadest ini adalah sebagai pelarut yang digunakan untuk melarutkan
sampel, kemudian ditambah NaOH 0,5 M untuk membantu melarutkan
sampel, NaOH dapat menyebabkan hidrolisis ikatan peptida dari
polimer protein sehingga sampel dapat larut dalam aquades. Setelah
itu, ditambah dengan pereaksi biuret dan didiamkan 10 menit
kemudian ditambahkan aquades dan dihomogenkan. Tujuan dari
didiamkan adalah untuk memberi waktu bagi pereaksi biuret untuk
bereaksi dengan protein dalam sampel dan tujuan dari penambahan
biuret adalah agar Cu2+ yang terdapat pada biuret dapat membentuk
ikatan kompleks ungu dengan protein pada sampel. Tujuan
penghomogenan adalah untuk mempercepat reaksi antara protein dengan
pereaksi biuret dengan cara meningkatkan kontak antara protein
dengan ion Cu2+ yang terdapat pada pereaksi biuret. Selanjutnya
diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 550 nm dan
kemudian ditentukan kadar protein total.Dari hasil pengukuran kadar
protein total pada sampel, didapatkan kadar protein total pada susu
kedelai, telur bebek, susu sapi, telur ayam kampung, telur ayam ras
dan telur puyuh yang didapat dari perhitungan berturut-turut adalah
12,59%, 1,76%, 37,54%, 2,30%, 1,91%, 0,98%. Berdasarkan data yang
diperoleh kadar protein dari yang paling besar ke yang terkecil
yaitu susu sapi, susu kedelai, telur ayam kampung, telur ayam ras,
telur bebek, telur puyuh, hal ini tidak sesuai dengan literatur
yang menyatakan kadar protein dari tinggi ke rendah yaitu telur
ayam kampung, telur puyuh, telur bebek, telur ayam ras, susu sapi,
susu kedelai. Kesalahan yang terjadi dikarenakan saat penghomogenan
tidak homogen secara sempurna dan adanya koloid pada susu yang
mengakibatkan absorbansi yang diperoleh tidak tepat sehingga kadar
yang diperoleh kurang tepat.
G.Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan
bahwa:
1. Kadar protein susu kedelai adalah 12,59%
2. Kadar protein susu sapi adalah 37,54%
3. Kadar protein telur ayam kampung adalah 2,30%
4. Kadar protein telur ayam ras adalah 1,91%
5. Kadar protein telur bebek adalah 1,16%
6. Kadar protein telur puyuh adalah 0,98%
DAFTAR PUSTAKA
Carpette. 2005. An Introduction to Practical Biochemistry. Mc
Graw Hill Book Company: Great Britany
Husni, Elidahanum. 2008. Analisa Zat Pengawet dan Protein dalam
Makanan Siap Saji Sosis. Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi Vol. 13
No.1Katili, Abu Bakar Sidik. 2009. Struktur dan Fungsi Protein
Kalogen. Jurnal Pelangi Ilmu Vol. 2 No. 5
Lehninger, Albert L, 1982. Dasar-Dasar Biokimia Jilid I.
Penerbit Erlangga: Jakarta.
Maharani, Endang Triwahyuni dan Yusrin. 2010. Kadar Protein
Kista Artemia Curah yang dijual Petambak Dikota Kembang dengan
Variasi Suhu Penyimpanan. Jurnal Pra Sidang Seminar Nasional Vol. 1
No. 1
Poedjiadi, Anna. 2006. Dasar-Dasar Biokimia. Universitas
Indonesia Press: Jakarta
Sandjaja. 2009. Kamus Gizi. Penerbit Buku Kompas: Jakarta
Sumarni. 2002. Estimasi Kadar Protein Dalam Bahan Pangan Melalui
Analisis Nitrogen Total dan Analisis Asam Amino. Jurnal Majalah
Farmasi Indonesia Vol. 1 No. 13 EMBED ChemDraw.Document.6.0
EMBED ChemDraw.Document.6.0
_1481439627.cdx
_1481439629.cdx