Práctica # 1 “Elaboración de Penicilina mediante la fermentación del Hongo Penicillium Chrysogenum”. Ingeniería de Fermentacion es Unidad Profesional Interdiscipli naria de Ingeniería Campus Guanajuato Página 1 Profesora: Diana Ramírez Sáenz INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INSTERDISCIPLINARIA DE INGENIERÍAS CAMPUS GUANAJUATO INGENIERÍA FARMACÉUTICA INGENIERIA DE FERMENTACIONES “E la bor a ci ón de l a peni c i lin a mediant e l a fermenta ci ón del Hongo Penici ll ium C hrysogenum ”6FV1 PROFESOR: DIANA RAMIREZ SAENZ ALUMNO: OSCAR EFRAIN FERNANDEZ DELGADO BOLETA: 2012660037 FECHA DE ENTREGA 03/12/2013
Producción del antibiótico penicilina a partir de la fermentación del hongo Penicillium Chrysogenum
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Objetivo: Producir un antibiótico grado farmacéutico de mayor uso en el mercado,
mediante la fermentación del hongo Penicillium Chrysogenum, aprovechando sus
propiedades bioquímicas y funciones microbiológicas, utilizando como fuente un medio de
cultivo enriquecido con nutrientes necesarios para su desarrollo, y con la ayuda de unbiorreactor de tanque agitado ―Lambda‖ especializado para su producción.
Objetivos específicos
Producción del antibiótico bencilpenicilina mediante la fermentación del hongo
Penicillium Chrysogenum, en un biorreactor ―Lambda‖ de tanque agitado.
Purificación del caldo sobrenadante, producto de la fermentación del hongo
mencionado, mediante una cromatografía de columna, logrando la extracción del
antibiótico puro.
Identificación del compuesto extraído, utilizando técnicas microbiológicas de
cultivo in vitro, mediante varios antibiogramas que contengan diferentes cepas, enlas cuales se compruebe con halos de inhibición bacteriana, la presencia del
antibiótico obtenido.
INTRODUCCIÓN
Un antibiótico se conoce como aquel compuesto químico producido ya sea por hongos obacterias, y que posee una actividad de defensa ante diferentes microorganismospresentes en cualquier medio ambiente, para el hongo proteger los nutrientes quenecesita, mediante la interferencia del compuesto mismo en diversos pasos delmetabolismo de los microorganismos enemigos. Por consiguiente se le considera unmetabolito secundario, porque es antimicrobiano y resulta capaz de inhibir un crecimiento
bacteriano. [3-4]
Estructura general del antibiótico
El compuesto orgánico principal es el ácido 6- aminopenicilánico (6 – APA), su fórmulacondensada es C16H18N2O4S y su esqueleto se muestra a continuación:
Figura 1: Estructura Orgánica general de la molécula de penicilinas
Apreciamos una estructura consistente en un anillo tiazolídinico con un anillo β- lactámico, y unaparte variable acilada en la posición 6, lo que demuestra que se pueden obtener varios tipos de
penicilina gracias a las propiedades estructurales de la molécula.Imagen extraída de: [http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Penicillin-G.svg]
La penicilina es un antibiótico producido por un hongo de nombre ― penicillium‖, que actúamediante el bloqueo de la actividad de la enzima transpeptidasa, generando uncruzamiento que conecta largos polímeros de azúcares formando la pared de la célulabacteriana, bloqueando irreversiblemente la actividad de la enzima por unión covalentecon el extremo funcional de la enzima misma. La obtención de la penicilina es un procesofermentativo que se realiza considerando una selección de los medios de comunicación(aquellos que proporcionan un ambiente favorable para el cultivo en cuestión, como laregulación del pH) adecuados para el rendimiento general de la fermentación,proporcionando un medio de cultivo que contenga todos los elementos necesarios para lasíntesis de materiales de la célula y la formación del producto deseado. [1-4]
Biosíntesis del Antibiótico
Se rige por la siguiente secuencia metabólica:
Figura 2.- Ruta metabólica que describe la producción de penicilina vía Penic i l l ium Chrysog enum
Se aprecia la ruta biosin tética del com puesto para dar com o pro duc to final penic il inas del t ipo G y VImag en ex traída de: Micr ob iol ogía Gen eral 2008
La producción del antibiótico se origina porque la penicilina tiene un precursor dondeyacen las bases de aminoácidos aromáticos, la penicilina es una ruta metabólica diferenteal ciclo de krebs que se engancha a los aminoácidos aromáticos que se generaron en el
ciclo mencionado. La fuente principal para que se lleve a cabo este proceso deriva de laglucosa (fuente de carbono) añadida al medio de cultivo, los antibióticos resultan a partirde metabolismos secundarios y rutas alternas del sustrato que sirva a la célula delmicroorganismo para deshacerse de las bacterias (mecanismo de defensa muy útil parasobrevivir bajo condiciones adversas) que pueden competir contra ellos hacia una fuentenutritiva. Para el caso de un medio de cultivo estéril y enriquecido, como representa unhongo in vitro, es menester añadir un precursor debido a que el hongo por naturalezaproducirá muy pocas cantidades del antibiótico, con el precursor se activara esa ruta
metabólica para que el hongo produzca mayores cantidades de penicilina demandadas.[2,4]
Factores microbiológicos propicios para fermentar un determinado hongo
En microbiología un medio de cultivo adecuado para todo tipo de hongo en general,incluyendo al penicillium, debe contener fuentes de carbono y nitrógeno principalmente.Según el modelo del Dr. Salomón Bartnicki (desarrollado en el año 1962), un medio decultivo mínimo y esencial debe contener fuentes de carbono, nitrógeno, sulfato de amonioy oligoelementos (donde se encuentran muchas sales con metales de transición, comoMn, Cr, Fe, Co), todos ellos requerimientos nutritivos necesarios para el desarrollo delmicroorganismo. [2,4]
Por último resta mencionar que una propiedad fundamental en los hongos, es quecontienen enzimas que son dependientes de metales como: Manganeso, Cromo, Hierro yCobalto, necesarios para que las enzimas cumplan su función, considerando que los
hongos son restrictivos en su crecimiento porque contienen muchas rutas metabólicasalternas para producir antibióticos, u otros metabolitos secundarios como pigmentos. Lasrutas metabólicas en los hongos poseen enzimas muy específicas que dependen demetales (metaloenzimas), y es importante que estén presentes en el medio de cultivo parael crecimiento y desarrollo del hongo, el medio debe tener un pH acido entre 4.5 y 5 (aexcepción del Penicillium, cuyo pH debe ser de 6.5 ya que influye a un mejor desarrollodel metabolito) puesto que a un valor mayor desarrollaría mayor cantidad de biomasa quela necesaria. [1-2,4]
Purificación
En términos microbiológicos y de Biorreactores, cuando se trabaja con cualquier cultivo y
se requiere la producción de un metabolito secundario en específico, para este caso laPenicilina, al añadir al cultivo cofactores que propicien en el hongo la producción de unaruta metabólica secundaria, este tendera a excretar muchos metabolitos secundariosposibles, no solamente uno, por ende se encontraran varios compuestos químicosinmersos en el caldo de cultivo, productos de la ruta metabólica originada. [2-4]
El compuesto de interés se encontrara inmerso junto con otros metabolitos secundariosposibles, y al tomar una alícuota y probarla en un antibiograma, no se conoceráexactamente que compuesto fue el que inhibió el crecimiento bacteriano, por ende elresultado esperado variara sin conocer que lo provoco. La purificación promueve aseparar el metabolito de interés de los otros metabolitos, mediante el uso de un solventecapaz de polarizar a los otros metabolitos y solubilizarlos para generar una separación de
fases, en estos casos apreciaremos dos fases: Orgánica (conteniendo a los otrosmetabolitos que no se necesitan) y Acuosa (contendrá el metabolito de interés). [1-3]
Para solubilizar metabolitos secundarios de desinterés, y propiciar la separación deambas fases, generalmente se usara un solvente orgánico de carácter polar, el cualarrastrara metabolitos no polares generando un precipitado, dejando en la fase liquida elmetabolito de interés, este compuesto se le conoce como ciclohexanona el cual atacaraen grupos aminos y carbonilicos de los metabolitos no polares propiciando una separaciónde fases y por ende un precipitado de carácter orgánico. [Wade 2012]
Por último, para la separación del antibiótico se utiliza la cromatografía en columna, estatécnica permite la separación de mezclas de sustancias, sus características y los factoresque en ella intervienen. Generalmente esta técnica se emplea en la purificación decompuestos químicos, ya que existe una afinidad diferencial de los distintos compuestosinmersos en la mezcla por la fase móvil o estacionaria, estos compuestos son arrastradospor un eluyente que los propicia a avanzar a lo largo de la columna, pero como no todoslos compuestos avanzaran a la misma velocidad, por consiguiente terminamos obteniendoel antibiótico de interés, ya que esperamos sea el compuesto que avance con mayorvelocidad que los otros. [1,4]
Presencia de penicilina mediante cuantificación de susceptibilidad microbiana
Existe una técnica fundamental dentro de la microbiología clínica llamada ―quimioterapiacon antimicrobianos‖, esta técnica ha venido jugando un papel vital para el tratamiento dediversas enfermedades infecciosas en seres humanos. Desde que se desarrollarondiferentes investigaciones acerca de las colonias microbianas por parte de Alexander
Fleming en 1924, Gerhard Dogmak en 1927 y Selman Waskman en 1932, han surgidocientos de agentes antimicrobianos, donde algunos han sido sintetizados y unos cuantosse encuentran disponibles para usos clínicos. Gracias a la gran variedad de agentesantimicrobianos existentes, podemos diagnosticar con un grado de certeza confiable, losagentes más apropiados para el tratamiento de diversos padecimientos a manerarutinaria. [5-7]
Figura 3: Se muestra que parte del metabolismo de un microorganismo se ve afectado por los diversosantibióticos.
Extraída de: [Delgado, A. (2010). Obtención de penicilina y comprobación de su actividadantimicrobiana. Bi ot ecn ol og ía Farm acéut ica . Instituto Politécnico Nacional]
Desde la síntesis de la penicilina, se han descubierto muchos antibióticos capaces decombatir todo tipo de enfermedades causadas por infecciones microbianas, pero el usoincorrecto y excesivo de los mismos, ha llevado a que las bacterias desarrollen ciertaresistencia hacia los mencionados, derivando en microorganismos multiresistentes, por talrazón se efectúan pruebas de sensibilidad, para corroborar cuál es el antibiótico másadecuado para atacar a un determinado microorganismo. Estas pruebas consistenprincipalmente en dos tipos, difusión y dilución, que nos ayudan a determinar lasensibilidad de un determinado microorganismos, para la elección del antibióticoapropiado. [5-6,8]
Figura 4: Inhibición en el crecimiento de la bacteria E. Coli por efecto del antibiótico Amoxicilina
Extraída de: [Trabajos experimentales realizados en laboratorio de Microbiología Farmacéutica enUPIIG-IPN]
La metodología empleada para realizar el estudio de susceptibilidad, toma enconsideración algunos de estos factores para determinar de manera eficiente cómo unmicroorganismo podría responder a un determinado antibiótico. [6,9]
Virulencia
Alta concentración de organismos
Infección mixta
Desarrollo de resistencia durante el tratamiento
Existen factores propios del agente antimicrobiano, como son absorción, distribución,metabolismo, eliminación, unión a proteínas plasmáticas y otros parámetrosfarmacocinéticos, los cuales pueden influenciar la respuesta del paciente. Debido a quelos microorganismos tienen susceptibilidad variable a agentes antimicrobianos, esnecesario tener una herramienta que permita determinar la susceptibilidad delmicroorganismo causante de la infección. [5-9]
Cada vez son menos los organismos que tienen susceptibilidad predecible, por lo quedebemos hacer estudio de susceptibilidad en la mayoría de los microorganismos aislados.La indicación primaria para el estudio de susceptibilidad es determinar el antibiótico másapropiado para iniciar la terapia en un paciente con un proceso infeccioso. En la mayoríade los casos, cuando comienza una enfermedad se indica un antibiótico de amplioespectro (o una combinación de antibióticos) hasta obtener resultados acerca de laidentificación del germen causal de la infección. Posteriormente al obtener una respuesta,puede indicarse un antibiótico más específico. [2,8]
En este momento existen varios métodos basados en la biología molecular que puedenser usados para detectar resistencia específica a varios antimicrobianos, pero su uso derutina no está indicado. Estos métodos son principalmente usados con finesepidemiológicos, para monitorear resistencia a antibióticos. [7]
Materiales, Reactivos y Equipo
Material Reactivos3 matraces erlenmeyer de 500 mL Glucosa
2 charolas de aluminio Sulfato de amonio
1 Espátula Extracto de levadura
2 Probeta 50 mL KCl
1 Mechero de bunsen MgSO4
2 Asa para sembrar FeCl3
Algodón Etanol al 90°
Gazas Caja petri con hongo de penicillium cultivado
Papel destraza Tubo con esporas
2 matraces erlenmeyer de 1 L Ciclohexanona
Pinzas de disección Solución acido sulfúrico 1 N
Encendedor Agar PDAProbeta de 5 L Agar Bacteriológico
5 Lámparas de alcohol Peptona de Caseína
4 tubos Falcón Cloruro de sodio
Embudo de separación Penicilina Comercial
Columna cromatografía anionica Tubo eppendorf con esporas
Papel Filtro Cepa de cultivo con Lotto
1 Porta Objeto Cepa de cultivo con E. Coli
2 Cubre Objetos Cepa de cultivo con Salmonella
1 Caja petri de vidrio Agua destilada
Equipo para cromatografía de intercambioiónico
Equipo
Tubos Eppendorf estériles Equipo para filtración al vacio
Micropipeta de 1000 µL BombaPuntas para micropipeta Bomba peristáltica
Preparación de 200 mL de medio de cultivo enriquecido
Se utilizaron las siguientes cantidades de cada reactivo:
Tabla 1: Cantidades y reactivos empleados para la elaboración del medio de cultivo enriquecido
Reactivos Cantidad (g)Glucosa 8
Sulfato de amonio 0.6
Extracto de levadura 0.4
KCl 0.1
MgSO4 0.1
FeCl3 0.1
Cada componente del medio se añadió con la finalidad de desarrollar la correctaproliferación del hongo que posteriormente se vaya a inocular en el mismo, brindándole
un correcto desarrollo y atendiendo a las demandas microbiológicas y bioquímicas del
hongo en común.
Contrastando con la literatura y algunos trabajos industriales de carácter farmacéutico, el
medio de cultivo que se preparo y los ingredientes que formaron parte del mismo, resultan
indispensables para propiciar la proliferación del hongo penicillium en el sustrato [1]. Es
importante mencionar que cada uno de los ingredientes indicados tiene su función
bioquímica en el medio de cultivo enriquecido, así se le añaden sales al mismo, porque
nuestro hongo es un ser vivo (microorganismo) y necesita de electrolitos para poder
desarrollarse, las sales también disminuyen las probabilidades de contaminación al mediodebido a que lo purifican y no permiten que se desarrollen bacterias, si se le hubiera
añadido cloruro de sodio se rompe el equilibrio de las bombas sodio y potasio y no se
desarrolla completamente (se limita mucho su crecimiento), en cambio con el cloruro de
potasio se genera el equilibrio adecuado [3-4].
La glucosa se le añade debido a que es una fuente de carbono y es básica para su
desarrollo, contribuye a formar los componentes estructurales y sirve como fuente de
energía para el microorganismo, considerando que cualquier organismo debe de pasar
por el ciclo de krebs, desdoblar la glucosa para producir piruvato (glucolisis) cuya única
vía de salida es el ciclo de Krebs para sintetizar todos los intermediarios y aminoácidos.
La razón por la que se le añade extracto de levadura al medio de cultivo, aparte de quesigue aportando fuentes de carbono al microorganismo en caso de que ya no cuente con
glucosa, es porque representa el proceso metabólico principal para llevarse a cabo la
fermentación, transformando los azucares en etanol por metabolismo oxidativo que
incluye la glucolisis y ciclo de krebs en hongos [2-4]. Por lo que todos los
microorganismos requieren de carbono, hidrógeno, oxígeno, azufre y nitrógeno para su
crecimiento celular, demandando pequeñas cantidades de elementos traza como Cu, Mn
En el hongo que se identifico al microscopio se apreciaron las siguientes características:formaba conidios en una estructura ramificada, algunas ramificaciones presentaron dos
tipos de estructuras: las monoverticiladas y biverticiladas, especie esponjosa con
vellosidades la cual se asemejaba mas una esponja dura y a punto de romperse debido a
que no se le agrego agua al microcultivo y por ende no se encontraba hidratado.
La hidratación es un factor importante en microorganismos del reino Fungi, ya que sin
agua el hongo no puede sobrevivir y por ende no tendera a producir el antibiótico, aparte
de ser necesaria para el cumplimiento de sus funciones fisiológicas, representa un
inductor de sus rutas metabólicas las cuales serán compatibles con el precursor que
propiciara la máxima producción de antibiótico posible. En este caso como se trato de un
microcultivo el hongo apenas se alcanzo a apreciar, aunque se corrió el riesgo deconfundirse con el hongo de la estreptomicina, ya que al estar deshidratado el hongo le
dio una apariencia similar a la estreptomicina, y despreciar al mismo antes de continuar
con el trabajo experimental. [1,3-4]
Preparación de 800 mL de medio de cultivo enriquecido, 400 mL para cada matraz
Tabla 2: Cantidades y reactivos empleados para la elaboración del medio de cultivo enriquecido
Reactivos Cantidad (g)Glucosa 16
Sulfato de amonio 1.2
Extracto de levadura 0.8KCl 0.2
MgSO4 0.2FeCl3 0.2
Se preparo el medio de cultivo en dos matraces erlenmeyer de 1 L cada matraz, y seañadieron las cantidades indicadas en la tabla para preparar 400 mL de medio en cadauno. Una vez preparado el medio y verificando que la base del biorreactor estuvieralimpia, se procede a verter los 800 mL de medio en la base, y se mete al autoclave paraesterilización, protegiendo el mismo cerrando bien cada orificio.
Imagen 1.- Medio de cultivo con el hongo desarrollado.
Se aprecia la fermentación del hongo penicillium en el Biorreactor.
Después de una semana que se dejo fermentando el hongo en el medio de cultivo, se
aprecio una cantidad considerable de biomasa, y se procedió a llevar a cabo una filtración
de vacio para separar la biomasa del sobrenadante y posteriormente realizar una
purificación en base al sobrenadante extraído.
En un trabajo industrial realizado en la farmacéutica Shering Plaug se realizo
fermentación de penicillium en un biorreactor más sofisticado y con la mayoría de los
ingredientes añadidos al medio que se preparo en esta práctica, según sus resultados,
tienen comparación con los obtenidos en la práctica debido a la explicación tanto
bioquímica como microbiología de las condiciones y nutrientes que demanda el hongo;
Alexander Fleming que fue el que descubrió el antibiótico comprobó que con la glucosa y
el extracto de levadura se producía la fermentación en el hongo para producir una
sustancia capaz de eliminar bacterias, descubrimiento que fue un gran avance al mundo
de la ciencia y sobre todo la medicina. Todo el medio preparado se hizo en base a las
necesidades que demandan el hongo penicillium para su desarrollo, considerando quenecesita una atención especial para desarrollarse y si no se le brinda lo necesario el
hongo se contamina o simplemente no se desarrolla y expira. Por ende todas las
consideraciones anteriores al preparar el medio antes de efectuar una inoculación. [2,4]
Realizando una investigación más profunda, también se discute que pudo haberseutilizado sacarosa, su efecto respecto a nuestro medio de cultivo hubiese sido próspero,pero no brinda suficientes fuentes de carbono debido a su inestabilidad como moléculaorgánica (no tiene todas sus conformaciones en posición ecuatorial como la glucosa), porende bioquímicamente no se adapta completamente a las necesidades de desarrollo ycrecimiento en el hongo según la literatura contrastada. [1-4]
Imagen 2.- Cantidad de biomasa presente en el medio de cultivo fermentado
En otras investigaciones se encontró que el pH óptimo para que un hongo produzcamayor cantidad de antibiótico y menor cantidad de biomasa es de 4.5 a 5 a unatemperatura de 25 grados Celsius, debido a que una menor cantidad de biomasarepresenta mayor acción del precursor sobre el metabolismo secundario en un hongo.Para el caso del hongo penicillium se observo una buena proliferación a los 3 días defermentación a un pH 6.5 y una temperatura de 26 grados Celsius, pero se produjo muchabiomasa después de una semana en el fermentador. Según la literatura este no es buenopuesto que hora que se extraiga el antibiótico este no será tan efectivo como unantibiótico comercial, porque el precursor actuó como inductor del metabolismo primarioen lugar del secundario. Otros trabajos industriales señalan que mientras mayor numerode biomasa producida, mayor cantidad y efectividad del antibiótico procesado, debido aque alcanzo un estado estacionario, y una cantidad predominante de biomasa representaun crecimiento paulatino, el hongo se adapto bien durante su etapa “lag” y continuo uncrecimiento logarítmico exitoso. Su reproducción fue tan prospera que el antibióticoprocesado será identificado mediante un antibiograma en la primera prueba. [1-3]
Purificación del sobrenadante
Una vez realizada la filtración al vacio se obtuvo un caldo impuro el cual se procedió apurificar para obtener la penicilina. Después de centrifugar el caldo y añadirle 200 mL deCiclohexanona, dejar reposar 5 días y añadir a un tubo de decantación, se observo laseparación de dos fases: Orgánica (tenía otros metabolitos ajenos a la penicilina) de coloramarillo fuerte y Acuosa (contenía a la penicilina) de color amarillo claro. Se separa lafase acuosa y posteriormente se pasa sobre una columna cromatografía anionica, paraguardar y conservar el producto.
Es importante este proceso puesto que se tiene que extraer el antibiótico de los otrosmetabolitos inmersos en el caldo, para lo cual se centrifuga el sobrenadante y se le añade
ciclohexanona, cabe mencionar que la ciclohexanona es buena para solubilizarmetabolitos polares inmersos en el caldo, puesto que es un compuesto polar que ataca agrupos aminos y carbonilicos de otro metabolitos secundarios. Comparando con otrostrabajos experimentales de obtención de penicilina, se encuentra que anteriormente hubootros intentos de purificación utilizando otros solventes polares como: éter, cloruro demetileno y acetato de etilo, pero estos no resultaron en una separación de fasesadecuada, aparte de que muchos metabolitos secundarios se colaban en la fase acuosade penicilina, por ende el solvente orgánico que ha dado mayor resultado es laCiclohexanona, de haberse usado éter o cualquier otro mencionado, se hubiese obtenidouna fase acuosa de un amarillo más pronunciado. [Wade 2012]
Cuantificación en la concentración de penicilina obtenida
Todas las penicilinas tienen una estructura básica (figura 1), la cual tiene una absorbanciacon una longitud de onda entre 200 y 230 nm. Se tomó una longitud de onda de 285 nm,ya que el espectrofotómetro no admitía lecturas a menores longitudes de onda, aparte285 nm todavía se encuentra en el rango donde se obtiene una absorbancia relevante.
Tabla 3.- Concentración de cada una de las diluciones de Penicilina Comercial
Dilución Concentración Absorbancia
0 500 1.218
1 125 1.005
2 62.5 1.052
3 31.25 0.702
4 7.8125 0.561
5 3.90625 0.483
6 1.953125 0.464
7 0.48828125 0.289
Estos resultados se obtuvieron en el espectro UV-VIS, cabe mencionar que el aparatopresento algunas fallas técnicas y por consiguiente para la obtención de las absorbancias
observadas, se tuvo que calibrar el espectro en la toma de cada muestra de penicilinacomercial, obteniendo unas lecturas más adecuadas que las anteriores. Al elucidar lasabsorbancias en el espectro, de principio se efectuó una sola calibración, tomando comoblanco una celda con agua destilada, y arrojando unas lecturas bastantes variables y quemostraban datos inconsistentes, no mostraban ninguna tendencia en específico, por endese tuvo que volver a realizar el espectro para presentar la tabla aquí mostrada.
Gráfica 1: Curva de Calibración de la penicilina comercial
Debido a la inconsistencia de la grafica, y al resultado que arrojo en el cálculo de laconcentración de la penicilina obtenida por fermentación, que fue de 46,332.07385mg/mL, es notable que este dato es mayor que la concentración de la penicilinacomercial, y por tanto no es posible haber producido demasiada penicilina en un soloproceso. Por lo tanto se procede a eliminar los dos datos que se señalan de verde, serealiza una nueva regresión lineal, y se obtiene el siguiente grafico:
Gráfica 2: Curva de calibración de la penicilina comercial (mejorada)
Con esta gráfica, se obtiene una tendencia lineal y congruente en la curva de calibraciónde la penicilina comercial, contrastando estos resultados con las lecturas de absorbanciarealizadas al producto de la cromatografía de penicilina, que fue de 1.886, el resultadonos otorga una concentración final de 143.64 mg/mL, y para el producto sobrenadante,que fue de 1.795, el resultado fue una concentración final de 134.805 mg/mL.
Un factor que puede interferir en la lectura de la absorbancia para la penicilina comercial,son los excipientes contenidos en este medicamento, en especial la solución inyectable
que se adjunta en la presentación del mismo, otorgando valores no solo de la penicilinasino también de los componentes mencionados. [4]
Al comparar los resultados del grafico con varios análisis estadísticos en minitab, seelucida que este método es de los más exactos para la determinación de uncomportamiento grafico útil para conocer concentraciones y constantes, cabe mencionarque este tipo de datos resulto indispensable para la determinación de la concentración enproductos de penicilina obtenida por la fermentación, y como las concentraciones tuvieronun rango de números aceptable, por ende se corrobora la eficiencia del método dereferencia para conocer la cantidad de producto elaborado. [3]
Elaboración de Antibiograma
Se realizaron 9 antibiogramas en total con tres cepas de diferentes hongos (Lotto, B.Subtilus y Salmonella) y tres muestras distintas de penicilina (Comercial, sobrenadante yproducto de cromatografía), para comparar ambas y determinar la presencia de penicilinaobtenida después de la fermentación.
Imagen 6: Antibiograma infectado por hongos ajenos al cultivado y halos de inhibición penicilinasobrenadante a distintas concentraciones en cultivo salmonella
Imagen 7: Halos de inhibición de muestra sobrenadante de penicilina a distintas concentraciones encultivo B. Subtilus
Imagen 8: Halos de inhibición de producto cromatografía de penicilina a distintas concentraciones encultivo B. Subtilus
Imagen 9: Halos de inhibición de penicilina comercial a distintas concentraciones en cultivo Lotto
Imagen 10: Halos de inhibición de producto cromatografía de penicilina a distintas concentraciones encultivo Lotto
Considerando que cada antibiótico tiene un mecanismo de acción diferente, y cuenta condiferentes regiones moleculares activas, que pueden reaccionar con una bacteria, seusaron tres muestras distintas del mismo antibiótico, penicilina, aproximando lasconcentraciones de las mismas, a las concentraciones que se encuentran de maneracomercial tanto en forma farmacéutica, como medicamentos.
Como podemos apreciar en las siguientes imágenes, hubo inhibición en todos los cultivos
donde se colocaron sensidiscos impregnados con las distintas penicilinas trabajadas en el
laboratorio, la mayor inhibición apreciada en las tres cepas fue de la penicilina comercial,
posteriormente el producto obtenido de la cromatografía y al ultimo la muestra
sobrenadante. Con los halos de inhibición obtenidos se corrobora la presencia y
producción de penicilina en la fermentación, y se aprecia que la excesiva biomasa
(imagen 2) contenida al fermentar el hongo, no afecto a la obtención del antibiótico, sino
de lo contrario produjo mayor cantidad del mismo. A pesar de haberse contaminado las
cepas de las imágenes 3 y 6, se observa una inhibición en el crecimiento de los hongos
enemigos desarrollados, corroborando con mayor certeza la obtención del antibiótico
puro, a tal magnitud de propagarse una combinación de hongos por invasiones deespacio en el agar, que propagarse por el mismo, porque el antibiótico impedía
mencionada propagación, por consiguiente, la afectividad de los antibióticos ayudo a
inhibir una mayor contaminación en las cepas cultivadas en las cajas petri. [5-7,9]
La penicilina es un antibiótico que pertenece al grupo de las aminopenicilinas, de manerageneral, se sabe que la acción de este tipo de antibióticos, es bactericida, por lo queactúan sobre la pared celular inhibiendo la actividad transpeptidasa de las proteínasenzimáticas fijadoras en bacterias. [Faría Reyes & et al., 2000]
Un mecanismo de resistencia a este antibiótico, es la disminución de porinas de la paredcelular, disminuyendo así la permeabilidad, teniendo como consecuencia una inhibición, la
única bacteria capaz de inhibir por completo el antibiótico, es la Gram (-) Enterobacter,Lotto y salmonella en cambio fueron las bacterias más susceptibles ya que muestranhalos de inhibición más extensos. [6-8]
Imagen 11: Antibiograma más llamativo y sobresaliente, halos de inhibición de la muestrasobrenadante en la fermentación de penicilina, a distintas concentraciones en cultivo Lotto
En esta imagen se observan los halos de inhibición del producto sobrenadante de lapenicilina extraída a distintas concentraciones en cultivo Lotto, cabe mencionar que Lottoes gram (+), y por ende la inhibición tuvo lugar y no ofreció resistencia al antibiótico. Los
procesos biológicos por los que un microorganismo puede adquirir resistencia a unantibiótico son [5-7]:
Transformación: cuando se transfiere ADN del medio ambiente hacia la bacteria yse modifica el ADN de ésta.
Conjugación: Transferencia de ADN de una bacteria a otra por medio de unplásmido.
Transducción: Paso de material genético de una célula a otra a través de un fago. Evolución: A través de proceso de adaptación, selección natural y reproducción
diferencial.
Conclusión
Con base a los resultados obtenidos se concluye sobre la importancia de considerar los
factores necesarios para la preparación de un medio de cultivo enriquecido, adecuado a
un determinado microorganismo a desarrollar, ya que la fermentación de un metabolitosecundario en especifico, no solo es producto del tipo de biorreactor empleado para su
elaboración, sino de los factores microbiológicos adecuados al microorganismo
seleccionado para producirlo, tales como: reactivos, materiales, y condiciones
ambientales (esterilidad, pH y temperatura), ya que de ello depende el sano desarrollo del
hongo inoculado. Fundamentando que el medio de cultivo debe ser apropiado al
microorganismo de interés, y quedar exento de cualquier microorganismo contaminante,
esto se logra gracias a la añadidura de sales al medio de cultivo y la esterilización del
mismo, y la zona de trabajo, como cada uno de los materiales a emplear, durante la etapa
de inoculación.
También se menciona la importancia de la cantidad de biomasa producida en el medio,porque garantiza si hubo una correcta proliferación del hongo en el mismo y se excretaron
los metabolitos secundarios de interés, las condiciones de temperatura y pH deben ser tal
cual lo señalan trabajos experimentales y fuentes literarias, ya que el hongo Penicillium
Chrysogenum es adaptable a pH casi neutro y temperatura ambiente, ya que se propicia
su ruta metabólica secundaria la cual produce el antibiótico de interés.
La purificación del caldo de cultivo resulta esencial para la obtención del compuesto, se
necesita un antibiótico 100 % puro para poderse administrar por cualquier vía, por ende
su importancia, porque administrar una penicilina impura puede generar efectos
secundarios y adversos a la salud del consumidor, y como no se conoce a los otros
metabolitos secundarios producidos por el hongo Penicillium Chrysogenum, por lo tantose desconoce su acción y posibles efectos biológicos en el organismo.
Las Bacterias pueden tener diferentes métodos de resistencia a los antibióticos, esto
debido al uso descomunal que la industria farmacéutica ah dado a los mismos, en el área
de la salud, este es un tema de interés para la población civil, ya que se requieren de
nuevos fármacos capaces de inhibir un determinado crecimiento bacteriano por rutas
metabólicas alternas que no generen ningún tipo de resistencia. Para la realización de un
estudio de resistencia a antibióticos, no se puede generalizar a las bacterias por su
taxonomía ni tampoco por ser Gram (-) o Gram (+), porque cada bacteria tiene rutas
metabólicas diferentes, y puede darse el caso que bacterias del mismo género arrojen
resultados diferentes para cada antibiótico, lo mismo ocurre con los antibióticos, que apesar de estar en la misma clasificación pueden dar resultados distintos a los esperados,
por lo cual si se desean resultados precisos, lo mejor es manipular una determinada cepa,
con un seleccionado antibiótico.
Por último se produjo penicilina pura a una concentración de 143.64 mg/mL, gracias a lafermentación del hongo Penicillium chrysogenum en un biorreactor de tanque agitadolamba, y un medio de cultivo enriquecido con precursores necesarios para inducir alhongo a desarrollar un metabolismo secundario propicio a la excreción del antibióticodeseado. Se sometió el producto empleando métodos que implican bioseparaciones,procesos utilizados en la producción de antibióticos por la microbiología clínica.
Cuestionario Complementario
Nota: Este cuestionario se encontró en un protocolo experimental de una prácticade laboratorio de microbiología, y se decidió anexar las preguntas mas destacadasa procesos que no se elaboraron en el laboratorio de fermentaciones, pero que sonde gran utilidad conocerlos.
1. Explica en qué consiste la prueba “E”.
La prueba E o método PDM de epsilómetro ha sido usado exitosamente para analizaranaerobios y otros organismos aeróbicos. El término epsilómetro se refiere a una tira fina,
de 5 x 50 mm, inerte y no porosa con un gradiente continuo exponencial de agenteantimicrobiano inmovilizado en un lado y una escala de interpretación impresa en el otrolado. El gradiente de agente antimicrobiano cubre un amplio rango de concentración, quecorresponde aproximadamente diluciones dobles. La pendiente de los cambios y losrangos de concentración están óptimamente diseñados para corresponder a rangos ylímites de CIM clínicamente relevantes que son seleccionados para categorizar grupos desusceptibilidad. Se inocula una placa de agar, que contenga un medio de prueba apto,con un organismo de prueba de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego seaplican las tiras de prueba en un patrón óptimo de tal manera que la máximaconcentración en cada tira esté más cerca al borde exterior de la placa de Petri. La placaes inmediatamente incubada aeróbicamente o anaeróbicamente por el periodo de tiempoestipulado. Cuando es aplicado a una placa de agar inoculada, el gradiente
antimicrobiano de la tira es liberado inmediatamente en el agar, creando un gradientecontinuo y exponencial de concentraciones de agente antimicrobiano debajo del eje linealdel material de soporte. [7]
Después de la incubación, se observa una elipse de inhibición de crecimiento. Laintersección entre el borde de la zona de inhibición y la tira de soporte se produce en laconcentración del antimicrobiano que ya no es capaz de inhibir el crecimiento. El punto deintersección da la ―concentración inhibitoria‖ (CI) en µg/mL— una medida directa de la
susceptibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano probado. Las CIMs se leendirectamente sobre la escala en la tira de soporte. [8]
2. Explica, ejemplifica y esquematiza un proceso de sinergismo en antibióticos.
El sinergismo de los Antibióticos ocurre cuando el efecto de una combinación es mayorque la suma de los efectos de los antibióticos usados individualmente. En pacienteshospitalizados con cateterización venosa profunda y sonda vesical, la presencia de fiebre,escalofríos e hipotensión arterial se debe sospechar la presencia de una sepsis urinaria orelacionada con la cateterización, los microorganismos más comunes que puedenocasionarlas son los estafilococos y otros Gram positivos, así como algunos Gramnegativos potencialmente resistentes. En estas situaciones se han obtenido buenos resultados al combinar oxacilina o vancomicina con un aminoglucósido, fosfomicín, algunos monobactámicos y el augmentín. [8]
3. Discute los efectos en la salud pública por el reciente surgimiento de MRSA enhospitales.
La aparición de MRSA en hospitales y recientemente en la comunidad hace más difícil eltratamiento médico para infecciones con MRSA pues ya que al ser multiresistentes aantibióticos se necesita conocer muy bien los antibióticos que aún pueden ser útiles paratratar a estas cepas y no contribuir a que aumente su multiresistencia. [2-3]
4. Discute la importancia de la reforma al artículo 226, fracción IV de la Ley Generalde Saludrespecto a l surgimiento de cepas multiresistentes.
Es importante que un médico sea el que pueda controlar la prescripción de un medicamento y por su parte la adquisición de éste por el paciente, pues ya que así se promueve la buena aplicación de un tratamiento médico específico para las enfermedades que un paciente pudiera tener y no permitir la automedicación de la persona enferma y por consiguiente contribuir a la aparición de cepas multiresistentes a antibióticos. [7,9]
Referencias
[1] Romero Caballero Raúl. (2008). Microbiología y parasitología humana: basesetiológicas de las enfermedades infecciosas y parasitarias (1era Edición). México.Editorial Medica Panamericana.
[2] Melo Ruiz V. (2007). Bioquímica de los procesos metabólicos (2da Edición).México. Editorial Reverte.
[3] Microbial Technology. Microbial Processes. Second Edition (Volume I). Ed. H.J.Peppler and D. Perlman. Academic Press, N. Y., 1979.
[4] R M Atlas & B Bartha. (2005). Ecología Microbiana y Microbiología Ambiental.México. Editorial Pearson España.
[5][ Prescott, Harley, Klein][ Microbiología, quinta edición] [editorial McGRAW-HILLinteramericana]4FV1[6] [Michael T. Madigan, John M, Jack P, Brock] [Biologia de los Microorganismos,10° edición] [Pearson Prentice Hall]
[7] [Reporte multicéntrico de los resultados de los ensayos de susceptibilidad aantibióticos] [Ileana González Bonet, Fernando Travieso Ruiz,* Leonora GonzálezMesa, Estrella Álvarez Varela,* Gilberto Tillán Ochoa* y Rolando ContrerasAlarcón.*] [Departamento de Investigaciones Biomédicas, Centro de QuímicaFarmacéutica.][ Centro Nacional de Investigaciones Científicas. Avenida 25 y 158,Apartado Postal 6414, Playa, Ciudad de La Habana, Cuba.]
[8] [INTERPRETACION DE LOS ESTUDIOS DE SUSCEPTIBILIDADANTIMICROBIANA] [Boletín Escuela de Medicina. Pontificia Universidad Católica deChile][Dra. Elizabeth Palavecino Rosales]
[9] [Clasificación de Antimicrobianos y Quimioterápicos][Dra. Almudena CalvoZamorano][Capitulo 54]