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Fumar aumenta la genotoxicidad inducida por asbesto (amianto), la implicación relativa del cromosoma 1: estudio usando FISH multicolorcon etiquetado en tándem

Contreras Rosales Aldo JoséGarcía Martínez José AntonioMoreno Sanjuan José EduardoOrtegón Lozano Maria Fernanda

Asbesto

Se sabe que la exposición ocupacional al asbesto da lugar a varias manifestaciones patológicas

El asbesto es un grupo de silicatos minerales fibrosos y un carcinógeno bien establecido

varios estudios epidemiológicos y experimentales han demostrado que el proceso de desarrollo de la enfermedad se acelera en presencia de hollín de queroseno ambiental y humo de cigarrillo.

Los extractos de humo de cigarrillos aceleran la generación de OH * por el asbesto, que puede prevenirse con eliminadores de OH * y quelantes de hierro

El estudio fue diseñado para determinar si el tabaquismo hace que el sistema genético de las células sea más sensible y vulnerable a los efectos nocivos de la exposición al asbesto y para determinar la participación relativa del cromosoma 1 en el proceso dañino

Para observar la participación del cromosoma 1, realizamos un ensayo FISH multicolor en el mismo sistema.

MATERIALES Y MÉTODOSCultivo de células

Obtención de asbestos

Se obtuvieron fibras de asbestos (crocidolita y crisotilo). Se esterilizaron en autoclave a 100 °C, 2 h y se suspendieron en PBS

Recolección de sangre

Se obtuvo la sangre en jeringas heparinizadas de 6 fumadores saludables y de 6 voluntarios no fumadores

Cultivo

Se agregó 0.5 mL de sangre a 5.0 mL del medio RPMI 1640 en viales de cultivo

El portaobjetos se almacenó a 20 °C en una atmósfera de nitrógeno hasta su uso

Tratamiento de las células

Las células se trataron con diferentes concentraciones (10-50 µg/mL) de fibras y se incubaron a 37 °C, 48 h, 5% CO2

Posteriormente se trataron con una solución hipotónica de KCl (75 mM). Se fijaron en frío con el fijador de Carnoy (MeOH:ácido acético, 3:1), se enjuagaron y se realizó un frotis en un portaobjetos limpio

Ensayo de micronúcleos

Se prepararon los portaobjetos y se realizó una tinción de Giemsa.

Se contaron 2000 linfocitos binucleados

Cultivo de linfocitos

Se le agregó citocalasina-B a las 44 horas de incubación y fueron incubadas por 28 horas más

Se lavaron los cultivos en un buffer (0.9 mmol/L NH4HCO3 y 132 mmol/L NH4Cl) por 15 minutos, dos veces

Hibridación fluorescente in situ (FISH)

Técnica citogenética de marcaje de cromosomas mediante el cual éstos son hibridados con sondas que emiten fluorescencia.

“FISH Multicolor” es una adaptación que permite ver a los 23 pares de cromosomas a la vez.

FISH Multicolor

Los portaobjetos fueron tratados con una solución de formamida (70%) a 70 °C por 4 min, y se incubaron con la mezcla de hibridación 37 °C toda la noche

Sondas

Se utilizaron dos diferentes sondas de ADN: sonda alfa satélite y una sonda clásica satélite ambas para el cromosoma 1

Se amplificó la sonda clásica por PCR y se marcó con Cy3.

Se realizaron reacciones de hibridación

Análisis estadístico

El experimento se realizó por duplicado y en cada uno se contaron 2000 núcleos para la presencia de micronúcleos (t-Student) y aberraciones cromosómicas (prueba de Fisher)

Se lavaron los portaobjetos y fueron incubados con una solución anti-biotina por 20 minutos a temperatura ambiente

Se lavaron los portaobjetos en un buffer, se tiñeron y se contaron las células en un microscopio de fluorescencia

1000 células fueron contadas en cada caso

RESULTADOS prueba de micronúcleos.

Figura 1 cantidad de micronúcleos en linfocitos humanos expuestos a diferentes concentraciones de amianto crisotilo y crocidolita, en los linfocitos de sangre de los no fumadores y fumadores

Figura 2. linfocito binucleado con micronúcleo.

El número de micronúcleos fue significativamente mayor (PB /0.001) en el caso de fumadores de control contra el control de los no fumadores. ● Cuando los cultivos fueron expuestos a 10 mg / ml de crisotilo y crocidolita,

células de no fumadores mostró una media de 62.489 / 5.96 y 63.329 / 3.91 MN por 1000 células, respectivamente, en comparación, las células de los fumadores mostraron 68.279 / 6.92 y 75.109 / 6.90 MN por 1000 células, respectivamente.

● Se observó el mismo efecto cuando las células fueron expuestas a 50 mg / ml de crisotilo y crocidolita: células de los no fumadores mostraron 78.289 / 6.93 y 80.729 / 6.10 MN por 1000 células, respectivamente, mientras que las células de los fumadores mostraron 85.139 / 5.89 y 91.29 / 8.0 MN por 1000 células, respectivamente.

● Es decir en todos los casos las células de los fumadores mostraron mayor cantidad de micronúcleos.

RESULTADOS prueba de micronúcleos.

RESULTADOS prueba multicolor FISH

Figura 2. imagen de linfocitos de fumadores expuestos al asbesto, después de la hibridación fluorescente multicolor in situ con tándem etiquetado para dos regiones de ADN adyacentes en el cromosoma 1 (1 cen-q12). Célula normal (a), tetrasomía (b) y separación entre alfa y se pudo ver la región satelital clásica (c).

La técnica multicolor FISH se usó para marcar dos regiones adyacentes del cromosoma 1. La región heterocromatina pericéntrica de cromosoma 1 (1q12), que es bastante grande, repetitivo y propenso a la rotura, se etiquetó directamente con un satélite clásico conjugado Cy3 (rojo) sonda. Un centromérico adyacente o casi adyacente región (1-cen), que no es muy repetitiva, mucho más pequeño y mucho menos propenso a la rotura era etiquetado indirectamente con un satélite alfa (verde) sonda.

RESULTADOS prueba multicolor FISH

Tabla 1 Alteraciones cromosómicas (por cada mil células) en linfocitos humanos de fumadores y no fumadores, expuestos a fibras de amianto en vitro, después de usar sondas satelitales alfa y alfa etiquetadas en tándem para la región 1cen-1q12 del cromosoma 1

RESULTADOS prueba multicolor FISH

La frecuencia de estructural y aberración numérica en el cromosoma 1 que se presenta en la Tabla 1, nos indica que:● En el caso de linfocitos de fumadores de control, el número de roturas totales e

hiperdiploidía fueron un poco más altos en comparación con el de los linfocitos de los no fumadores, pero la diferencia no fue significativo.

● Las frecuencias de los descansos y la hiperdiploidía fueron significativamente más altos (PB / 0.001) en todos los casos de las células expuestas al asbesto (tanto de los no fumadores como de los fumadores) en comparación con las células no expuestas.

● El máximo de estos efectos se observó en caso de fumadores con sangre expuesta a 50 mg / ml de crocidolita. Después del tratamiento de las células (en ambos, fumadores y no fumadores) con fibras de amianto, las más comunes el daño fue la rotura cromosómica entre las regiones satelitales alfa y clásica.

Discusión… Recapitulando

-Ambas fibras de asbestos indujeron la formación de micronúcleos de manera dosis dependiente.

-Hubo una mayor proporción de linfocitos micronucleados en la sangre de fumadores, lo cual pone en evidencia el daño que causa el humo del cigarro.

-El ensayo in vitro realizado, sugiere que hay un efecto aditivo tras la exposición de la sangre de fumadores a asbestos.

Discusión ¿Hay un incremento en el daño genético por la interacción entre asbestos y humo de cigarro?

La exposición de asbestos causa principalmente daño en la región céntrica del cromosoma 1. Según los resultados del ensayo FISH.

La exposición al humo de cigarro afecta a más de un cromosoma y hace al sistema genético de las células más vulnerable.

Propuestas de otros estudios

Ambos:

● Daño al DNA y de células epiteliales alveolares.● Producción de especies reactivas--->Daño al

DNA

Asbestos:

● Deleciones que llevan a la activación de proto-oncogenes e inactivación de genes supresores de tumores.

● Catalizan la generación de metabolitos activos del benzopireno (humo).

● Afecta a la enzima que metaboliza a los HAPs y otros xenobióticos.

● Condensación de HAPs favoreciendo su entrada al organismo, donde pueden formar aductos con el DNA.

Cigarro:

● El alquitrán acumula hierro de los asbestos y de las células, el cual posteriormente se libera y promueve la formación de radicales hidroxilo.

● La exposición crónica al humo de cigarro hace que el sistema genético celular sea más vulnerable a ser perjudicado por efectos de la exposición a asbestos.

Conclusiones

Este estudio aporta evidencia de daño genético mayor por la interacción entre la exposición a humo de cigarro y a asbestos.Hay otros estudios que sugieren lo mismo.

Los resultados de este tipo de experimentos, pueden usarse para determinar las consecuencias por la exposición combinada a xenobióticos.