TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Klinik und Poliklinik für Unfallchirurgie Experimentelle Unfallchirurgie Klinikum rechts der Isar Optimierung der osteogenen Differenzierung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe Isabel F. Kerler Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Medizin genehmigten Dissertation. Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. E. J. Rummeny Prüfer der Dissertation: 1. apl. Prof. Dr. A. K. Nüssler Eberhard-Karls-Universität Tübingen 2. Univ.-Prof. Dr. P. Biberthaler Die Dissertation wurde am 06.06.2014 bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät für Medizin am 17.12.2014 angenommen.
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Optimierung der osteogenen Differenzierung mesenchymaler ... · TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Klinik und Poliklinik für Unfallchirurgie Experimentelle Unfallchirurgie Klinikum
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TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN
Klinik und Poliklinik für Unfallchirurgie
Experimentelle Unfallchirurgie
Klinikum rechts der Isar
Optimierung der osteogenen Differenzierung
mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe
Isabel F. Kerler
Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der Technischen
Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Medizin
genehmigten Dissertation.
Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. E. J. Rummeny
Prüfer der Dissertation:
1. apl. Prof. Dr. A. K. Nüssler
Eberhard-Karls-Universität Tübingen
2. Univ.-Prof. Dr. P. Biberthaler
Die Dissertation wurde am 06.06.2014 bei der Technischen Universität
München eingereicht und durch die Fakultät für Medizin am 17.12.2014
Das menschliche Skelett besteht durchschnittlich aus 208 Knochen. Es bildet zusammen mit
knorpeligen Skelettelementen den passiven Stütz- und Bewegungsapparat des Körpers und
erfüllt eine Schutzfunktion für die inneren Organe. Daneben stellen die Knochen den
Bildungsort der Blutzellen dar, beteiligen sich an verschiedenen Stoffwechselprozessen und
sind das größte körpereigene Phosphat- und Calciumreservoir (Felsenberg 2001, S. 488;
Lüllmann-Rauch 2003, S. 133).
Zur exemplarischen Darstellung des Knochenaufbaus wird ein langer Röhrenknochen, wie
das Femur, näher betrachtet. An einem Röhrenknochen kann anatomisch ein Schaftbereich
(Diaphyse) von einer proximalen und distalen Epiphyse unterschieden werden. Die beiden
knorpeligen Epiphysenfugen grenzen während der Wachstumsphase den Schaft von den
Epiphysen ab, verknöchern jedoch im Erwachsenenalter. Weitere makroskopisch erkennbare
Merkmale sind die äußere, homogen erscheinende Rindenschicht (Substantia compacta) und
die nach innen anschließende Substantia spongiosa. Die Spongiosa ist ein Gitterwerk aus
dünnen, traktoriell ausgerichteten Platten und Bälkchen (Trabekel) dessen Zwischenräume
von Knochenmark und Fett ausgefüllt werden. (Lüllmann-Rauch 2003, S. 122-130; Aumüller
2010, S. 184-186)
Der Knochen besteht mikroskopisch betrachtet aus Knochenzellen und extrazellulärer
Matrix, davon entfallen 70 % auf einen anorganischen und 30 % auf einen organischen
Anteil. Der anorganische Teil besteht vor allem aus Hydroxylapatit-Kristallen sowie Chloride
und Fluoride. Die organische Knochensubstanz wird zu 95 % aus Typ-I-Kollagenfibrillen
(bestehend aus drei Ketten, die sich zu einer Tripelhelix vereinen) und zu 5 % aus
nichtkollagenen Proteinen (siehe unten) gebildet (Felsenberg 2001, S. 488). Dieser Verbund
aus druckfesten Mineralkristallen und zugfesten Kollagenfibrillen verleiht dem Knochen
seine biegefeste Eigenschaft. Die wichtigsten nichtkollagenen Proteine des Knochens sind:
- Osteoprotegerin (OPG) wird von Osteoblasten sezerniert, um den Knochen vor
Abbau zu schützen. OPG ist der Schlüsselfaktor für die Inhibition der
Osteoklastendifferenzierung, -fusion und -aktivität. Es bindet sRANKL und
antagonisiert dieses dadurch (Haima 2013, S. 4). Glukokortikoide wirken umgekehrt:
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sie hemmen die Bildung von OPG und stimulieren diejenige von RANKL, dadurch
fördern sie den Knochenabbau (Brabnikova Maresova, Pavelka et al. 2012, S. 354;
Clarke 2012, S. 167).
- sRANKL wird von Osteoblasten sezerniert und ist der lösliche Rezeptor-Aktivator des
nuclear factor (NF)-κB Liganden. Es stimuliert die Bildung reifer Osteoklasten und
fördert somit den Knochenabbau. Die Zellaktivierung wird durch die Bindung von
sRANKL an den osteoklastischen Membranrezeptor RANK (NF-κB) induziert (Haima
2013, S. 4).
- Knochenspezifische Alkalische Phosphatase (AP) ist außen an der Plasmamembran
von Osteoblasten lokalisiert. Dieses membrangebundene Enzym spielt bei der
Mineralisation der extrazellulären Knochenmatrix eine wichtige Rolle; der
Mechanismus ist jedoch noch nicht ausreichend geklärt. Außerdem kann AP als
biochemischer Knochenmarker in der Beurteilung des Knochenumsatzes und zum
Therapiemonitoring verwendet werden (hohe AP-Konzentrationen können ein
Hinweis auf vermehrte Knochenneubildung sein)(Haima 2013, S. 4).
- Bone Sialoprotein (BSP) ist ein wichtiges Strukturprotein der Knochenmatrix und
wird normalerweise nur in mineralisiertem Bindegewebe von Knochen und Zähnen
exprimiert (Fisher, Whitson et al. 1983, S. 12723). BSP 2 ist die im Menschen
vorkommende Variante und ist auch bekannt unter „cell-binding sialoprotein“ oder
„integrin-binding sialoprotein“. BSP 2 unterstützt die Bindung von Osteoblasten an
die EZM und stimuliert dadurch die Bildung von Hydroxylapatit-Kristallen (Mansson,
Carey et al. 1995, S. 1071; Haima 2013, S. 4).
- Osteocalcin wird von Osteoblasten in der Phase der Mineralisation sezerniert, ist
Vitamin K-abhängig und kann durch Vitamin D3 stimuliert werden. Es ist ein calcium-
bindendes Protein und zieht Osteoklasten an (Siddiqi, Burrin et al. 1997, S. 753;
Haima 2013, S. 4).
- Osteopontin ist ein Adhäsionsprotein, das Osteoklasten in der mineralisierten Matrix
verankert. Osteopontin ist wie auch Osteonectin nicht knochenspezifisch, sondern
findet sich noch in weiteren Geweben (Butler 1989, S. 123; Haima 2013, S. 4).
- Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden eine Ligandengruppe, die zur TGF-β-
Familie gehört (Wozney 1989, S. 267). Sie fungieren als Zytokine und besitzen die
Fähigkeit die Knochen- und Knorpelbildung zu induzieren und zu regulieren.
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Außerdem spielen sie eine wichtige Rolle in der Differenzierung von Nervengewebe
und in der Genese fast aller Organe, wie beispielsweise Lunge, Niere, Haut oder
Gonaden (Hogan 1996, S. 1580). Zum Beispiel tritt bei der genetisch vererbten
Fibrodysplasia ossificans progressiva eine erhöhte BMP 4 Expression in Lymphozyten
auf, die zur Verknöcherung von Muskelgewebe führt (Van den Wijngaard, Pijpers et
al. 1999, S. 1432).
- Proteoglykane sind sehr große Moleküle und bestehen zu 95 % aus Kohlenhydraten
und 5 % aus Protein. Aufgrund der starken negativen Ladung können Proteoglykane
besonders viel Wasser binden und erlangen dadurch raumfüllende Eigenschaften
(Pschyrembel 2004, S. 1492).
Die dreidimensionale Anordnung der EZM legt fest, ob es sich um einen Geflecht- oder
Lamellenknochen handelt.
Der Geflechtknochen, auch Faserknochen genannt, ist die unreife Vorstufe des
Lamellenknochens und ist vor allem während der Knochenentwicklung oder Frakturheilung
zu finden. Die Kollagenfibrillen sind in Bündeln miteinander verflochten, so dass man sich die
Knochenstruktur wie verknöchertes Bindegewebe vorstellen kann.
Im Verlauf des natürlichen Knochenumbaus wird der Geflechtknochen durch den
biomechanisch hochwertigeren Lamellenknochen ersetzt. Die lamellare Anordnung der
Matrixbestandteile sowie die enge räumliche Beziehung zwischen Gefäßen und
Knochenlamellen werden besonders in der Kompakta deutlich. Beide Strukturen zusammen
bilden eine Baueinheit, das sogenannte Osteon (Durchmesser 250-350 µm, Länge bis zu 1
cm). Im Zentrum eines Osteons befindet sich der sogenannte Havers’sche Kanal
(Durchmesser mind. 20 µm), in dem neben Vene und Nerv ein Gefäßast der Arteria nutricia
verläuft. Diese dringt von außen durch die Kortikalis in den Markraum ein und versorgt die
Gefäße des Knochenmarks. Die Havers-Gefäße sind durch Gefäße in den querverlaufenden
sogenannten Volkmann-Kanälen miteinander verbunden. Um das Havers-Gefäß sind 5-20
Speziallamellen konzentrisch angeordnet. Die Kollagenfibrillen laufen dabei spiralig um den
Havers’schen Kanal, während die Osteozyten zwischen den Lamellen eingemauert sind.
Weiter unterscheidet man äußere und innere Generallamellen, sie sind nicht um ein Gefäß
angeordnet und umgeben die Kompakta parallel zur äußeren und inneren Oberfläche.
Schaltlamellen (interstitielle Lamellen) sind Reste unvollständig abgebauter Spezial- oder
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Generallamellen und sind der Beweis für die stetigen Umbauvorgänge im Knochen.
(Benninghoff 1985, S. 135-137; Lüllmann-Rauch 2003, S. 129-131; Schünke 2005, S. 35).
In der gefäßlosen Spongiosa sind die flächigen Lamellen parallel zur Trabekeloberfläche
angeordnet. Ein Trabekel ist höchsten 300 µm dick, somit können die Osteozyten per
diffusionem von den Gefäßen aus dem Markraum versorgt werden (Lüllmann-Rauch 2003, S.
130).
Abbildung 1: Mikroskopischer Aufbau eines Röhrenknochens Die Abbildung zeigt die Baueinheit eines Röhrenknochens, das Osteon; die versorgenden Blutgefäße verlaufen in der Kompakta in den präformierten längsverlaufenden Havers’schen Kanälen und in quer angeordneten Volkmann-Kanälen; nach außen (links) schließt das Periost die Kompakta ab, nach innen (rechts) beginnt die Spongiosa. Modifizierte Abbildung nach www.servier.com/Powerpoint-image-bank.
Folgende drei Zelltypen werden unterschieden:
1. Osteoblasten entstehen über ihre Vorstufe, den Osteoprogenitorzellen, aus
mesenchymalen Stammzellen. Ihre Hauptaufgaben sind die Bildung, Organisation und
Mineralisierung der EZM sowie die Synthese von Kollagen und weiteren
Knochenproteinen. Diese Aufgaben erfüllen sie in mehreren Arbeitsschritten:
Zellproliferation: Bildung der EZM
Osteon
äußereGenerallamellen
Schaltlamellen
Volkmann-Kanal mit Gefäßen
Periost
Havers‘scher Kanal mit Gefäßen
Spongiosa
Kompakta
Osteozyt
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Reifung der EZM: Synthese von Proteinen (z.B. knochenspezifische Alkalische
Phosphatase)
Mineralisation der EZM: die AP-Expression wird herrunterreguliert, dafür
nimmt die Genexpression für Sialoprotein, Osteopontin und Osteocalcin zu
nach der Fertigstellung der Knochenmatrix gibt es drei Optionen für die
Osteoblasten: etliche werden von einer neu gebildeten Lamelle
„eingemauert“ und werden dadurch zu Osteozyten, über 50% sind überflüssig
und gehen durch Apoptose zugrunde und die restlichen wenigen reihen sich
in einem inaktiven Zustand in das Endost ein (Benninghoff 1985, S. 138-139;
Lüllmann-Rauch 2003, S. 126-127).
2. Osteozyten werden bis auf eine schmale Zone, die mit Kollagen und interstitieller
Flüssigkeit gefüllt ist, komplett von mineralisierter Matrix umgeben. Von jeder
einzelnen Zelle gehen viele Knochenkanälchen (Canaliculi) ab, die mit den
Nachbarzellen durch Gap junctions in Verbindung stehen. Dieses Hohlraumsystem
gewährleistet per diffusionem die Aufrechterhaltung des Zellmetabolismus und die
Kommunikation untereinander. Ihre Funktion ist noch nicht ausreichend geklärt, aber
es konnte beobachtet werden, dass Areale, in denen die Osteozyten abgestorben
sind, von Osteoklasten abgeräumt werden. (Benninghoff 1985, S. 139; Lüllmann-
Rauch 2003, S. 125-126; Schünke 2005, S. 15)
3. Osteoklasten sind eine Spezialform der Makrophagen. Sie entstehen durch Fusion von
bis zu 100 einkernigen Vorläuferzellen, die denen der Monozyten entsprechen und
sind für die Knochenresorption verantwortlich. Die Arbeitsweise der Osteoklasten
umfasst folgende Schritte:
Mineralienauflösung: Osteoklasten bilden in dem Bereich, welcher der
Knochenoberfläche aufliegt, einen Faltensaum zur Oberflächenvergrößerung.
In dieser geriffelten Oberfläche befindet sich eine H+-ATPase mit der ein
saures Mikromilieu (pH ca. 4,5) zur Auflösung der Calciumverbindungen
erzeugt wird. Die komplette Lysezone ist nach außen durch eine
Versiegelungszone abgegrenzt.
Gleichzeitig sezernieren die Osteoklasten lysosomale Enzyme (z.B. Cathepsin
K, Tartrat-resistentes Isoenzym der sauren Phosphatase = TRAP 5b) zur
Zerlegung der organischen Matrix.
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Osteoklasten nehmen die Matrix-Fragmente mittels Rezeptor-vermittelter
Endozytose auf, transportieren sie durch den Zellleib und schleusen sie auf
der gegenüberliegenden, nicht osteoklastisch tätigen Seite wieder aus.
Zur Proliferation von Osteoklastenvorläuferzellen sezernieren Osteoblasten
Wachstumsfaktoren (TGF-, RANKL) und Zytokine (z.B. M-CSF) (Fuller, Lean et al. 2000,
S. 2445). Zusätzlich interagieren die Blasten und Klasten über RANK direkt miteinander,
was die Fusion und Reifung der Osteoklasten anregt. Osteoprotegerin aus den
Osteoblasten unterbindet diese Interaktion. Nach Calcitoninbindung löst sich der
Osteoklast von der Knochenmatrix und der Faltensaum verschwindet. (Benninghoff
1985, S. 140-141; Lüllmann-Rauch 2003, S. 127-129; Pschyrembel 2004, S. 1331)
Das Endost überzieht die innere Knochenoberfläche. Es besteht aus einer dünnen Schicht
von nicht-mineralisierten Kollagenfibrillen und einer Schicht lining cells. Diese umfassen
mesenchymale Stammzellen, Osteoprogenitorzellen, ruhende Osteoklasten und –blasten
werden bei Umbau- oder Reparaturmaßnahmen aktiviert (Lüllmann-Rauch 2003, S. 129).
Das Periost überzieht die äußere Knochenoberfläche, ist gut vaskularisiert und innerviert. Es
weist die gleichen Zellen wie das Endost auf.
Jährlich werden etwa 10% der gesamten Knochenmasse umgebaut (remodelling), um das
Skelett vor Materialermüdung zu schützen, Mikroschäden zu reparieren und es an die
funktionelle Beanspruchung anzupassen.
Neben den mechanischen Aspekten haben auch Hormone einen großen Einfluss auf den
Knochenstoffwechsel (Lüllmann-Rauch 2003, S. 129):
Östrogen hemmt die Osteoblasten-induzierte Rekrutierung der Osteoklasten, somit
ist der Östrogenmangel bei postmenopausalen Frauen eine der maßgeblichen
Ursachen für Osteoporose (Lüllmann-Rauch 2003, S. 133).
Parathormon aus der Nebenschilddrüse erhöht Osteoblasten-vermittelt die
Rekrutierung und Aktivität der Osteoklasten, die durch eine gesteigerte
Knochenresorption den Serumcalciumspiegel erhöhen (Lüllmann-Rauch 2003, S. 133;
Haima 2013, S. 6).
Calcitonin, das in den C-Zellen der Schilddrüse gebildet wird, ist der Gegenspieler des
Parathormons. Durch direkte Osteoklastenhemmung bewirkt es eine schnelle jedoch
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nur kurz dauernde Senkung der Calcium- und Phosphatkonzentrationen im Serum
(Benninghoff 1985, S. 147; Lüllmann-Rauch 2003, S. 133; Haima 2013, S. 6).
Vitamin D3 (siehe Kapitel 2.3.2)
2.2 Tissue Engineering: Klinischer Hintergrund und osteogene
Differenzierung von Ad-MSCs
Adäquate Therapiemöglichkeiten für Patienten mit größeren Knochendefekten, z.B. bedingt
durch ein Trauma oder nach Tumorextraktion, die nicht durch körpereigene
Reparaturmaßnahmen geheilt werden können, stellen ein großes Problem in der
orthopädischen und unfallchirurgischen Versorgung dar. Der derzeitige klinische Standard ist
die auto- und allogene Knochentransplantation (Kao and Scott 2007, S. 513). Für den
Patienten ist die autogene Behandlungsmethode jedoch mit einem erhöhten Risiko für
Infektion und Morbidität durch den zusätzlichen operativen Eingriff verbunden (Brawley and
Simpson 2006, S. 342; Chen, Chen et al. 2006, S. 496; Silva, Cortez et al. 2006, S. 420; Chou,
Mann et al. 2007, S. 199). Der Einsatz allogener Transplantate bringt die Gefahr einer Graft-
versus-Host Reaktion mit sich (Wheeler, Haynie et al. 2001, S. 251; Wheeler 2005, S. 36;
Kode, Mukherjee et al. 2009, S. 377). Alternativ werden auch alloplastische Ersatzverfahren
angewendet, die jedoch lediglich als Defektfüller dienen und bei einem ausbleibenden
osteoinduktiven Einbauprozess sich lockern können. Im Tiermodel konnten große
Knochendefekte durch Beschichtung der Implantate mit osteogenen Wachstumsfaktoren
erfolgreich überbrückt werden (Pelled, Ben-Arav et al. 2010, S. 13-14; Vertenten, Gasthuys
et al. 2010, S. 153-157). Übertragungsversuche in den klinischen Alltag sind bis jetzt
allerdings gescheitert.
Das Tissue Engineering eröffnet für diese Patientengruppe eine neue, risikoarme und
vielversprechende Behandlungsmöglichkeit. Ziel ist nicht nur die Wiederherstellung der
Funktionalität der betroffenen Extremität sondern eine vollständige Genesung durch den
Einsatz körpereigener histogener Zellen auf biokompatiblen Trägermaterialien (Egana, Fierro
et al. 2009, S. 1191; Schmidt-Rohlfing, Tzioupis et al. 2009, S. 786). Anfänglich kamen vor
allem autogene primäre Osteoblasten zum Einsatz, die jedoch nicht in ausreichender Menge
gewonnen werden konnten. Somit hat sich in den letzten Jahren die Verwendung
mesenchymaler Stammzellen etabliert. Studien belegen das ubiquitäre Vorkommen
mesenchymaler (adulter) Stammzellen in verschiedenen Geweben und Organen wie
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Knochenmark, Muskel, Gehirn, Haut und subkutanem Fettgewebe (Kakudo, Shimotsuma et
al. 2008, S. 191). Per definitionem charakterisiert man Stammzellen durch ihre Fähigkeit zur
Selbstreplikation und somit spielen sie eine Schlüsselrolle in der Aufrechterhaltung der
Homöostase im Knochen-, Knorpel-, Muskel-, Band-, Fett- und Stromagewebe (Bruder, Fink
et al. 1994, S. 283). Ein weiteres Merkmal mesenchymaler Stammzellen ist deren Plastizität,
d.h. sie sind in der Lage in verschiedene Gewebetypen zu differenzieren (Pittenger, Mackay
et al. 1999, S. 143; Mizuno 2009, S. 56).
Bezüglich der osteogenen Differenzierungslinie können sich mesenchymale Stammzellen in
sogenannte Osteoprogenitorzellen, Vorläuferzellen einiger Knochenzellen, weiter
differenzieren. Osteoprogenitorzellen stellen die Ausgangsform für die
Weiterdifferenzierung in Osteoblasten, Osteozyten und „lining cells“ dar (Clarke 2008, S.
134).
Abbildung 2: Die mesenchymale Stammzelle (modifiziert nach Takada, Kouzmenko et al. 2009, S. 444) Die mesenchymale Stammzelle kann durch ihre Plastizität in unterschiedlich spezialisierte Gewebe differenzieren.
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Gimble et al. haben vorgeschlagen, dass Stammzellen für den Einsatz in der regenerativen
Medizin folgende Kriterien erfüllen sollten (Gimble 2003, S. 1249-1250; Gimble, Katz et al.
2007, S. 1249-1250):
zur Reduktion des perioperativen Risikos für den Spender müssen die Stammzellen
durch minimal invasive Extraktionsmethoden gewonnen werden können
aus dem zur Verfügung stehende Gewebe sollen mit standardisierten Methoden eine
große Zahl von Zellen (im Millionenbereich) isoliert werden können
eine Differenzierung in verschiedene Gewebe soll durch regulierbare und
reproduzierbare Methoden gewährleistet werden
Gewährleistung sicherer und effektiver auto- und allogener Transplantations-
möglichkeiten
die Zellen müssen gemäß aktueller GMP-Richtlinien (Good Manufacturing Practice
guidelines; EU-Richtlinie 2003/94/EC) verarbeitet werden können
Traditionell werden MSCs aus dem Aspirat einer Knochenmarkbiopsie gewonnen. Diese ist
jedoch sehr schmerzhaft, geht mit einem nicht zu unterschätzenden periinterventionellen
Risiko für den Patienten einher und liefert nur eine geringe Menge an Material, wenn
Folgeerscheinungen wie Anämien vermieden werden sollen (Bain 2003, S. 949).
Subkutanes Fettgewebe hingegen kann leicht in Lokalanästhesie in ausreichenden Mengen
entnommen werden. Es ist möglich aus einem Gramm Fettgewebe ca. 5 x 103 Zellen zu
isolieren, etwa 500 mal so viel wie aus Knochenmark (Coleman 2006, S. 117). Zudem
verringert der Gebrauch von adulten Stammzellen Akzeptanzprobleme der Methoden bei
den Patienten oder Konflikte mit den aktuell geltenden Gesetzen in Deutschland.
Allen geforderten Punkten kann mit Fettgewebsstammzellen nachgekommen werden und
somit stellen sie eine gute Alternative zu den Knochenmarkstammzellen dar. Zur
Überprüfung ob Ad-MSCs auch für das Tissue Engineering von Knochen verwendbar sind,
werden sie auf ihre Oberflächenrezeptoreigenschaften untersucht und mit verschiedenen
Substanzen stimuliert, um die osteogene Differenzierung zu induzieren.
Für diese Arbeit wird abdominelles bzw. Hüftfett verwendet, das nach vorheriger Aufklärung
und schriftlicher Zustimmung der Patienten während der Operation entnommen wird.
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2.3 Supplemente zur osteogenen Differenzierung
Damit den Zellen auch die benötigten Nähr- und Signalstoffe zur osteogenen Differenzierung
zur Verfügung stehen, werden verschiedene Supplemente für die nachfolgenden
Experimente verwendet. Dies erfolgt einerseits in Anlehnung an bereits publizierte
Protokolle zur osteogenen Differenzierung und andererseits durch den Einsatz von
Substraten, die Osteoblastenkulturmedien zugesetzt werden (Hattori, Sato et al. 2004, S. 4;
Kroeze, Knippenberg et al. 2011, S. 233).
2.3.1 Phosphat- und Calciumlieferanten
Hydroxylapatit-Kristalle bilden die Hauptkomponente des mineralisierten Matrixanteils und
bestehen aus Calcium und Phosphat.
Als Phosphatlieferanten werden -Glycerolphosphat (siehe Abbildung 3) und
L-Ascorbinsäure-2-phosphat (siehe Abbildung 4) eingesetzt, wobei letzteres die Zugabe von
HEPES (siehe Abbildung 5) erfordert, um einer pH-Wert-Entgleisung entgegenzuwirken.
Das zweiwertige Calcium wird als Calciumchloridsalz (siehe Abbildung 6) zugegeben.
Diese beiden Vertreter aus der Familie der BMPs werden seit einigen Jahren in Form von
rekombinanten humanen Proteinen klinisch zur Anwendung gebracht. Zum Einsatz kommt
dabei das rekombinante humane BMP-2 (rh-BMP-2) InductOs® der Firma Wyeth und das rh-
BMP-7 Osigraft® der Firma Olympus vormals Stryker. Ersteres ist zugelassen bei akuten
Tibiafrakturen sowie zur monosegmentalen anterioren lumbalen Spondylodese bei
Erwachsenen mit degenerativem Bandscheibenvorfall und einem erfolglosen 6 monatigen
konservativen Therapieversuch. Letzteres wird bei seit mindestens 9 Monaten bestehenden
Pseudarthrosen nach Tibiafrakturen eingesetzt.
Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind eine Ligandengruppe, die zur TGF-β-Familie
gehört (Wozney 1989, S. 267). Im klinischen Alltag finden BMP 2 und BMP 7 Einsatz bei der
Behandlung von großen Knochendefekten oder Frakturheilungsstörungen (Wildemann,
Burkhardt et al. 2007, S. 1; Schmidmaier, Capanna et al. 2009, S. 41).
BMP 2 ist ein potentes osteoinduktives Zytokin, das die Bildung von Knochen und Knorpel in
Verbindung mit osteokonduktiven Trägern wie Kollagen und synthetischem Hydroxylapatit
induziert. Zusätzlich zur osteogenen Aktivität spielt BMP 2 eine wichtige Rolle bei der
kardialen Morphogenese (Hill 2013, S. 41).
BMP 7 auch bekannt als Osteogenic Protein-1 oder OP-1 ist eine wirksame osteogene
Substanz, die in Anwesenheit geeigneter Trägerstoffe (z.B. eines Kollagenschwammes oder
synthetischem Hydroxylapatit) zur Behandlung von Knochendefekten eingesetzt wird. BMP 7
induziert die Knorpel- und Knochenbildung, ist an der Regulation des Calciumhaushaltes
sowie der Knochenhomöostase beteiligt (Hill 2013, S. 41).
Für die Signaltransduktion der Mitglieder der TGF-β Superfamilie werden jeweils ein TGF-β
Rezeptor Typ I (Alk 1-7) und Typ II Rezeptor (TGF-β, ActR-II, ActR-IIB, BMPRII und AMHR-II)
(Massague 1998, S. 753; Inman, Nicolas et al. 2002, S. 65-66) benötigt (siehe Abbildung 9).
Die BMPs vermitteln ihre Signale lediglich über Alk 1, Alk 2, Alk 3 und Alk 6 der Typ I
Rezeptoren sowie BMPR-II, ActR-II und ActR-IIB der Typ II Rezeptoren. Nach Bindung des
BMP-Liganden an einen der Typ I Rezeptoren verbindet sich dieser Komplex intrazellulär mit
dem entsprechenden Typ II Rezeptor. Der konstitutiv aktivierte (phosphorylierte) Typ II
Rezeptor aktiviert nun den Typ I Rezeptor durch die Übertragung des Phosphatrests (Piek,
Heldin et al. 1999, S. 2109; Chen, Deng et al. 2012, S. 273-274). Der aktivierte Typ I Rezeptor
erkennt die fünf zytoplasmatisch rezeptorregulierten Smad-Proteine (R-Smads 1, 2, 3, 5, 8).
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Die Bindung eines BMP-Liganden aktiviert R-Smad 1, 5 und 8 (Piek, Heldin et al. 1999, S.
2109) wohingegen TGF-β, Nodal oder Activin über R-Smad 2 und 3 die Signaltransduktion
vermitteln (Ross and Hill 2008, S. 384-385). Smad 4 wird nicht von Liganden kontrolliert und
kann mit allen aktivierten R-Smads Komplexe bilden. Somit unterstützt es als common-
mediator Smad-Protein (co-Smad, Smad 4) bei der Signaltransduktion in den Zellkern. (Ross
and Hill 2008, S. 385-386)
Die I-Smads (Inhibitory Smads) bestehend aus Smad 6 und 7 wirken auf die
Signalübertragung inhibierend. Diese binden zum einen an den Typ-I-Rezeptor und hindern
somit die Aktivierung der R-Smads oder erkennen zum anderen direkt aktivierte R-Smads
und beeinflussen dadurch die Komplexbindung mit co-Smad. Smad 6 inhibiert die BMP-
Signaltransduktion wohingegen Smad 7 zusätzlich den TGF-β- und Activin-Signalweg hemmt.
(Ross and Hill 2008, S. 386, 393)
Abbildung 9: Schematische Darstellung des BMP- und TGF-β Signallings Die Ligandenbindung aktiviert im Zellinneren die R-Smad Phosphorylierung, dabei übermitteln die BMPs ihre Aktivierung über Smad 1/5/8 und TGF-β über Smad 2/3, zusammen mit dem co-Smad wird die Information in den Zellkern weitergeleitet. I-Smad 6 wirkt inhibitorisch auf das Smad 1/5/8 Signalling wohingegen Smad 7 beide Signalwege beeinflussen kann. (modifiziert nach Horbelt, Denkis et al. 2012, S. 470)
TGF-βRII:- BMPRII- ActR-II- ActR-IIB
BMP
Smad 4
TGF-βRI:- Alk 1- Alk 2- Alk 3- Alk 6
TGF-βRI TGF-βRII
TGF-β
Smad 1/5/8 Smad 1/5/8 Smad 2/3Smad 2/3P P
Smad 4
R-SmadP
Smad 4
Smad 6
Smad 7
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Die Arbeitsgruppe um Kang schleuste in C2C12-Zellen einen rekombinanten Adenovirus, der
alle 14 BMPs exprimiert. Anschließend injizierten sie diese in den Quadrizeps von
Nacktmäusen. In den Gruppen von BMP 2, 6, 7 und 9 (siehe Abbildung 10) konnten sie
sowohl radiologisch als auch histologisch die Ossifikation des Muskels an dieser Stelle
nachweisen (Kang, Sun et al. 2004, S. 1314).
Abbildung 10: orthotope Ossifikation bei BMP 2, 6, 7 und 9 C2C12 Zellen mit rekombinantem Adenovirus, der alle 14 BMPs exprimiert, wurden in den Quadrizeps der Nacktmäuse injiziert. Nach 3 Wochen konnte röntgenologisch bei den mit BMP 2, 6, 7 und 9 stimulierten Gruppen Knochengewebe nachgewiesen werden (Kang, Sun et al. 2004, S. 1314). Kontrollgruppe: GFP = Grün Fluoreszierendes Protein, das Dreieck zeigt die Injektionsstelle
Lange Zeit waren nur BMP 2 und BMP 7 rekombinant herstellbar und für die klinische
Anwendung zugelassen, deshalb beschränken wir uns auf diese beiden Faktoren.
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3 Zielsetzung
Knochenmarkstammzellen waren lange die vielversprechendste Quelle von mesenchymalen
Stammzellen. Sie sind jedoch nur in geringen Mengen verfügbar, wenn das hämatopoetische
Gleichgewicht nicht zerstört werden soll. Zusätzlich ist deren Extraktion mit einem nicht zu
Zur Vermeidung von Kontaminationen aber auch zum Eigenschutz werden die Zellen
ausschließlich unter sterilen Bedingungen isoliert und kultiviert. Dafür werden alle Versuche
in einer sterilen Werkbank durchgeführt. Ein vertikaler, laminarer Luftstrom mit eingebauten
HEPA (high efficiency particulate air) Filter und UV-Lampe, die am Ende eines jeden
Arbeitstages für 30 min eingeschaltet wird, ermöglichen nahezu keimfreies Arbeiten.
Zusätzlich ist gründliches Händewaschen vor Arbeitsbeginn, das Tragen von Handschuhen
und die Händedesinfektion mit Ethanol 70 % essentiell. Zu Beginn der Tätigkeit werden die
Flächen der Werkbank sowie alle verwendeten Materialien mit Ethanol 70 % abgesprüht.
Nicht sterile Lösungen, die mit den Zellen in Kontakt kommen, werden entweder steril
filtriert oder bei 120 °C für 20 min autoklaviert. (Schantz and Ng 2004, S. 4-7)
4.4 Zellisolation
4.4.1 Isolation und Kultivierung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe
Benötigte Materialien:
DMEM High Glucose (4,5 g/L) PAA, Pasching, Austria (E15-883) mit 2 mM stabilem Glutamin
FCS Gold EU approved (FCS) PAA (A15-151) (für alle nachfolgenden Versuche gilt: FCS muss vor der Verwendung für 30 min auf 56 °C erhitzt werden, um das Komplement zu inaktivieren)
Penicillin/Streptomycin PAA (P11-010) Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA (H15-002) Kollagenase Typ: CLS II 330 U/mg Biochrom AG, Berlin (CII-22)
Durchführung der Methode:
Herstellung des Ad-MSC Kulturmediums mindestens 24 h vor Beginn der Isolation, um eine
mögliche Kontamination ausschließen zu können:
Endkonzentration
500 ml DMEM 50 ml FCS 10 % 5 ml Penicillin/Streptomycin 100 U/L
Materialien und Methoden
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Das Fettgewebe wird gewogen und in einer Zellkulturschale mit steriler Pinzette und Skalpell
zerkleinert. Anschließend gibt man das Fett in ein 50 ml Reaktionsgefäß, füllt mit D-PBS auf,
vermischt beides gut durch vorsichtiges Schütteln und zentrifugiert alles für 10 min bei
430 x g, 22 °C, ohne Beschleunigung oder Bremse. Das Fettgewebe schwimmt nach der
Zentrifugation oben und die auszuwaschenden Blutbestandteile haben sich als Pellet am
Boden gesammelt. Nun wird D-PBS und Pellet mit einer autoklavierten Glaspipetten
abgesaugt und der Waschschritt zwei- bis dreimal wiederholt, um eine Verunreinigung der
Kultur durch andere Zellarten zu minimieren.
Zwischenzeitlich kann die Kollagenase-Lösung hergestellt werden, man benötigt 1 ml Lösung
pro 1 g Fett:
Endkonzentration
0,6 mg Kollagenase CLS II 0,06 % 1 ml D-PBS
miteinander vermischen und die Lösung durch einen Sterilfilter zum Fettgewebe geben. Um
optimale Voraussetzungen für die Kollagenase zu schaffen inkubiert man das Gefäß im
Wasserbad (37 °C) für 30-60 min unter wiederholtem Schütteln bis eine Fettemulsion
entstanden ist. Zum Stoppen der Enzymwirkung in diesem Ansatz gibt man nun 10 ml
Kulturmedium zu, mischt es durch vorsichtiges Schwenken unter und zentrifugiert alles für
10 min bei 600 x g, 22 °C mit einer mittleren Beschleunigungs- und Bremsstärke. Das oben
aufschwimmende Fett kann mit der Pinzette abgenommen und der flüssige Überstand
abgesaugt werden. Das Pellet wird mit 12 ml warmem D-PBS resuspendiert und, um
verbleibendes Bindegewebe zu entfernen, durch einen Zellfilter mit einer Porengröße von
200 µm in ein neues 50 ml Gefäß gefiltert. Nach Zugabe von 15 ml Kulturmedium kann die
Zellsuspension in eine Kulturflasche mit 175 cm2 gegeben werden. Inkubation der Zellen bei
37 °C und 5 % CO2 mit anschließendem Mediumwechsel nach 12-24 h, um nicht adhärente
Zellen (z.B. Erythrozyten) zu entfernen, danach im Intervall von 5 Tagen wechseln. Sind am
Folgetag im Lichtmikroskop viele frei schwimmende Zellen zu erkennen ist ein Waschschritt
mit D-PBS vor der erneuten Mediumzugabe empfehlenswert.
Materialien und Methoden
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4.4.2 Isolation und Kultivierung von Osteoblasten aus Knochen
Salzhydrat (MW: 289,54 g/mol) Sigma, München (A8960) ß-Glycerolphosphatdinatrium Salzhydrat
(MW: 216,04 g/mol) Sigma (G9891) Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA (H15-002) Kollagenase Typ: CLS II 330 U/mg Biochrom AG, Berlin (CII-22)
Durchführung der Methode:
Herstellung des MEM-EARLE/HAM’s F12 Kulturmediums vor Beginn der Isolation:
1. L-Ascorbinsäure-2-phosphat Stocklösung
Endkonzentration
128 mg L-Ascorbinsäure-2-phosphat (MW: 289,54 g/mol) 0,05 mM 10 ml D-PBS sterile Filtration
20 Aliquots á 0,5 ml abfüllen und bei -20 °C aufbewahren
2. β-Glycerolphosphat Stocklösung
Endkonzentration
108 mg ß-Glycerolphosphat (MW: 216,04 g/mol) 0,05 mM 10 ml D-PBS sterile Filtration
20 Aliquots á 0,5 ml abfüllen und bei -20 °C aufbewahren
3. MEME/HAM’s F12 Kulturmedium
Endkonzentration
500 ml einer 1:1 Mischung aus MEME und HAM’s F12 50 ml FCS 10 % 5 ml Penicillin/Streptomycin 100 U/L 0,5 ml L-Ascorbinsäure-2-phosphat Stocklösung 0,005 mM 0,5 ml ß-Glycerolphosphat Stocklösung 0,005 mM
Materialien und Methoden
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Das Knochenfragment (in dieser Arbeit werden ausschließlich Femurköpfe verwendet) gibt
man in eine Zellkulturschale. In ein 50 ml Reaktionsgefäße (A) werden 40 ml D-PBS
vorgelegt. Da man zum Bearbeiten des Knochens diesen in die Hand nehmen muss, ist die
Verwendung von sterilen Handschuhen erforderlich. Nun mit einer Knochenzange nach Luer
kleine Fragmente aus dem Spongiosa- und Markbereich gewinnen und sofort in das
vorbereitete Gefäß (A) geben (der restliche Knochen muss als Sondermüll entsorgt werden).
Zum Waschen der Knochenstücke füllt man das Gefäß (A) bis 50 ml mit D-PBS auf,
verschließt und schwenkt es vorsichtig und saugt mit einer sterilen Glaspipette
Fetttröpfchen und D-PBS ab. Diesen Waschvorgang wiederholt man solange bis der Knochen
weitestgehend fett- und blutfrei ist. Als nächstes bereitet man die Kollagenase-Lösung zu,
man benötigt 1 ml Lösung pro 1 ml Knochen:
Endkonzentration
0,7 mg Kollagenase CLS II 0,07 % 1 ml D-PBS
miteinander vermischen und steril filtriert in Gefäß (A) geben. Anschließende Inkubation im
Wasserbad bei 37 °C für eine Stunde unter mehrmaligem Schwenken.
Den Überstand aus Gefäß (A) abnehmen und in ein neues Gefäß (B) geben, die
Knochenfragmente in (A) werden dann noch weitere zweimal mit D-PBS gewaschen und die
Waschlösung wieder in (B) überführt. Gefäß (B) zentrifugiert man für 10 min bei 600 x g,
20 °C ohne Beschleunigung oder Bremse, saugt den Überstand ab und resuspendiert das
Pellet in 25 ml MEME/HAM’s F12 Medium. Abschließend gibt man die Zellsuspension in eine
Kulturflasche mit 175 cm2, diese aus dem Kollagenaseüberstand stammenden Osteoblasten
tragen die Bezeichnung OSÜ. Die Knochenfragmente aus Gefäß (A) füllt man ebenso in ein
Zellkulturflasche (175 cm2) und gibt 25 ml Medium hinzu, die Zellen, die aus der Spongiosa
heraus wachsen werden als Osteoblasten aus der Spongiosa (OSS) bezeichnet. Beide
Flaschen werden nun bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Mediumwechsel am nächsten Tag und
dann alle 5 Tage.
Materialien und Methoden
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4.5 Zellzahlbestimmung
4.5.1 Sulforhodamin B (SRB) Färbung
SRB bindet unter sauren Bedingungen an Oberflächenproteine und findet Verwendung bei
der Erstellung von Wachstumskurven, Toxizitätstests und der Normalisierung von
Enzymaktivitäten ohne die Zellen dabei zu lysieren.
Benötigte Materialien:
Ethanol 99,8 % Apotheke, MRI Essigsäure 99,8 % Sigma, München (695084) Sulforhodamin B Natriumsalz Sigma (S9012) TRIS (hydroxymethyl)-aminomethan Sigma (T87602)
Durchführung der Methode:
Herstellung der benötigten Lösungen:
1. 1 % Essigsäurelösung
Endkonzentration
10 ml Essigsäure 1 % 990 ml ddH2O
2. Sulforhodamin B (SRB-) Lösung
Endkonzentration
1 g Sulforhodamin B (MW: 580,65 g/mol) 0,4 % 250 ml 1 % Essigsäurelösung Lösung ist wiederverwendbar in brauner Flasche lagern
3. 10 mM ungepufferte TRIS-Lösung (pH = 10 – 10,5)
Endkonzentration
1,2 g TRIS-aminomethan (MW: 121,14 g/mol) 10 mM 1 L dH2O
Zu Beginn saugt man das Medium von den Zellen ab und fixiert diese für 1 h bei -20 °C mit
Ethanol. Das Ethanol wird wieder abgesaugt und die Zellen mit SRB-Lösung bedeckt:
50 µl pro Well einer 96-Well-Platte 300 µl pro Well einer 48-Well-Platte 600 µl pro Well einer 24-Well-Platte
Materialien und Methoden
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Zur Inkubation der Färbelösung die Platte lichtdicht abdecken und für 30 min auf den
Schwenkinkubator stellen. Anschließend wird die wiederverwendbare SRB-Lösung zurück in
die Flasche gegeben und der überschüssige, nicht gebundene Farbstoff viermal mit
1 % Essigsäurelösung abgewaschen. Im Lichtmikroskop ist nun eine pinke Färbung der Zellen
zu erkennen (siehe Abbildung 11).
Abbildung 11: Zellen nach SRB-Färbung Lichtmikroskopische Aufnahme von Zellen nach Färbung mit SRB-Lösung (Vergrößerung: 10 X).
Zur Quantifizierung das SRB vollständig auf dem Schwenkinkubator mit 10 mM
ungepufferter TRIS-Lösung lösen
100 µl pro Well einer 96-Well-Platte 200 µl pro Well einer 48-Well-Platte 400 µl pro Well einer 24-Well-Platte
und die optische Dichte (OD) bei = 565 nm (OD des SRB) (siehe Abbildung 12) und
= 690 nm (Störeinflüsse, z.B. durch eventuelle Beschädigungen an der verwendeten Platte)
messen. Zur Berichtigung der Messwerte bildet man die Differenz aus beidem:
OD565 nm – OD690 nm. Das Ergebnis stellt eine relative Bestimmung der Oberflächenproteine
der fixierten Zellen dar und dient somit als relative Zellzahlbestimmung (Skehan, Storeng et
al. 1990, S. 1107).
Materialien und Methoden
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Abbildung 12: Spektraluntersuchung der SRB-Lösung Die Abbildung zeigt das Absorptionsmaximum der SRB-Lösung bei 565 nm.
Tabelle 3: Arbeitsschritte der SRB-Färbung Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der SRB-Färbung.
4.5.2 Zellzahlbestimmung (Neubauer Zählkammer) und Aussäen einer bestimmten
Zellzahl pro cm2
Benötigte Materialien:
Neubauer Zählkammer Laboroptik GmbH, Bad Homburg Trypan blau 0,5 % Biochrom AG, Berlin (L6323) Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA, Pasching, Austria (H15-002) Ethanol 70 % Apotheke MRI
Wellenlänge [nm]
Ab
sorp
tio
n
Materialien und Methoden
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Durchführung der Methode:
Zum Aussäen einer bestimmten Anzahl von Zellen pro Flächeneinheit, muss erst die
Gesamtzellzahl der Zelllösung nach dem Resuspendieren des Pellets ermittelt werden. Dazu
entnimmt man der Zellsuspension 30 µl und vermischt diese gut mit 30 µl Trypan blau
Stocklösung:
Endkonzentration
1 ml Trypan blau 0,5 % 0,125 % 3 ml D-PBS
Abbildung 13: Schematische Darstellung einer Neubauer Zählkammer Die schematische Darstellung zeigt die Interferenzlinien, die zwischen Zählkammer und Deckglas entstehen, wenn man dies nach Befeuchten mit der Atemluft mit sanftem Druck von vorne aufschiebt (modifiziert anhand der Herstellerangaben). Vergrößerte Darstellung der Zählnetze siehe nächste Abbildung.
Die speziell für Zellzählungen entwickelte Neubauer Zählkammer (siehe Abbildung 13) wird
wie folgt vorbereitet: zuerst Zählkammer und Deckglas mit Ethanol säubern. Anschließend
beides mit Atemluft befeuchten und das Deckglas mit sanftem Druck von vorne auf die
Zählkammer schieben (Vorsicht: Bruchgefahr des Deckglases). Die Ausbildung von
Interferenzlinien („Regenbogenlinien“) auf beiden Außenstegen zeigt, dass das Deckglas
richtig aufsitzt und somit der Abstand zwischen Mittelsteg und Deckglas 0,1 mm beträgt.
Nun gibt man die Trypan blau-Zelllösung mit einer Pipette an die Grenze zwischen Deckglas
und Zählkammer, welche durch die Kapillarwirkung in den Spalt zwischen Deckglas und
Kammerboden gesogen wird. Es ist darauf zu achten, dass keine Luftblasen zwischen
Kammer und Deckglas verbleiben. Die so beschickte Zählkammer kann nun unter dem
Mikroskop ausgezählt werden, wobei blau gefärbte Zellen tot sind und nicht mitgezählt
werden.
GrundplatteBeschriftungsfeld
Außensteg
Zählnetze
Deckglas Interferenzlinien
Materialien und Methoden
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Abbildung 14: Vergrößerte Darstellung des eingravierten Zählnetzes auf einer Neubauer Zählkammer (modifiziert anhand der Herstellerangaben)
(a) schwarze Punkte: Zellen, die mitgezählt werden, graue Punkte: Zellen, die nicht mitgezählt werden (b) empfohlene Zählrichtung (c) großes Quadrat (insgesamt 9 pro Zählnetz) (d) kleines Quadrat (insgesamt 16 in jedem großen Quadrat eines Zählnetzes)
Alle Zellen, die innerhalb der 16 kleinen Quadrate plus diejenigen, welche auf bzw. an zwei
der vier Begrenzungslinien liegen werden in Pfeilrichtung zusammengezählt. Auf diese Weise
werden die je neun großen Quadrate der zwei Zählnetze ausgezählt, anschließend addiert
und die Zellzahl wie folgt berechnet:
Gesamtzellzahl G:
Anzahl der lebenden Zellen L:
Vitalität VI [%]:
n: Mittelwert aller gezählten Zellen
m: Mittelwert aller lebenden Zellen
VF: Verdünnungsfaktor (hier: 2) V: Volumen der Zellsuspension 104: Faktor der Zählkammer
Materialien und Methoden
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Um eine definierte Anzahl von Zellen pro cm² auszusäen, wird als nächstes die insgesamt
benötigte Zellzahl B berechnet:
Mit dem letzten Rechenschritt
ermittelt man die Menge an Zellsuspension, die in das Behältnis zuzugeben ist.
4.6 Kultur und Differenzierung
4.6.1 Passagieren
Benötigte Materialien:
Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA, Pasching, Austria (H15-002) Trypsin-EDTA (1 X) PAA (L11-004) Kulturmedium für die jeweilige Zellart
Durchführung der Methode:
Als Erstes das Kulturmedium mit einer sterilen Glaspipette absaugen und 20 ml warmes
D-PBS für 5 min in die Flasche geben, um Mediumreste, die das Trypsin inaktivieren würden,
auszuwaschen. Bei sehr hoher Konfluenz (80-100 %) sollte dieser Waschschritt ein zweites
Mal wiederholt werden. Nach erneutem Absaugen der Waschlösung Trypsin (2 ml auf eine
175 cm² Flasche) hinzugeben, durch Schwenken verteilen bis der Boden vollständig bedeckt
ist und die Flasche für 5 min bei 37 °C inkubieren lassen. Zum Lösen von noch am Plastik
adhärenten Zellen vorsichtig mit der Handinnenfläche gegen die Seitenwände klopfen.
Mikroskopisch kontrolliert man ob alle Zellen eine kugelige Form angenommen haben und
frei in der Flüssigkeit schwimmen, dies sind sichere Zeichen, dass sie sich vom Boden gelöst
haben. Ist das nicht der Fall muss die Inkubationszeit um 5 min verlängert werden. Um nun
das Trypsin zu inaktivieren und die Zellen gesammelt in ein Reaktionsgefäß überführen zu
können, die Zellen mit warmem Kulturmedium vom Flaschenboden spülen. Dazu 15 ml
Materialien und Methoden
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Medium in eine serologische Pipette aufnehmen, dabei die Flasche so halten, dass der
Flaschenhals schräg nach oben zeigt und mehrmals mit diesen 15 ml Medium die Zellen vom
Flaschenboden abspülen. Anschließend die Zellsuspension in ein Reaktionsgefäß geben und
für 7 min bei 600 x g, RT mit mittlerer Beschleunigungs- und Bremsstärke zentrifugieren.
Nach dem Absaugen des Überstands und Resuspension des Zellpellets in warmem
Zellkulturmedium werden die Zellen gezählt (siehe Kapitel 4.5.2) und auf neue Flaschen oder
Schalen verteilt.
4.6.2 Adipogene und chondrogene Differenzierung mittels industriell hergestellter
Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS: DMEM High Glucose (4,5 g/L) mit 2 mM stabilem Glutamin
+ 100 U/L Penicillin/Streptomycin + 2,5 % FCS Funktion: Basis zur Herstellung der verschiedenen Medien zur osteogenen Differenzierung und als Kontrolle
Basisdifferenzierungsmedium: Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS + 200 µM L-Ascorbinsäure-2-phosphat + 25 mM HEPES + 10 mM β-Glycerolphosphat + 1,5 mM CaCl2
Funktion: Induziert die osteogene Differenzierung und wird zur
Optimierung mit weiteren Supplementen (Dexamethason, Vitamin D3, BMP 2 und BMP 7) kombiniert
Funktion: Medium, das die besten Ergebnisse bei der osteogenen Differenzierung von Ad-MSCs erzielt
Materialien und Methoden
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4.6.5 BRE: Smad 1/5/8 Reporterassay
Zur Analyse des TGF-β Signallings werden die Zellen mit Adenovirus Typ 5 infiziert. Das BMP
Response Element (BRE) dient als Promotor, an den phosphoryliertes Smad1/4 als
Transkriptionsfaktor bindet (Hata, Seoane et al. 2000, S. 230). Mit Ad5-BRE-Luc infizierte Ad-
MSCs bilden Luciferase, wenn Smad1/4 phosphoryliert, also der Smad1/5/8-Signalweg vom
BMP-Liganden aktiviert wird (siehe Abbildung 15).
Abbildung 15: Smad 1/5/8 Luciferase Reporter Assay Nach Rezeptoraktivierung wird der Smad 1/5/8-Komplex phosphoryliert und induziert zusammen mit Smad 4 die Luciferase Expression. Das anschließend zugesetzte Luciferase Substrat wird von der gebildeten Luciferase gespalten wobei ein Lichtsignal entsteht (in Anlehnung an: Massague 2000, S. 170).
Benötigte Materialien:
Ad5-BRE-Luc Virus bereitgestellt von Prof. S. Dooley Rekombinantes Humanes BMP 2 PeproTech, Hamburg (120-02) Rekombinantes Humanes BMP 7 PeproTech, Hamburg (120-03) Cell Culture Lysis reagent 5 x und Promega, USA (E153A) Luciferase Substrate
Tabelle 5: Verwendete BMP-Konzentrationen Eingesetzte BMP-Konzentrationen bei der Überprüfung der Aktivierung des TGF-β Signallings mittels BRE Reporterassay.
Vor Zugabe des Luciferasesubstrates sollten die Einstellungen am Elisa reader vorgenommen
werden: Lumineszenz Messung des durch die Luciferase gebildeten Lichtes mit einem
maximalen gain (4000); da die Enzymaktivität ihren Peak zeitabhängig erreicht, wird die
Messung mindestens sechs Mal wiederholt, um einen aussagekräftigen Mittelwert zu
erhalten. Die Messwerte werden in Relative Light Units angegeben (RLU).
Zur Berechnung der RLU pro µg Protein benötigt man die Proteinmenge der gemessenen
Proben (siehe Kapitel 4.6.6). Die gemessene RLU jedes einzelnen Wells wird durch die
Materialien und Methoden
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dazugehörige Proteinmenge geteilt, abschließend wird noch der Mittelwert aus allen einzeln
gemessenen RLU/µg Protein für jede BMP-Konzentration und -Konstellation ermittelt.
4.6.6 Normalisierung der Luciferasemessung mittels Lowry Proteinmessung
Die Proteinmenge wird mittels der von Lowry veröffentlichten Folin Phenol Methode
bestimmt (Lowry, Rosebrough et al. 1951, S. 265-268).
Benötigte Materialien:
Bovines Serum Albumin (BSA) Sigma, München (A4503) Na-K-Tartrat Sigma (228729) CuSO4*6H2O Sigma (31293) Na2CO3 Sigma (S2127) 1 M NaOH Merck, Darmstadt (109137) Folin Reagenz Sigma (47641)
Durchführung der Methode:
Herstellung der benötigten Lösungen:
1. 10 µg/µl BSA Stocklösung:
Endkonzentration:
50 mg BSA 10 μg/μl 5 ml ddH2O
Zur Berechnung der Standardkurve benötigt man verschiedene BSA-Konzentrationen, die
Tabelle 6: Pipettierschema der BSA-Konzentrationen zur Erstellung der Standardkurve Übersicht über die verschiedenen Konzentrationen von BSA Stock und ddH2O zur Erstellung einer Standardkurve.
Aliquots der BSA Stocklösung können bei -20 °C gelagert werden.
2. Na-K-Tartrate Stocklösung:
Endkonzentration:
2 g Na-K-Tartrate 2 % 100 ml ddH2O in brauner Flasche lagern
Materialien und Methoden
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3. CuSO4 Stocklösung:
Endkonzentration:
1 g CuSO4 * 6 H2O 1 % 100 ml ddH2O in brauner Flasche lagern
4. Na2CO3 Stocklösung:
Endkonzentration:
20 g Na2CO3 2 % 900 ml ddH2O 100 ml 1 M NaOH 100 mM
5. Lösung A:
Endkonzentration:
20 µl Na-K-Tartrate Stocklösung 1 % 20 µl CuSO4 1 % 1,96 ml Na2CO3 98 % immer frisch vor Gebrauch herstellen!
6. Lösung B:
Endkonzentration:
100 µl Folin Reagenz 1 mg/dl 2,9 ml ddH2O immer frisch vor Gebrauch herstellen!
Es werden je 2 µl der Probe in ein Well einer 96 Well Platte pipettiert. Zur gleichzeitigen
Erstellung der Standardkurve werden als Triplikate je 2 µl jeder BSA Konzentration
(Tabelle 6) in ein Well einer 96 Well Platte pipettiert. Dann gibt man 150 µl Lösung A in jedes
Well (Probe und Standardkurve) und lässt alles für 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
Anschließend werden 30 µl von Lösung B zugegeben, gut gemischt, um eine
Präzipitatbildung zu vermeiden, und es folgt ein weiterer Inkubationsschritt von 1 – 2 h bei
Raumtemperatur. Anschließend ist zu beobachten, wie sich die gelbe Lösung allmählich blau
verfärbt. Je intensiver die Blaufärbung umso mehr Protein ist in der Probe. Die Absorption
wird mit dem Elisa Reader bei = 750 nm gemessen.
Materialien und Methoden
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Zur Berechnung der Proteinmenge muss zuerst die Geradengleichung anhand der
Standardkurve (siehe Abbildung 16) ermittelt werden. Nun wird die Geradengleichung nach
x aufgelöst, die gemessenen Werte für y eingesetzt. Als Ergebnis erhält man die
Proteinmenge der Probe in µg/µl.
Zum Beispiel:
Abbildung 16: Beispiel einer Standardkurve der BSA-Lösung Das Diagramm zeigt ein Beispiel für eine Standardkurve der BSA-Lösung, dabei ist auf der Abszisse die BSA-Konzentration in µg/µl und auf der Ordinate die Absorption bei λ = 750 nm dargestellt.
Standardkurve BSA
0 2 4 6 80.0
0.2
0.4
0.6
y = 0,05905x + 0,04360
R2 = 0,9893
BSA [µg/µl]
OD
[
= 7
50
nm
]
Materialien und Methoden
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4.7 Polymerase Kettenreaktion (PCR): Charakterisierung auf mRNA-
Folgende Lösungen müssen vor Beginn der Isolation hergestellt werden:
1. DEPC H2O
Endkonzentration
1 ml DEPC 0,1 % 1 l ddH2O für 1 h bei 37 °C inkubieren, anschließend autoklavieren und abkühlen lassen.
2. 10 X Tris-Borat-EDTA-Puffer (TBE)
Endkonzentration
540 g TRIS-aminomethan (MW: 121,14 g/mol) 0,89 M 275 g Borsäure (MW: 61,83 g/mol) 0,89 M 37,3 g EDTA (MW: 372,24 g/mol) 20 mM 5 L H2O auf pH 8,3 einstellen
Materialien und Methoden
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3. PCR Ladepuffer (5 X)
Endkonzentration
1 mg Zyanoblau 25 ml 10 X TBE 5 X 5 ml Glycerol 10 % 20 ml H2O
Während der gesamten Isolation ist unter dem Abzug zu arbeiten, da einige der
verwendeten Substanzen gesundheitsschädlich sind. Die Zellen wurden bis zu einer nahezu
100 %igen Konfluenz kultiviert. Zu Beginn wird das Medium vorsichtig von den Zellen
gesaugt, TriFast zugegeben und gleichmäßig über den Boden verteilt:
Die Zellen werden gründlich mit einem Zellschaber vom Plastikboden abgeschabt und die
Suspension in ein steriles Eppendorf-Gefäß überführt. Soll die Isolation zu einem anderen
Zeitpunkt fortsetzen werden, können die Zellen bei -80 °C eingefroren werden, andernfalls
wird die Zelllösung für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Bei allen nachfolgenden
Bearbeitungsschritten werden die Proben stets auf Eis gelagert. Nach Zugabe von 100 µl
Chloroform je 500 µl TriFast wird alles für 15 s vermischt und eine weitere Inkubationspause
von 5-10 min eingelegt. Während der anschließenden Zentrifugation bei 14.000 x g, 4 °C für
10 min wird in einem weiteren Eppendorf-Reaktionsgefäß 250 µl Isopropanol je 500 µl
TriFast vorbereitet. Nach der Zentrifugation den RNA-haltigen Überstand (obere, klare
Schicht) (Abbildung 17 a) vorsichtig in das bereitgestellte Eppendorf-Gefäß pipettieren.
Beides wird vermischt, für 10 min auf Eis inkubiert und erneut wie oben zentrifugiert. Die
RNA setzt sich unten als gelartiges meist nicht sichtbares Pellet ab (Abbildung 17 b).
Materialien und Methoden
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Abbildung 17: (a) Phasentrennung nach dem ersten Zentrifugationsschritt (b) gelartiges Pellet enthält RNA Das linke Reaktionsgefäß ist eine schematische Darstellung der Phasentrennung nach dem ersten Zentrifugationsschritt, wobei der wässrige Überstand die RNA enthält. Rechts ist ein Gelpellet am Gefäßboden zu erkennen, das sich nach Zentrifugation des RNA-Überstands mit Isopropanol vermischt, absetzt.
Die flüssige Phase über der RNA wird abgeschüttet, 1 ml Ethanol 70 % zugegeben, im
Anschluss wieder wie oben beschrieben zentrifugiert und der Überstand abgegossen. Diesen
Waschschritt ein weiteres Mal wiederholen, danach das Pellet in 30 µl DEPC H2O
resuspendieren und den verbleibenden Alkohol bei offenem Deckel verdampfen lassen
(10-15 min). Die RNA wird bei -20 °C gelagert bis sie genutzt wird.
4.7.2 Bestimmung von Menge und Reinheit der RNA
Diese beiden Kriterien werden mit dem NanoDrop Spectrophotometer bestimmt. Zu Beginn
muss das Gerät geeicht werden, dazu ermittelt man den Blindwert von DEPC-H2O.
Anschließend je 1 µl der zu messenden Probe auftragen und gleichzeitig die optische Dichte
bei 230, 260 und 280 nm messen. Anschließend berechnet das Programm folgende
Quotienten:
260/280: diesen Quotienten nennt man auch primären Reinheitsparameter. Der
Richtwert für reine DNA liegt bei 1,8 und für reine RNA bei 2,0. Liegen diese
Werte niedriger, spricht dies für eine Verunreinigung durch Proteine, Phenol oder
andere Stoffe, die bei 280 nm absorbieren.
RNA
Proteine RNA
a b
DNA
Materialien und Methoden
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260/230: dieser Quotient repräsentiert den sekundären Reinheitsparameter. Der
Sollwert liegt zwischen 1,8 bis 2,2. Niedrigere Werte können z.B. durch eine
Verunreinigung mit Kohlenhydraten und / oder Phenol verursacht sein.
Zusätzlich berechnet das Programm über eine modifizierte Beer-Lambert Gleichung die RNA-
Menge in ng/µl. Für weitere Informationen zum Gerät siehe Benutzerhandbuch.
4.7.3 Überprüfung der Integrität der RNA
Mittels Gelelektrophorese (siehe Kapitel 4.7.6) wird die Intaktheit der mRNA überprüft.
Zunächst wird anhand der in Kapitel 4.7.2 bestimmten RNA-Menge berechnet, welches
Volumen der RNA-Probe 0,5 µg RNA enthält. Das ermittelte Volumen der Probe wird mit
DEPC-H2O bis auf ein Gesamtvolumen von 10 µl aufgefüllt. Nach Zugabe von 3 µl PCR-
Ladepuffer werden 10 µl von jeder Probe und 2 µl des pUC19-Markers auf ein 1,5 %iges
Agarosegel geladen und für 40 min bei 60 V an den Power Supply angeschlossen. In der
anschließenden Fotodokumentation zeigt die intakte mRNA zwei klare Banden (28S und 18S
ribosomale RNA), ist sie jedoch degradiert sind nur weiße Schlieren zu erkennen. Ein Beispiel
für intakte RNA zeigt Abbildung 18.
Abbildung 18: Beispiel einer Gelelektrophorese mit intakter RNA (invers dargestellt) Rechts ist der pUC19-Marker zu erkennen. Die aufgetragenen RNA-Proben weisen je 2 Banden, 28S und 18S ribosomale RNA auf, was für die Intaktheit der RNA spricht.
28S
18S
Proben Marker
Materialien und Methoden
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4.7.4 Synthese von komplementärer DNA (cDNA)
Zur Charakterisierung der Zellen mittels PCR muss nun die zuvor gewonnene mRNA in cDNA
NM_006475 TAA GTT TGT TCG TGG TAG CAC C GTG TGG GTC CTT CAG TTT TGA TA 60 140
RANKL NM_033012.3 TCC CAA GTT CTC ATA CCC TGA CAT CCA GGA AAT ACA TAA CAC TCC
56 245
Tabelle 9: Informationen über die verwendeten Primer Tabellarische Auflistung von Akzessionsnummer, Primersequenzen, Hybridisierungstemperatur und Amplicongröße für das jeweilige Gen.
Nach Ablauf des PCR-Programms werden die Proben mittels Gelelektrophorese (siehe Kapitel 4.7.6) ausgewertet.
Herstellung des 1 X TBE: 1:10 Verdünnung des 10 X TBE (siehe Kapitel 4.7.1) mit dH2O.
Hauptbestandteil des Gels ist das Polysaccharid Agarose, dessen Moleküle ein engmaschiges
Netz bilden, das die Wanderung der geladenen Teilchen erschwert. Die Porengröße dieses
Netzes lässt sich durch Konzentrationsänderungen der Agarose variieren. Üblich sind
Agarosekonzentrationen zwischen 1,5 bis 2 %, wobei für kleine geladene Teilchen ein hoher
Agaroseanteil im Gel gewählt werden sollte und umgekehrt. Für die nachfolgenden Versuche
wurde ausschließlich 1,9%iges Agarosegel verwendet (nur am speziell eingerichtetem
Ethidiumbromidplatz arbeiten, Nitrilhandschuhe verwenden und Verbrauchsmaterialien
sowie Gel im Sondermüll entsorgen):
Endkonzentration
1,9 g Agarose 1,9 % 100 ml 1 X TBE
aufkochen lassen, bis die Agarose vollständig gelöst und eine klare Flüssigkeit entstanden ist.
Nach der Zugabe von 7 µl Ethidiumbromid das Gel auf den vorbereiteten Gelschlitten gießen
und abkühlen lassen (ca. 30 min). Nun den Kamm, der kleine Taschen im Gel ausspart,
vorsichtig herausziehen und den Schlitten in die mit 1 X TBE gefüllte Kammer einsetzen. Die
Kammer muss mindestens bis 0,5 cm über dem Niveau der Geloberfläche mit Puffer
aufgefüllt werden.
Materialien und Methoden
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Zum Befüllen der einzelnen Taschen wird die Probe (20 µl) mit 5 µl Ladepuffer (pUC19-
Marker ready-to-use) vermischt und 8 µl dieser Mischung in die Tasche pipettiert. Sind alle
Proben in die Taschen eingebracht, die Kathode probennah und die Anode probenfern
anschließen und die Einstellungen am Power Supply vornehmen. Als Standardeinstellung
wurde in dieser Arbeit eine Spannung von 90 V für 30 min gewählt.
Zur Auswertung und Fotodokumentation wird der Intas Gel Jet Imager verwendet.
Abbildung 19: Beispielbild einer Gelelektrophorese (invers dargestellt) Links ist eine inverse Darstellung eines Gelelektrophoresebildes mit deutlich sichtbaren Primerdimeren zu sehen, rechts ist eine Referenzabbildung des pUC19-Markers vergrößert abgebildet.
4.8 Vitalitäts- und Viabilitätsbeurteilung mittels alamarBlue® Assay
alamarBlue® ist ein wasserlöslicher, gering toxischer Indikator zur quantitativen Bestimmung
von Zellproliferationsraten und hilft bei der Viabilitätsbeurteilung nach toxischen Einflüssen
auf die Zellen. Wachsen die Zellen so geben sie Wasserstoffionen an ihre Umgebung ab und
reduzieren diese dadurch. Findet jedoch kein Wachstum statt so bleibt das
Umgebungsmilieu oxygeniert. Der alamarBlue®-Mechanismus beruht auf einer Redox-
Reaktion, bei aktivem Zellmetabolismus (viele H+-Ionen vorhanden) wechselt der
wasserlösliche Indikatorfarbstoff Resazurin vom oxygenierten Zustand (blau, nicht
fluoreszierend) in die reduzierte Form Resorufin (rot, fluoreszierend) (vgl.
Herstellerangaben).
bp
501489404331
24219014711111067
34 (2x)
Primerdimer
Materialien und Methoden
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Benötigte Materialien:
alamarBlue® Reagenz Biozol, Eching (BZL727) Dulbecco’s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA, Pasching, Austria (H15-002)
Durchführung der Methode:
Dem Medium wird 1/10 seines Volumens an alamarBlue® Reagenz zugegeben und die Zellen
bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Bei hohem Zellmetabolismus kann der Farbumschlag bereits
nach 30 min sichtbar sein. Abschließend wird die Resorufinfluoreszenz bei = 544 nm und
= 590 nm gemessen. Die Viabilität wird immer als prozentuale Angabe im Vergleich zur
Kontrollgruppe aufgeführt.
4.9 Funktionelle Charakterisierung
4.9.1 Nachweis osteogener Eigenschaften
Zum Vergleich der verschiedenen osteogenen Differenzierungsmedien und zum Nachweis
der abgelaufenen Matrixmineralisierung werden folgende Methoden herangezogen:
4.9.1.1 Messung der Aktivität der Alkalischen Phosphatase (AP)
Die Alkalische Phosphatase ist ein in Leber, Knochen und Plazenta produziertes Enzym und
kann vor allem im wachsenden Knochen und Gallenflüssigkeit in hohen Konzentrationen
nachgewiesen werden. Der Reaktionsmechanismus beruht auf einer Phosphatabspaltung
durch die Alkalische Phosphatase. Das farblose Substrat 4 Nitrophenolphosphat (pNPP) wird
in das gelb gefärbte 4 Nitrophenol (pNP) umgesetzt.
Benötigte Materialien:
4 Nitrophenolphosphatdinatriumsalz Sigma, München (71768) Hexahydrat (pNPP) -20 °C
3,75 g Glyzin (MW: 75,07 g/mol) 50 mM 12,11 g Trizma-base (MW: 121,12 g/mol) 0,1 M 203 g Magnesiumchlorid (MW: 203,31 g/mol) 1 M 1 L H2O pH auf 10,5 mit NaOH einstellen
Nun berechnet man das benötigte Volumen:
100 µl pro Well einer 96-Well-Platte 250 µl pro Well einer 48-Well-Platte 500 µl pro Well einer 24-Well-Platte
Nach Ermittlung des benötigten Gesamtvolumens kann die gleiche Menge AP-
900 µl AP-Aktivitäts-Puffer +100 µl 4 Nitrophenollösung 10 mM
1000 µl AP-Aktivitäts-Puffer
Materialien und Methoden
Seite | 58
Somit kann jedem Extinktionswert eine bestimmte Substratkonzentration zugeordnet
werden. Die Werte können dann mittels der Software Microsoft Excel in einem
Punktdiagramm gegeneinander aufgetragen werden, wobei die Substratkonzentration auf
der Abszissenachse und die Extinktion auf der Ordinate dargestellt wird. Durch die
Messpunkte wird eine Gerade gelegt und deren Funktion in der Form
bestimmt (siehe Abbildung 21).
Abbildung 21: Beispiel einer Standardkurve für die AP-Aktivität Standardkurve der AP-Aktivität, wobei auf der x-Achse die Konzentration des 4 Nitrophenol (pNP) aufgetragen wird und auf der y-Achse die dazugehörigen gemessenen Extinktionswerte.
Die Geradengleichung wird wie folgt nach x aufgelöst werden:
Zur Ermittlung der Substratkonzentration der Proben in µM muss der gemessene
Extinktionswert für y eingesetzt werden.
Das Kulturmedium vorsichtig von den Zellen absaugen, die AP-Substratlösung hinzugeben
und alles bei 37 °C inkubieren. Gleichzeitig wird AP-Substratlösung ohne Zellen zur
Standardkurve AP-Aktivität
0 100 200 300 400 5000
1
2
3
y = 0,005407x + 0,06280
R2 = 0,9978
pNP [µM]
OD
[
= 4
05
nm
]
Materialien und Methoden
Seite | 59
Ermittlung des Blindwertes und als negative Kontrolle inkubiert. Zur Messung werden immer
100 µl pro Well in einer 96-Well-Platte verwendet. Die Inkubationszeit variiert je nach
vorhandener Enzymmenge (30 min bis Stunden), sobald jedoch eine Gelbfärbung erkennbar
ist, kann mit einer Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von = 405 nm (siehe
Abbildung 22) die gebildete 4 Nitrophenolmenge genau bestimmt werden. Durch
Verrechnung mit den Blindwerten (AP-Substratlösung ohne Zellen) und Einsetzen der
Extinktionswerte für y in die oben angeführte Gleichung ergibt sich die
Substratkonzentration in µM.
Abbildung 22: Spektraluntersuchung der AP-Substrat-Lösung Die Abbildung zeigt das Absorptionsmaximum der AP-Substrat-Lösung bei 405 nm
Zum Normalisieren der AP-Aktivität auf die Zellmenge folgt im Anschluss eine Sulforhodamin
B Färbung (siehe Kapitel 4.5.1).
Wellenlänge [nm]
Ab
sorp
tio
n
Materialien und Methoden
Seite | 60
4.9.1.2 Alkalische Phosphatase (AP-) Färbung
Durch diese Methode kann das Zytoplasma von AP-positiven Zellen blau angefärbt werden.
12,11 g Trizma-base (MW: 121,12 g/mol) 0,1 M 1 L dH2o pH auf 8,5 mit HCl einstellen
2. AP-Färbepuffer
Endkonzentration
5 ml 99,9 % Dimethylformamid 0,5 % 407 mg MgCl2 * H2O (MW: 203,31 g/mol) 2 mM 1 L 0,1 M Tris Puffer
3. Formaldehyd (3,7%)
Endkonzentration
20 ml Formaldehyd (37%) 3,7 % 180 ml dH2O
4. AP-Färbelösung
Endkonzentration
0,6 mg Echtblausalz 0,06 % 0,1 mg Naphthol AS-MX-phosphat disodium Salz 0,01 % 1 ml AP-Färbepuffer filtrieren wegen Flockenbildung
Materialien und Methoden
Seite | 61
Zur Fixierung der Zellen saugt man das Kulturmedium vorsichtig ab und bedeckt den
Wellboden für 10 min mit 3,7 % Formaldehyd (unter dem Abzug arbeiten). Das benötigte
Gesamtvolumens der AP-Färbelösung beträgt:
100 µl pro Well einer 96-Well-Platte 250 µl pro Well einer 48-Well-Platte 500 µl pro Well einer 24-Well-Platte
Das Formaldehyd abnehmen (Sondermüll!), die AP-Färbelösung zugeben und für 30 min bei
37 °C inkubieren lassen. Anschließend die Färbelösung absaugen und nun kann unter dem
Lichtmikroskop die Blaufärbung der Zellen beobachtet werden (siehe Abbildung 23).
Arbeitsschritt Lösung Dauer / Temperatur
Fixierung 3,7 % Formaldehyd 10 min / RT
Färbung AP-Färbelösung 30 min / 37 °C
Tabelle 10: Arbeitsschritte der AP-Färbung Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der AP-Färbung.
Abbildung 23: osteogen differenzierte Fettstammzelle in AP-Färbung dargestellt (Vergrößerung: 20 X) Die Alkalische Phosphatase wird in der Zelle durch die AP-Färbung blau sichtbar.
Materialien und Methoden
Seite | 62
4.9.1.3 Van Kossa Färbung
Mit dieser Färbung können die extrazelluläre Kollagen-Matrix und deren Mineralisierung
dargestellt werden, wobei sich das Mineral dunkelbraun bis schwarz färbt.
15 g Silbernitrat (MW: 169,9 g/mol) 3 % 500 ml dH2O
2. Natriumcarbonat-Formaldehydlösung
Endkonzentration
50 g Natriumcarbonat (MW: 105,99 g/mol) 5 % 250 ml Formaldehyd 35 – 37 % ~ 10 % 750 ml dH2O
3. 10 % Natriumthiosulfatlösung
Endkonzentration
100 g Natriumthiosulfat Pentahydrat (MW: 248,21 g/mol) 10 % 1 L dH2O
Zu Beginn wird das Medium abgeschüttet und die Zellen mit 99,8 % Ethanol für eine Stunde
bei -20 °C fixiert. Nun wird das Ethanol abgeschüttet und die Zellen dreimal unter
Leitungswasser gewaschen (mit schwachem Wasserstrahl, der nur den Wellrand trifft). Je
nach Wellgröße gibt man im Färbeschritt für 30 min bei Raumtemperatur folgende Menge
der 3 %igen Silbernitratlösung hinzu:
Materialien und Methoden
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100 µl pro Well einer 96-Well-Platte 250 µl pro Well einer 48-Well-Platte 500 µl pro Well einer 24-Well-Platte
Es folgt ein weiterer Waschschritt mit Leitungswasser wie oben beschrieben und nun gibt
man für 2 min Natriumcarbonat-Formaldehydlösung zur Reduktion des Silbernitrats hinzu.
Im Anschluss an einen weiteren Waschschritt wird für 5 min mit einer 10 %
Natriumthiosulfatlösung überschüssiges Silbernitrat entfernt. Noch dreimal mit
Leitungswasser spülen bevor das Färbeergebnis fotodokumentiert werden kann (siehe
Abbildung 24).
Arbeitsschritt Lösung Dauer / Temperatur
Fixierung 99,8 % Ethanol 1 h / - 20 °C
Waschen Leitungswasser 3 x
Färbung 3 % Silbernitratlösung 30 min / RT
Waschen Leitungswasser 3 x
Reduktion Natriumcarbonat-Formaldehydlösung
2 min / RT
Waschen Leitungswasser 3 x
überschüssiges Silbernitrat entfernen
10 % Natriumthiosulfatlösung 5 min / RT
Waschen Leitungswasser 3 x
Tabelle 11: Arbeitsschritte der van Kossa Färbung Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der van Kossa Färbung.
Abbildung 24: osteogen differenzierte Fettstammzelle in van Kossa Färbung dargestellt (Vergrößerung: 10 X) Mineralbestandteile werden durch die van Kossa Färbung dunkelbraun bis schwarz angefärbt.
Materialien und Methoden
Seite | 64
4.9.1.4 Alizarin Rot Färbung
Diese Methode ermöglicht eine Färbung der angereicherten Calciumionen und deren
quantitative Bestimmung mittels einer Absorptionsmessung.
Benötigte Materialien:
Alizarin Rot S Sigma, München (5533) Hexadecylpyridiumchloridmonohydrat Sigma (9002) Ethanol 99,8 % Apotheke, MRI Durchführung der Methode:
Herstellung der benötigten Lösungen:
1. 0,5 % Alizarin Rot Lösung (pH = 4,0)
Endkonzentration
500 mg Alizarin Rot S (MW: 342,3 g/mol) 10 mM 100 ml H2O auf pH 4,0 einstellen im Wasserbad 37 °C lösen, ist max. 2 Monate haltbar
2. Cetylpyridiumchloridlösung 10 %
Endkonzentration
10 g Hexadecylpyridiumchloridmonohydrat 10 % (MW: 358,01 g/mol) 100 ml H2O
Zur Bestimmung der Standardkurve wird folgendes Pipettierschema angewandt und die
Extinktion der einzelnen Proben bei λ = 562 nm bestimmt:
Standard # Cetylpyridiumchlorid
10% [µl] Alizarin Rot Lösung
0,5% [µl] Konzentration
[µmol]
1 1000 0 0
2 999,32 0,68 1
3 996,6 3,4 5
4 993,16 6,84 10
5 982,9 17,1 25
6 965,8 34,2 50
7 931,6 68,4 100
8 863,2 136,8 200
9 794,8 205,2 300
10 726,4 273,6 400
Tabelle 12: Schema zum Pipettieren der Alizarin Rot Standardkurve Pipettierstandards zur photometrischen Bestimmung der Alizarin Rot Konzentration in der extrazellulären Matrix .
Materialien und Methoden
Seite | 65
Mittels der erstellten Standardkurve (siehe Abbildung 25) kann jedem ermittelten
Extinktionswert eine bestimmte Konzentration Alizarin Rot zugeordnet werden. Die
Extinktion des Standard # 1 stellt den Blindwert der Messung dar. Mittels der Software
Microsoft Excel werden Extinktion und Konzentration in einem Punktdiagramm
gegeneinander aufgetragen, wobei die Extinktion auf der Ordinate und die Alizarin Rot
Konzentration auf der Abszisse dargestellt werden. Es wird eine Gerade durch die einzelnen
Messpunkte gelegt und deren Funtkion in der Form y = mx + c ermittelt. Man erhält
folgendes Diagramm:
Abbildung 25: Beispiel einer Standardkurve für Alizarin Rot Mittels der Standardkurve kann jedem gemessenen Extinktionswert die zugehörige Alizarin Rot Konzentration zugeordnet werden.
Die Geradengleichung wird wie folgt nach x aufgelöst:
Um die Alizarin Rot Konzentration der Proben in µmol berechnen zu können muss der
gemessene Extinktionswert für y eingesetzt werden.
Standardkurve Alizarin Rot
0 100 200 300 4000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
y = 0.0009399x + 0.03843
R2 = 0,9934
Alizarin Rot [µmol]
OD
[
= 5
62
nm
]
Materialien und Methoden
Seite | 66
Das Medium wird abgeschüttet und die Zellen mit 99,8 % Ethanol für eine Stunde bei -20 °C
fixiert. Danach wird das Ethanol abgenommen und die Zellen vorsichtig dreimal mit
Leitungswasser gewaschen. Zur Färbung der Zellen gibt man für 10 min 0,5 % Alizarin Rot
Lösung dazu, wäscht danach zweimal mit Leitungswasser und lässt alles bei Raumtemperatur
5 bis 10 min trocknen. Zur Quantifizierung wird der Farbstoff mit 10 % Cetylpyridium-
chloridlösung (150 µl / 48-Well) vollständig gelöst und die Absorption bei = 562 nm (siehe
Abbildung 26) gemessen.
Abbildung 26: Spektraluntersuchung der Alizarin Rot Färbelösung
Die Abbildung zeigt das Absorptionsmaximum der Alizarin Rot Färbelösung bei = 562 nm.
Arbeitsschritt Lösung Dauer / Temperatur
Fixierung 99,8 % Ethanol 1 h / -20 °C
Waschen Leitungswasser 3 x
Färbung 0,5 % Alizarin Rot Lösung 10 min / RT
Waschen Leitungswasser 2 x
Trocknen 5 - 10 min / RT
Farbstoff lösen / Quantifizierung
10 % Cetylpyridium-chloridlösung
bis der Farbstoff vollständig gelöst ist / RT
Tabelle 13: Arbeitsschritte der Alizarin Rot Färbung Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der Alizarin Rot Färbung.
Um für die nachfolgenden Versuche die Parameter der Reproduzier- und Vergleichbarkeit zu
gewährleisten, muss die maximal verwendbare Zellzahl pro cm² ermittelt und anschließend
als Standard festgelegt werden.
Für diesen Versuch wurde eine 96 Well Platte verwendet. In je drei Wells wurden 2.000
Zellen gegeben und die Zellzahl immer um weitere 2.000 Zellen bis auf 30.000 Zellen pro
Well gesteigert. Zur Kontrolle wurden die verbleibenden drei Wells nur mit Medium
bestückt. Nach einer Inkubationsdauer von 24 h bei 37 °C bei 5 % CO2 wurde mittels
alamarBlue® (siehe Kapitel 4.8) und SRB-Färbung (siehe Kapitel 4.5.1) ermittelt, wie viele
Zellen mit steigender Anzahl noch überleben bzw. adhärieren können.
Abbildung 29: Bestimmung der Zellviabilität mittels alamarBlue® R² = 0,9391, N = 3, n = 3; Die Darstellung zeigt, dass die Viabilität der Zellen bis 24.000 Zellen/cm
2 ansteigt, darüber hinaus
sinkt sie jedoch wieder ab.
Zellviabilität (alamarBlue®)
0 10000 20000 300000
20000
40000
60000
Zellzahl
alam
arB
lue®
[Ex
/Em
= 5
44
/59
0 n
m]
Ergebnisse
Seite | 72
Abbildung 30: Bestimmung der Zelladhärenz mittels SRB-Färbung R² = 0,9256, N = 3, n = 3; Bis zu einer Dichte von 26.000 Zellen/cm2 können die Zellen adhärieren, darüber hinaus beginnen sie zu verklumpen.
Bis 24.000 Zellen pro cm2 zeigte die alamarBlue® Messung (Abbildung 29) einen nahezu
linearen Anstieg. Die am Vortag in diesen Wells ausgesäten Zellen hatten weder Platz- noch
Nährstoffmangel. Ab jedoch 26.000 Zellen pro cm2 fielen die alamarBlue® Werte stark ab,
was ein beginnendes Absterben der Zellen signalisiert.
Ein ähnliches Bild lieferte die nachfolgende Adhärenzuntersuchung mittels SRB-Färbung
(Abbildung 30) bei der ebenso ein annähernd linearer Geradenverlauf bis 26.000 Zellen pro
cm2 und ein anschließender Abfall der gemessenen Werte zu beobachten war.
Dies zeigt, dass der Metabolismus bereits vor der maximalen Adhärenz sinkt, bedingt z.B.
durch Nährstoff- und O2-Mangel oder aber auch durch Kontaktinhibition (Seluanov, Hine et
al. 2009, S. 19352).
Da die folgenden Versuche auf einen Zeitraum von bis zu 21 Tage ausgelegt waren und die
Zellen im Wachstumsstadium weder einem Platz- noch Nährstoffmangel ausgesetzt werden
sollen, wurde eine Zellzahl von 10.000/cm² festgelegt (dies entspricht 4.000 Zellen pro Well
einer 96 Well Platte).
Zelladhärenz (SRB-Färbung)
0 10000 20000 300000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Zellzahl
SRB
OD
= 5
65
nm
- 6
90
nm
Ergebnisse
Seite | 73
5.2 Chondrogene und adipogene Differenzierung mit industriell
erzeugten Medien
Zum Beweis, dass es sich bei den aus Fettgewebe isolierten Zellen auch wirklich um MSCs
handelt, wurde die chondrogene und adipogene Differenzierungsfähigkeit mittels industriell
Zellen aus Passage drei wurden in eine 48 Well Platte ausgesät und je eine Hälfte der Platte
mit chondrogenem bzw. adipogenem Medium stimuliert. Der Mediumwechsel fand in einem
viertägigen Intervall statt, nach 24 Tagen wurden die Zellen fixiert und mittels Alzian Blau
Kernechtrot bzw. Ölrot O gefärbt.
Bei den chondrogen stimulierten Zellen war bereits nach 10 Tagen morphologisch die
beginnende Ausbildung von faserartigen Strukturen zu erkennen. Nach weiteren zwei
Wochen war das typische Stammzellbild verschwunden und alle Zellen hatten sich
faserförmig angeordnet. In der Alzian Blau Kernechtrot Färbung (siehe Kapitel 4.9.2) der
Präparate zeigten sich kollagene Fasern blau und die Kerne rot (Welsch 2005, S. 7). Die
unstimulierten Kontrollzellen blieben morphologisch unverändert, es färbten sich lediglich
die Zellkerne rot (siehe Abbildung 31).
Abbildung 31: Kontrollgruppe und chondrogen stimulierte Fettgewebsstammzellen nach Alzian Blau Kernechtrot Färbung Die linke lichtmikroskopische Aufnahme zeigt unstimulierte Zellen (Kontrollgruppe), Kreis = Zellkern (Vergrößerung: 10 X). Die rechte lichtmikroskopische Aufnahme zeigt mit chondrogenem Medium stimulierte Zellen nach der Alzian Blau Kernechtrot Färbung, Kreis = Zellkern, Pfeil = Kollagene Fasern (Vergrößerung: 10 X)
Ergebnisse
Seite | 74
Die Differenzierung in Richtung adipogen war im Mikroskopbild erst nach ca. 16 Tagen zu
beobachten. Bereits im Nativpräparat konnte man viele kleine, in Gruppen angeordnete
Fettvakuolen erkennen, die sich in der Ölrot O Färbung leuchtend rot darstellten. In der
Kontrollgruppe waren keine Fettvakuolen sichtbar (siehe Abbildung 32).
Abbildung 32: Kontrollgruppe und adipogen stimulierte Fettgewebsstammzellen nach Ölrot O Färbung Die linke lichtmikroskopische Aufnahme zeigt unstimulierte Zellen (Kontrollgruppe; Vergrößerung: 10 X), die rechte zeigt mit adipogenem Medium stimulierte Zellen nach der Ölrot O Färbung mit eingeschlossenen Fettvakuolen (Vergrößerung: 10 X)
Osteoblasten aus Knochen wurden als positive Kontrolle verwendet. Untersucht wurden die
TGF- Rezeptoren Typ I und II, der BMP Rezeptor Typ II, die Rezeptorentypen I und II des
insuline like growth factors wie auch der Retinoid X Rezeptor β und Vitamin D Rezeptor. Als
„house keeping gene“ wurde die Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase bestimmt.
Nach abgelaufener RT-PCR wurden die Proben wie folgt auf das Elektrophoresegel
aufgetragen:
Ergebnisse
Seite | 75
Abbildung 33: Bestimmung der Oberflächenrezeptoren auf Ad-MSCs und Osteoblasten Die Abbildung (invers dargestellt) zeigt die Ergebnisse der Gelelektrophorese für die verschiedenen Oberflächenrezeptoren, nachgewiesen mittels RT-PCR; Ad-MSCs = Proben der vier verschiedenen Spender, OSÜ = humane Osteoblasten aus dem Kollagenaseüberstand, die als positive Kontrolle dienen, H2O = negative Kontrolle, puC19 Marker.
Ad-MSCs waren für alle untersuchten Gene positiv. Somit können BMPs, Vitamin D3 und IGF
aufgenommen werden. Die Signalstärke (Expressionslevel) der Rezeptoren war zwischen Ad-
MSCs und Osteoblasten vergleichbar. Lediglich Alk 1 wurde in Ad-MSCs stärker exprimiert als
in Osteoblasten. Alk 2, IGF-I Rezeptor und Vitamin D Rezeptor wurden in Ad-MSCs
schwächer exprimiert als in Osteoblasten. Am Beispiel des Vitamin D Rezeptors war deutlich
zu erkennen, dass die Expressionslevel jedoch unter den einzelnen Spendern stark variierten.
5.4 Vier Zusätze im osteogenen Basisdifferenzierungsmedium
Zur Herstellung eines Basismediums für die osteogene Differenzierung wurden die
Supplemente, die auch in Osteoblastendifferenzierungsmedien verwendet werden, getestet.
Dazu wurde in Anlehnung an ein im Labor verwendetes Differenzierungsprotokoll (Ehnert,
Baur et al. 2010, S. 7) das Basismedium für die nachfolgende osteogene Differenzierung in
mehreren Versuchen durch Weglassen einzelner Zusätze variiert:
(c = 25 mM) und CaCl2 (c = 1,5 mM), wobei HEPES eine Pufferfunktion bei der Zugabe von
Ascorbinsäure erfüllt.
Ad-MSCs H2O MarkerOSÜ
Alk 1
Alk 2Alk 3
Alk 5
Alk 6
IGF-I R
IGF-II R
TGF-RII
Retinoid-R
GAPDH
VitaminD-R
BMPRII
TGF-RI
β
Ergebnisse
Seite | 76
Als Mediumgrundlage diente Ad-MSC Kulturmedium mit 2,5 % FCS.
Folgende Medienkonstellationen wurden untersucht:
Basisdifferenzierungsmedium 1 2 3 4
L-Ascorbinsäure-2-phosphat 200 µM
X X
HEPES 25 mM
X X
ß-Glycerolphosphat 10 mM
X
X
CaCl₂ 1,5 mM X X X
Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS X X X X
Tabelle 16: Auflistung der im Versuch verwendeten Medienzusammensetzungen Übersicht über die verwendeten Supplemente zur Herstellung der vier verschiedenen Basisdifferenzierungsmedien.
Es wurden in einer 48 Well Platte Ad-MSCs von vier verschiedenen Spendern ausplattiert.
Am nächsten Tag wurden jeweils vier Wells mit Basisdifferenzierungsmedium 1-4 stimuliert,
Mediumwechsel nach vier Tagen und Messung der AP-Aktivität am Tag acht (siehe
Abbildung 34).
Mit Basisdifferenzierungsmedium 1 stimulierte Zellen wiesen eine AP-Aktivität von im
Schnitt 11 nmol/h auf.
Durch die Zugabe von -Glycerolphosphat und CaCl2 (Basisdifferenzierungsmedium 2)
konnte die AP-Aktivität auf ca. 12 nmol/h leicht aber dennoch nicht signifikant erhöht
werden.
Im Basisdifferenzierungsmedium 3 wurden L-Ascorbinsäure-2-phosphat, HEPES und CaCl2
als Zusätze verwendet was ebenfalls eine Enzymaktivitätssteigerung auf durchschnittlich 14
nmol/h bewirkte.
Im Basisdifferenzierungsmedium 4 kamen alle vier Zusätze zum Einsatz was zu einem
signifikanten Anstieg der AP-Aktivität auf 18 nmol/h führte (p < 0,05 im Vergleich zum
Basisdifferenzierungsmedium 1).
Eine Verdünnungsreihe von Ascorbinsäure zeigte, dass bei einer Konzentration unter 200 µM
Ascorbinsäure die Zellen nicht beginnen zu differenzieren (hier nicht gezeigt).
Ergebnisse
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Abbildung 34: Zugabe verschiedener Supplemente und Ermittlung der AP-Aktivität N = 4, n = 4; Basisdifferenzierungsmedium 4 weist mit p < 0,05 (*) im Vergleich zu Basisdifferenzierungsmedium 1, in dem keine Zusätze enthalten sind, eine signifikant höhere AP-Aktivität auf.
Basisdifferenzierungsmedium 4 hat den höchsten Anstieg in der AP-Aktivität und wird
deshalb in den weiteren Versuchen zum Einsatz kommen, wobei es dort nur noch als
Basisdifferenzierungsmedium bezeichnet wird.
5.5 2,5 % FCS im Medium verspricht die besten Differenzierungserfolge
Für diesen Versuch wurden die Zellen in eine 48 Well Platte ausplattiert und je 6 Wells
wurden mit 0 %, 1 %, 2,5 %, 5 %, 10 % und 15 % FCS-Konzentration in DMEM + 2 mM
L-Glutamin + 100 U/L Penicillin/Streptomycin versetzt. Nach einer Stimulationsdauer von 16
Tagen wurde die AP-Aktivität (Abbildung 35) bestimmt sowie die Zellviabilität mittels
alamarBlue® (Abbildung 36). Nach 24 Tagen wurde die gebildete mineralisierte Matrix durch
die Alizarin Rot Färbung (Abbildung 37) ermittelt.
Basisdifferenzierungsmedium 1 2 3 4
L-Ascorbinsäure-2-phosphat 200 µM X X
HEPES 25 mM X X
ß-Glycerolphosphat 10 mM X X
CaCl₂ 1,5 mM X X X
Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS X X X X
Basisdifferenzierungsmedium (AP-Aktivität)
0
5
10
15
20
25
pN
P [
nm
ol/
h]
*
Ergebnisse
Seite | 78
Abbildung 35: AP-Aktivität bei verschiedenen FCS-Konzentrationen
Zu Beginn steigt die AP-Aktivität mit zunehmender FCS-Konzentration zügig an und erreicht ihr Maximum bei 5 % FCS. Danach nimmt die AP-Aktivität mit steigender FCS-Konzentration wieder ab. Die Medien mit 1 %, 2,5 %, 5 % und 10 % FCS weisen eine signifikant höhere AP-Aktivität auf mit p < 0,01 (**) bzw. p < 0,001 (***) im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne FCS-Zugabe.
Abbildung 36: Zellviabilitätsmessung mittels alamarBlue® Bis 10 % FCS im Medium steigt die Viabilität an, wobei bereits ab 5 % ein Plateau erkennbar wird, darüber hinaus nimmt die Viabilität wieder ab. Alle FCS-Konzentrationen weisen im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne FCS-Zugabe eine signifikant (***; p < 0,001) höhere Viabilität auf.
Serumtest (AP-Aktivität)
0% 1% 2,5% 5% 10% 15%0
5
10
15
20
25
30
35
**
***
***
***
FCS im Serum
pN
P [
nm
ol/h
]
Serumtest (alamarBlue®)
0% 1% 2,5% 5% 10% 15%0
1000
2000
3000
4000
5000
***
***
*** ***
***
FCS im Serum
alam
arB
lue®
[Ex
/Em
= 5
44
/59
0 n
m]
Ergebnisse
Seite | 79
Abbildung 37: Matrixmineralisierung bei verschiedenen FCS-Konzentrationen
Oben: Die Matrixmineralisierung erzielt in den mit Serum versetzten Medien signifikant niedrigere Werte p < 0,001 (***) im Vergleich zum Medium ohne FCS.
Unten: Van Kossa Färbung der Ad-MSCs nach Behandlung mit den verschiedenen FCS Konzentrationen. Es ist deutlich zu erkennen, dass in der Gruppe ohne FCS (links) die größte Menge an mineralisierter Matrix angefärbt werden konnte.
5.6 Vitamin D3 verbessert die osteogenen Differenzierungs-
eigenschaften des Basisdifferenzierungsmediums, Dexamethason
hingegen nicht
Zur weiteren Verbesserung des osteogenen Basisdifferenzierungsmediums wurden die zwei
Supplemente - Vitamin D3 und Dexamethason - die in zahlreichen Publikationen aufgelistet
werden, zuerst näher auf ihre zelltoxischen und osteogenen Eigenschaften untersucht.
Serumtest (Alizarin Rot)
0% 1% 2,5% 5% 10% 15%0
20
40
60
80
100
600
800
1000
FCS im Serum
****** ***
******
Aliz
arin R
ot [µ
M]
Ergebnisse
Seite | 80
5.6.1 Bestimmung nicht toxischer Vitamin D3 Konzentrationen
Bei der Herstellung der Stocklösungen trat das Problem auf, dass Vitamin D3 sich nicht
vollständig in Ad-MSC Kulturmedium lösen ließ. Deshalb musste auf Ethanol (reinst) und
DMSO ausgewichen werden. Beide Substanzen weisen aber zellschädigende Eigenschaften
auf, weshalb ein Toxizitätstest der Optimierung des Differenzierungsmediums vorgeschaltet
werden musste.
In eine 96 Well Platte wurden jeweils 10.000 Zellen (sehr hohe Zellzahl auf kleiner Fläche,
dies stellt hier jedoch kein Problem dar, da die Zellen nur 48 Stunden in Kultur gehalten
wurden) von vier Spendern gebracht.
Die Vitamin D3 Stocklösungen wurden in einer Konzentration von je 10 mM mit den
Lösungsgrundlagen Ethanol (reinst) und DMSO angesetzt. Beginnend mit 20 µM Vitamin D3
in Ad-MSC Kulturmedium wurde eine serielle 1:2 Verdünnung angefertigt, so dass die Zellen
24 Stunden nach dem Ausplattieren mit je 100 µl pro Well folgender Vitamin D3
Nach 24 Stunden wurde mittels alamarBlue® die Viabilität der Zellen untersucht:
Abbildung 38: exemplarische Darstellung des Viabilitätsverlaufes eines Spenders N = 4, n = 3; DMSO (rote Kurve) als Lösungsgrundlage für Vitamin D3 ist weniger toxisch für die Zellen als Ethanol (blaue Kurve) bei der höchsten eingesetzten Konzentration von Vitamin D3.
Vitamin D Toxizitätstest (alamarBlue®)
0
50
100
150
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5
Ethanol (reinst)
DMSO
co
log10 (Vitamin D [µM])
Via
bilitä
t [%
de
r K
on
tro
lle
]
Ergebnisse
Seite | 81
Es war deutlich zu erkennen, dass Vitamin D3 in DMSO (rote Kurve) gelöst in höheren
Konzentrationen geringer toxisch auf die Zellen wirkte als nach Lösung in Ethanol (blaue
Kurve). Eine Konzentration von 5 µM wurde von den Zellen sehr gut toleriert und ist auch
noch ausreichend hoch, um auf die osteogene Differenzierung Einfluss nehmen zu können.
5.6.2 Bestimmung nicht toxischer Dexamethason Konzentrationen
Im Gegensatz zu Vitamin D3 gab es bei Dexamethason keine Schwierigkeiten beim Ansetzen
der Stocklösung, es war vollständig in D-PBS löslich. Dennoch führten wir einen Toxizitätstest
durch, um sicher zu stellen, dass die in den Publikationen beschriebenen Dexamethason-
Konzentrationen nicht toxisch auf Ad-MSCs wirken.
Folgende Dexamethason-Konzentrationen wurden getestet:
Nach einer Inkubation von 24 Stunden wurde die Viabilität mittels alamarBlue® untersucht.
Abbildung 39: Viabilitätsbestimmung mittels alamarBlue® nach 24 h Inkubation mit Dexamethason N = 4, n = 6; Die Graphik zeigt einen konstanten Viabilitätsabfall um 11 % bis 800 nM Dexamethason.
Dexamethason Toxizitätstest (alamarBlue®)
0
20
40
60
80
100
120
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0log10(Dexamethason [nM])
Via
bili
tät
[% d
er K
on
tro
lle]
Ergebnisse
Seite | 82
In Abbildung 39 ist das prozentuale Überleben der Zellen bezogen auf die Kontrollgruppe bei
zunehmender Dexamethasonkonzentration aufgezeigt. Man konnte beobachten, dass bis zur
Höchstkonzentration von 800 nM die Viabilität um lediglich 11 % abnahm. Die in den
Publikationen verwendete Konzentration von 100 nM hat keinen signifikanten Einfluss auf
die Zellviabilität.
5.6.3 Vitamin D3 induziert die AP-Aktivität
Nachdem beide Zusätze einzeln auf ihre zellschädigende Wirkung getestet worden waren,
wurde ihr Einfluss auf die osteogene Differenzierung von Ad-MSCs näher untersucht.
Analog zum Basisdifferenzierungsmedium Test (siehe Kapitel 5.4) wurden wieder 4
Medienkonstellationen verwendet, die wie in Tabelle 17 beschrieben zusammengesetzt
waren.
Basisdifferenzierungsmedium ohne
Zusatz plus
Dexamethason plus
Vitamin D3
plus Dex. & Vitamin D3
Basisdifferenzierungsmedium X X X X
Dexamethason 100 nM
X
X
Vitamin D3 5 µM
X X
Tabelle 17: Vitamin D3- und Dexamethasonzugabe zum Basisdifferenzierungsmedium Verschiedene Konstellationen der Zugabe von Vitamin D3 und Dexamethason zum zuvor ermittelten Basisdifferenzierungsmedium
Die Ad-MSCs wurden in einer 48 Well Platte je Medium für 0, 1, 2, 4, 6 und 10 Tage
stimuliert und die AP-Aktivität gemessen (siehe Abbildung 40). Mediumwechsel fand alle vier
Tage statt.
Ergebnisse
Seite | 83
Abbildung 40: AP-Aktivitätsbestimmung nach Stimulation mit Vitamin D3 und Dexamethason
N = 3, n = 4 pro Tag und Medium; Die Zugabe von Vitamin D3 zum Basisdifferenzierungsmedium führt im Vergleich zu den anderen Medienkonstellationen ab dem 2. Tag zu einem signifikanten Anstieg der AP-Aktivität mit p < 0,05.
Am Tag 0, also bei den unstimulierten Zellen, war bei allen vier Medien eine vergleichbare
basale Enzymaktivität zu erkennen.
Mit Basisdifferenzierungsmedium (grün) und Basisdifferenzierungsmedium plus
Dexamethason (blau) stimulierte Zellen zeigten im Verlauf der zehn Tage einen geringen
Anstieg ihrer AP-Aktivität von durchschnittlich 15 nmol/h auf 36 nmol/h.
Bei Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 (orange) hingegen war
keinerlei Zunahme der Enzymaktivität zu erkennen, was für ein Ausbleiben der osteogenen
Differenzierung sprechen kann.
Differenzierungsmediumtest (AP-Aktivität)
0 2 4 6 8 10
0
25
50
75
100
125
150
Zeit [d]
pN
P [
nm
ol/h
]
Differenzierungsmediumtest (AP-Aktivität)
0 2 4 6 8 10
0
25
50
75
100
125
150
Zeit [d]
pN
P [
µM
]
Basisdifferenzierungsmedium
Basisdifferenzierungsmediumplus Dexamethason
Basisdifferenzierungsmediumplus Vitamin D
Basisdifferenzierungsmediumplus Dexamethason & Vitamin D
Differenzierungsmediumtest (AP-Aktivität)
0 2 4 6 8 10
0
25
50
75
100
125
150
Zeit [d]
pN
P [
µM
]
3
3
Ergebnisse
Seite | 84
Zellen, die mit dem Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 (rot) beimpft wurden,
verzeichneten bereits nach zwei Tagen eine deutliche Zunahme der AP-Aktivität. Im Verlauf
der nächsten acht Tage erreichte die AP-Aktivität bei ca. 123 nmol/h ihr Maximum und eine
beginnende Plateaubildung war zu erkennen.
Diese Daten zeigen, dass ein Medium bestehend aus L-Ascorbinsäure-2-phosphat, HEPES,
-Glycerolphosphat, CaCl2 und Vitamin D3 in der Lage ist, die für Osteoblasten typische
AP-Aktivität bei Ad-MSCs signifikant zu erhöhen. Die Messung kann schon nach einer
Stimulationsdauer von sechs bis zehn Tagen durchgeführt werden, da sich die Messwerte
nach diesem relativ kurzen Zeitraum bereits im Bereich der erreichbaren Maximalwerte
bewegen.
Abschließend konnte mittels der AP-Färbung (siehe Kapitel 4.9.1.2) die gebildete alkalische
Phosphatase blau angefärbt werden (siehe Abbildung 41).
Abbildung 41: osteogen differenzierte Ad-MSC in AP-Färbung dargestellt (Vergrößerung: 20 X) Die Alkalische Phosphatase wird in der Zelle durch die AP-Färbung blau sichtbar.
5.6.4 Beste Induktion der Matrixmineralisierung durch kombinierten Einsatz von
Vitamin D3 und Dexamethason
Ein weiterer Anhaltspunkt für die Differenzierung in Richtung Osteoblasten ist der Nachweis
von mineralisierter Matrix.
Zur Ermittlung wann die Matrixmineralisierung einsetzt, wurden auf 48 Well Platten
Ad-MSCs ausplattiert. Die verwendeten Medien entsprechen den Medien-
zusammensetzungen aus Kapitel 5.6.3. Je 6 Wells einer Platte wurden mit den vier
Ergebnisse
Seite | 85
Differenzierungsmediumtest 8 und 15 Tage(Alizarin Rot)
8 15 8 15 8 15 8 15 8 150
500
1000
1500
Zeit [d]
Aliz
arin
rot
[µ
mol
]
Basisdifferenzierungsmedium
Basisdifferenzierungsmediumplus Dexamethason
Basisdifferenzierungsmediumplus Vitamin D
Basisdifferenzierungsmediumplus Dexamethason & Vitamin D
Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS
3
3
Medienkonstellationen und Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS für 8 bzw. 15 Tage stimuliert.
Anschließend wurde die Menge an mineralisierter Matrix mittels Alizarin Rot Färbung
ermittelt (siehe Abbildung 42).
Abbildung 42: Bestimmung der mineralisierten Matrix nach 8- und 15tägiger osteogener Stimulation N = 1, n = 6; Die Graphik zeigt, dass nach 8 Tagen die Menge an mineralisierter Matrix bei allen 5 Medien vergleichbar ist. Nach 15 Tagen Stimulationsdauer kann bei Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason (blau) und Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 (orange) ein signifikanter Anstieg der gebildeten Matrix von p < 0,001 (***) und bei Basisdifferenzierungsmedium (grün) und Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 (rot) ein Anstieg von p < 0,0001 (****) im Vergleich zum Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS (grau) beobachtet werden.
Zellen, die nur acht Tage mit Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS bzw. den vier
Differenzierungsmedium behandelt wurden, zeigten sehr niedrige Alizarin Rot Werte.
Nach 15tägiger Stimulation jedoch waren die messbaren Alizarin Rot Werte bei allen vier
Differenzierungsmedien im Vergleich zur mit Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS beimpften
Kontrollgruppe um ein vielfaches höher. Die Mineralisierung war nach 15 Tagen schon so
weit fortgeschritten, dass nur geringe Unterschiede zwischen den einzelnen Medien messbar
waren. Abbildung 42 zeigt, dass mit Basisdifferenzierungsmedium und
Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 stimulierte Zellen, mehr mineralisierte Matrix
bilden konnten, als die mit Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason und
Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 behandelten. Um
aussagekräftigere Ergebnisse unter Berücksichtigung der Spendervarianz zu erhalten, wurde
Differenzierungsmediumtest 8 und 15 Tage(Alizarin Rot)
8 15 8 15 8 15 8 15 8 150
500
1000
1500
Zeit [d]
Aliz
arin
ro
t [µ
mo
l] **** ****
*** ***
Ergebnisse
Seite | 86
der Versuch mit zusätzlichen vier Spendern (N = 4, n = 6) bei einer Stimulationsdauer von 12
Tagen wiederholt.
Die dabei gewonnen Daten zeigt Abbildung 43:
Abbildung 43: Bestimmung der gebildeten mineralisierten Matrix nach 12 Tagen osteogener Stimulation N = 4, n = 6; Im Vergleich zur mit Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS stimulierten Kontrollgruppe erreichen die Gruppen Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 mit p < 0,001 (°°°) signifikant höhere Mineralisierungswerte. Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 erzielt mit p < 0,1 (*) im Vergleich zum Basisdifferenzierungsmedium ohne Zusätze das beste Mineralisierungsergebnis.
Abbildung 43 zeigt deutlich, dass die mit Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS stimulierten
Zellen sich nur gering mit Alizarin Rot anfärben ließen.
Mit Basisdifferenzierungsmedium und Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason
behandelte Zellen wiesen einen annähernd gleich hohen dennoch nicht signifikanten Anstieg
der Matrixmineralisierung im Vergleich zur Kontrollgruppe auf.
Jedoch konnte mit Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und
Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3 eine weitere Zunahme der
Alizarin Rot Werte erzielt werden. Die große Standardabweichung ist durch eine sehr
Differenzierungsmediumtest 12 Tage(Alizarin Rot)
0
500
1000
1500
Aliz
arin
Ro
t [µ
mo
l]
*°°°
°°°
Basisdifferenzierungsmediumohne
Zusätzeplus Dexa-methason
plus Vitamin D3
plus Dex. & Vitamin D3
Kontrolle
Basisdifferenzierungsmedium X X X XDexamethason 100 nM X XVitamin D3 5 µM X XAd-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS X
Ergebnisse
Seite | 87
ausgeprägte Spendervarianz zu erklären. Drei Spender wiesen Werte zwischen 90 und
220 µmol gebundenes Alizarin Rot auf, wohingegen diese beim vierten Spender bis 2000
µmol anstiegen.
5.7 BRE Reporterassay und Zugabe von BMP 2 und/oder BMP 7
BMP 2, 7, 9 spielen eine große Rolle bei der Entstehung von Knochen und Knorpel (Cheng,
Jiang et al. 2003, S. 1544). Allerdings waren lange Zeit nur BMP 2 und BMP 7 synthetisch
herstellbar, weswegen nur diese Einsatz im klinischen Alltag fanden. Wir haben uns deshalb
auf diese beiden Wachstumsfaktoren konzentriert.
5.7.1 Zugabe von BMP 2 und/oder BMP 7 verbessert die AP-Aktivität nicht
Für den Versuch wurden Ad-MSCs in eine 48-Well-Platte ausplattiert. Am nächsten Tag
wurden immer sechs Wells mit einem der vier verschiedenen Medien (siehe Tabelle 18) bzw.
mit Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 als Kontrollgruppe für acht Tage stimuliert.
Mediumwechsel fand nach vier Tagen statt.
Basisdifferenzierungsmedium plus
Vitamin D3 plus BMP 2 plus BMP 7
plus BMP 2 & BMP 7
Vitamin D3 X X X X
BMP 2 5 ng/ml
X
X
BMP 7 5 ng/ml
X X
Tabelle 18: Verschiedene Konstellationen der Zugabe von BMP 2 und BMP 7 zum zuvor ermittelten Basisdifferenzierungsmedium
Die Ergebnisse der AP-Aktivitätsmessung nach 8 Tagen sind in der nachfolgenden Abbildung
44 dargestellt:
Ergebnisse
Seite | 88
Abbildung 44: AP-Aktivtätsmessung nach 8tägiger Stimulation mit BMP 2 und/oder BMP 7
N = 9, n = 6; Nach einer Stimulationsdauer von 8 Tagen kann bei Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und Basisdifferenzierungsmedium plus BMP 2 ein signifikanter Anstieg der AP-Aktivität von p < 0,01 (**) im Vergleich zur Kontrollgrupe beobachtet werden.
Die AP-Aktivitätsmessung nach acht Tagen (Abbildung 44) zeigt, wie aus den
Voruntersuchungen zu erwarten, beim Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 einen
signifikanten Anstieg. Beim Basisdifferenzierungsmedium plus BMP 2 wurden vergleichbare
AP-Aktivitäts Werte erzielt wie beim Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3.
Basisdifferenzierungsmedium plus BMP 7 und Basisdifferenzierungsmedium plus BMP 2 &
BMP 7 wiesen eine niedrigere jedoch nicht signifikant geringere AP-Aktivität auf.
5.7.2 Zugabe von BMP 2 und / oder BMP 7 verbessert die Matrixmineralisierung
nicht
Analog zum vorherigen Versuchsaufbau (siehe Kapitel 5.7.1) wurden die Zellen für 12 Tage
stimuliert und mittels Alizarin Rot Färbung die mineralisierte Matrix bestimmt.
Basisdifferenzierungsmedium plus
Vitamin D3plus BMP 2 plus BMP 7
plus BMP 2 & BMP 7
Kontrolle
Vitamin D3 X X X XBMP 2 5 ng/ml X XBMP 7 5 ng/ml X XAd-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS X
BMP-Test 8 Tage (AP-Aktivität)
0
50
100
150
200
** **
pN
P [
nm
ol/h
]
Ergebnisse
Seite | 89
Abbildung 45: Quantifizierung der gebildeten Matrix nach 12 tägiger Stimulation mit BMP 2 und/oder BMP 7 N = 5, n = 6; Die Messung der Alizarin Rot Werte nach Stimulation der Zellen mit BMP 2 und/oder BMP 7 zeigt keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Medien.
In Abbildung 45 ist zu sehen, dass mit Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3
stimulierte Zellen etwas mehr mineralisierte Matrix produziert haben als Zellen, die BMPs im
Medium zugesetzt hatten. Jedoch war auch hier kein signifikanter Unterschied zwischen
dem Basisdifferenzierungsmedium und den Medien mit BMPs zu erkennen.
5.7.3 BRE Reporterassay
Da unsere Versuche entgegen vieler Publikationen keine Verbesserung der osteogenen
Differenzierung durch BMPs zeigten, haben wir die Aktivierung des BMP-Signalweges
mithilfe eines Reporterassays (siehe Kapitel 4.6.5) bestimmt.
BMP-Test 12 Tage (Alizarin Rot)
0
200
400
600
800
1000
Aliz
arin
Ro
t [µ
mo
l]
Basisdifferenzierungsmedium plus
Vitamin D3plus BMP 2 plus BMP 7
plus BMP 2 & BMP 7
Kontrolle
Vitamin D3 X X X XBMP 2 5 ng/ml X XBMP 7 5 ng/ml X XAd-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS X
Ergebnisse
Seite | 90
Abbildung 46: Luciferase Aktivität bei unterschiedlichen BMP 2 Konzentrationen N = 4, n = 2; Die Abbildung zeigt die gebildete Luciferase Aktivität in RLU normiert auf den Proteingehalt. Die Zugabe von BMP 2 konnte das Smad1-Signalling nur für 50 ng/ml und 100 ng/ml eingesetztem BMP signifikant (p < 0,001, ***) im Vergleich zur Kontrolle induzieren. Geringere Konzentrationen führten sogar zu einer Abnahme des Smad1-Signallings mit signifikanten Werten (p < 0,05, *) für die Behandlung mit 5 ng/ml BMP 2.
Abbildung 47: Luciferase Aktivität bei unterschiedlichen BMP 7 Konzentrationen N = 4, n = 2; Die Abbildung zeigt die gebildete Luciferase Aktivität in RLU normiert auf den Proteingehalt. Die Zugabe von BMP 7 konnte das Smad1-Signalling nicht nachweisbar induzieren. Tendenziell gab es eher eine Abnahme des Smad1-Signallings mit signifikanten Werten (p < 0,05, *) für die Behandlung mit 50 ng/ml BMP 7.
Smad1-Reporter Assay(Ad5-BRE-Luc)
5 10 50 100 Kontrolle0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
*
*** ***
BMP 2 [ng/ml]
RLU
/µg
Pro
tein
Smad1-Reporter Assay(Ad5-BRE-Luc)
RLU
/μg
Pro
tein
BMP 2 [ng/ml]
Smad1-Reporter Assay(Ad5-BRE-Luc)
5 10 50 100 Kontrolle 0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
*
BMP 7 [ng/ml]
RLU
/µg P
rote
in
Smad1-Reporter Assay(Ad5-BRE-Luc)
RLU
/μg
Pro
tein
BMP 7 [ng/ml]
Ergebnisse
Seite | 91
Abbildung 48: Luciferase Aktivität bei unterschiedlichen BMP2 und BMP 7 Konzentrationen
N = 4, n = 2; Die Abbildung zeigt die gebildete Luciferase Aktivität in RLU normiert auf den Proteingehalt. Die Zugabe von BMP 2 und BMP 7 konnte das Smad1-Signalling nicht signifikant verbessern.
Alle drei Diagramme weisen ein vergleichbares Basissignalling (Basisdifferenzierungsmedium
plus Vitamin D3 ohne BMPs = Kontrolle) auf. Bei BMP 2 konnte nur mit sehr hohen Dosen
(50 und 100 ng/ml) das Signalling induziert werden. BMP 7 konnte selbst in sehr hohen
Dosen keine Signalinduktion erreichen. Tendenziell zeigte BMP 7 eher eine Verminderung
des Signals. Auch eine kombinatorische Gabe von BMP 2 und BMP 7 konnte das Signalling
nicht induzieren.
5.8 Ad-MSCs exprimieren osteoblastentypische Gene nach osteogener
Differenzierung
Zum Nachweis, dass Ad-MSCs nach der osteogenen Differenzierung auch wirklich
osteoblastentypische Gene exprimieren, wurden die Zellen mittels RT-PCR weiter
untersucht. Nach 12 Tagen osteogener Differenzierung in den jeweiligen
Differenzierungsmedien (Basisdifferenzierungsmedium, Basisdifferenzierungsmedium plus
Dexamethason, Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und Basisdifferenzierungs-
medium plus Dexamethason & Vitamin D3) wurden die Expressionslevel folgender Gene
bestimmt (siehe Abbildung 49):
Smad1-Reporter Assay(Ad5-BRE-Luc)
5 10 Kontrolle0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
BMP 2 + 7 [ng/ml]
RLU
/µg P
rote
in
Smad1-Reporter Assay(Ad5-BRE-Luc)
RLU
/μg
Prot
ein
BMP 2 & 7 [ng/ml]
Ergebnisse
Seite | 92
Alkalische Phosphatase, BMP Rezeptor II, BMP 2, BMP 4, Bone Sialoprotein 2, Matrix gla
Protein, Osteocalcin, Osteopontin, Osteoprotegerin, Osteoblast Specific factor 2 und RANKL.
Die densitometrische Auswertung mit dem Bildbearbeitungsprogramm Image J ergab, dass
das Basisdifferenzierungsmedium ((1) siehe Abbildung 49) die Expression aller untersuchten
Gene induziert hat. Die Zugabe von Vitamin D3 zum Basisdifferenzierungsmedium (3)
verbesserte die Expressionslevel von BMPRII, MGP, OC, OP, OPG und RANKL weiter. Mit
Dexamethason versetzte Medien (2 und 4) verminderten die Expression aller untersuchten
osteoblastentypischer Gene.
Die densitometrische Auswertung (Abbildung 50) mehrerer Spender zeigte beispielsweise,
dass die Zugabe von Vitamin D3 zum Basisdifferenzierungsmedium die Expression von MGP
von dem 7,6 (1) auf das 13,7 fache (3) der Kontrolle verbessert hat, wohingegen in
dexamethasonhaltigen Medien nur eine 1,2 (2) bzw. 1,5 fache (4) Steigerung zu beobachten
war. Ähnliche Ergebnisse waren bei Osteopontin zu beobachten:
Basisdifferenzierungsmedium steigerte 14,2 fach, Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin
D3 19,9 fach das Genexpressionslevel, Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason
bzw. plus Dexamethason & Vitamin D3 nur 6,3 bzw. 5,3 fach.
Ergebnisse
Seite | 93
Abbildung 49: Nachweis osteoblastentypischer Gene in den differenzierten Ad-MSCs im Vergleich zu humanen Osteoblasten (invers dargestellt) Repräsentative Abbildung der RT-PCR für osteoblastentypische Gene in Ad-MSCs, MSCs, die mit den vier unterschiedlichen Medienkonstellationen stimuliert wurden (1 = Basisdifferenzierungsmedium, 2 = Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason, 3 = Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und 4 = Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3). Als positive Kontrolle wurden humane Osteoblasten und als negative Wasser verwendet, rechts ist der pUC19-Marker zu sehen.
differenzierte Ad-MSCs
OSÜ H2O Marker1 2 3 4
AP
BMPR II
BMP 2
BMP 4
MGP
OC
OP
OPG
OSF 2
RANKL
GAPDH
BSP 2
Ergebnisse
Seite | 94
Densitometrische Auswertung der untersuchten Gene:
Abbildung 50: Densitometrische Auswertung aller untersuchten Gene N = 5, n = 2; 1 = Basisdifferenzierungsmedium, 2 = Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason, 3 = Basisdifferenzierungsmedium plus Vitamin D3 und 4 = Basisdifferenzierungsmedium plus Dexamethason & Vitamin D3. Die Abbildungen zeigen das Vielfache der Bandensignale im Vergleich zur Kontrolle (humane Osteoblasten)
Alkalische Phosphatase
1 2 3 4 Kontrolle0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
BMPRII
1 2 3 4 Kontrolle0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
BMP 2
1 2 3 4 Kontrolle0
1
2
3
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
BMP 4
1 2 3 4 Kontrolle0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
BSP2
1 2 3 4 Kontrolle0
10
20
30
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
Matrix gla Protein
1 2 3 4 Kontrolle0
5
10
15
20
25
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
Osteocalcin
1 2 3 4 Kontrolle0
2
4
6
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
Osteopontin
1 2 3 4 Kontrolle0
10
20
30
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
Osteoprotegerin
1 2 3 4 Kontrolle0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
OSF 2
1 2 3 4 Kontrolle0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
RANKL
1 2 3 4 Kontrolle0
5
10
15
20
Vie
lfac
hes
der
Ko
nto
lle
*
Diskussion
Seite | 95
6 Diskussion
In dieser Arbeit wurden mesenchymale Stammzellen aus humanem Bauchdecken- oder
Hüftfett isoliert, verschiedene Supplemente zur Herstellung und Optimierung eines
osteogenen Differenzierungsmediums getestet, um abschließend die ausdifferenzierten
Stammzellen mit primären humanen Osteoblasten auf ihren osteoblastentypischen
Phänotyp hin zu vergleichen.
Chondrogene und adipogene Differenzierung mit industriell erzeugten Medien
Das „Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular
Therapy“ schlägt zur Definition von humanen mesenchymalen Stammzellen folgende
Mindestkriterien vor (Dominici, Le Blanc et al. 2006, S. 315):
1. MSCs müssen CD73, CD90 und CD105 Oberflächenmarker exprimieren und
dürfen CD11b, CD 14, CD19, CD34, CD45, oder CD79alpha und HLA-DR nicht
exprimieren.
2. MSCs müssen in der Zellkultur unter Standardbedingungen plastikadhärent sein.
3. MSCs müssen die Fähigkeit besitzen in vitro in Chondrozyten, Adipozyten und
Osteozyten zu differenzieren.
Wir untersuchten die isolierten Zellen mittels FACS Analyse und RT-PCR auf die Präsenz von
bestimmten Oberflächenmarkern. Die von uns isolierten Zellen waren in Passage drei CD13,
CD29, CD44, CD90, CD105 und CD166 positiv (Seeliger, Culmes et al. 2012, S. 124).
CD13 (Aminopeptidase N) wird in großer Anzahl auf Stammzellen und leukämischen Blasten
exprimiert (Bauvois and Dauzonne 2006, S. 88; Plesa, Chelghoum et al. 2008, S. 572).
Zusätzlich kann CD13 wichtige biologische Prozesse wie Zellwachstum, -invasion und
Angiogenese beeinflussen (Pasqualini, Koivunen et al. 2000, S. 722; Bhagwat, Lahdenranta et
al. 2001, S. 652; Bauvois and Dauzonne 2006, S. 88). CD29 (Integrin β1) spielt eine wichtige
Rolle bei der Adhäsion und Migration der MSCs (Ode, Kopf et al. 2011, S. 26). CD 44 ist der
Rezeptor für Hyaluronsäure, Osteopontin, Kollagen und Matrix-Metalloproteasen und ist
somit in die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen involviert (Naor, Sionov et al. 1997, S.
241). CD90 (Thy-1) wird allgemein als positiver Marker für MSCs verwendet, nimmt aber
auch wie CD29 an Adhäsions- und Migrationsvorgängen teil (Mason, Yarwood et al. 1997, S.
Diskussion
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1233-1234; Kasten, Beyen et al. 2008, S. 47). CD105 (Endoglin) ist ein TGF-β Corezeptor und
ist an der TGF-β/BMP Signalkaskade beteiligt (Fonsatti, Sigalotti et al. 2003, S. 427). CD166
(activated leukocyte cell adhesion molecule = ALCAM) ist ein häufig aufgeführter Marker für
mesenchymale Stammzellen (Calloni, Cordero et al. 2013, S. 1456). CD166 ist zudem auf
Zellen nachweisbar, die in dynamische Wachstumsprozesse und/oder Migrationsvorgänge,
wie z.B. die Entstehung neuronaler Verschaltungen oder die Immunantwort involviert sind
(Swart 2002, S. 313). Zusätzlich wird CD166 auf Tumorstammzellen des Colon- (Dalerba,
Dylla et al. 2007, S. 10158), Prostatacarcinoms und malignen Melanoms exprimiert
(Jezierska, Matysiak et al. 2006, S. 263).
CD14, CD31, CD34, CD45 und CD147 Oberflächenmarker, die auf eine Verunreinigung mit
Monozyten, Makrophagen und anderen Zellen hinweisen (Bobis, Jarocha et al. 2006, S. 216;
Chamberlain, Fox et al. 2007, S. 2739), waren ab Passage drei nicht mehr nachweisbar,
weshalb für die Versuche ausschließlich Zellen aus Passage drei oder vier verwendet wurden
(Seeliger, Culmes et al. 2012, S. 124).
Bei der Untersuchung der anderen Kriterien ergab sich, dass Ad-MSCs nach 12-24 h auf
Plastik adhärierten und sich problemlos in zwei (Chondrozyten und Adipozyten) der drei
geforderten Zellarten differenzieren ließen (siehe Abbildung 31 und Abbildung 32). Die
Differenzierung in Zellen der osteogenen Linie schließt sich in den nachfolgenden Versuchen
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Danksagung
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12 Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. rer. nat. Andreas K. Nüssler bedanken,
dass ich die Arbeit in der von ihm geleiteten Abteilung durchführen durfte. Mir wurden alle
benötigten Geräte, Materialen und Literatur zur Verfügung gestellt sowie stets eine
hochqualifizierte Unterstützung in der Planung und Durchführung entgegengebracht.
Ich möchte ebenfalls Frau Dr. sc. hum. Sabrina Ehnert für eine praktische und
wissenschaftliche Betreuung danken, die weit über das normale Maß hinaus ging.
Weiterer Dank geht an Herrn Prof. Dr. rer. nat. Steven Dooley für die Bereitstellung der
adenoviralen Reporterkonstrukte sowie der Arbeitsräume.