Metode oplemenjvanja 2
Metode oplemenjvanja 2
• Šta su osnovni ciljevi oplemenjivanja?– Prinos, odolevanje bolestima, kvalitet
• Kako se ti ciljevi postižu?– Poznavanje genetike i biologije organizama sa kojima se vrši
oplemenjivanje
• Šta je opravdanje za oplemenjivanje organizama?– kontrolisano genetičko prilagodjavanje organizama da služe čoveku
• Na primer…..
• Da li nam treba poboljšanje i povećanje proizvodnje hrane? – Porast brojnosti populacije –etičko pitanje - nahraniti čovečanstvo, domaće životinje, biogorivo
– Pad raspoloživosti plodnog zemljišta i vodenih resursa - etičko pitanje odgovornosti prema ekosistemu i budućim generacijama
– Porast potrebe za djubrivima, navodnjavanjem, hrebicidima, pesticidima – zdravstveno i etičko pitanje zaštite sredine
• kolateral pitanje…Da li nam treba poboljšanje zdravlja?..
Oplemenjivanje biljaka i životinja
• Genetički pristupi• “konvencionalni” i kombinovani sa
molekularno genetičkim
– ukrštanja– selekcija– inbriding– hibridizacija– molekularni markeri– mutageneza– poliploidija– transgene tehnologije
stvaranje sorti, rasa, varijeteta, kultivara...sa željenim osobinama
Mutageneza kao metod u oplemenjivanju
• Osnov za oplemenjivanje je genetička varijabilnost• Ako je nema prirodno, treba je izazvati• mutageneza je mehanizam stvaranje novih alela• Muller (oko 1920.) prvi put na Drosophila, X zračenje za
dobijanje mutanata, primenjeno zatim na poljopriovredno vredne biljke
• Do 1995. stvoreno je 77 kultivara mutagenezom a te godine 484! …i od tada raste broj
• hrana, hortikultura, drveće-voće• zrenje, otpornost na zimu, ornamentika• Bioethnologija, kasnije - ciljane mutacije, a mutageneza
“random”-slučajno• Roditelji treba da budu različiti po mutacijama da bi
segregirali osobine u F2
• Mutacije– nasledne promene u genima,
hromozomima i vanjedarnoj DNK
– slučajni dogadjaji– spontane / indukovane– germinativne/somatske
nastanak izmenjenih ćelija i tkiva
•delovanjem hemijskih i fizi čkih agenasa – mutagena•unošenjem željenih sekvenci u genom
naslednekroz generacijeu populacijama
• oštećenja DNK mogu uzrokovati mutacije
• mutacije mogu promeniti – strukturu gena– funkciju gena
• dominantne (redje)/recesivne (češće)• mutacije mogu biti
– povoljne– nepovoljne
• mutacije mogu nastajati – pod kontrolom čoveka – kao posledica antropogenih aktivnosti (stil života, zagadjenje)
• Mutageni agensi– fizički (zračenje, temperatura)– hemijski (bazni analozi, alkilirajući agensi..)
• Za mutagenezu se koristi– Cela biljka ili delovi– Cela biljka - češće za fizičke– Seme - najčešće i za hemijske i fizičke– Polen – izbegne se stvaranje himera, dobiju se željeni
heterozigoti, ali nema ga dovoljno – Kultura tkiva
• Mutageneza se sprovodi na– biljkama sa semenom (samooplodne/stranooplodne)– klonalno propagirajućim
• Kod stranooplodnih je teže razdvojiti heterozigote.Kada se tretira seme parentalne generacije, dobija se F1 u kojoj mutacije mogu biti različite
• Metode koje se primenjuju su– bulk (grupno od F1 se ide na F2)– pojedinačnih semena (od nekoliko F1 jedinki)– metod pedigrea (od svake jedinke)
Dostignuća mutageneze u oplemenjivanju
• Rezistentnost na patogene• Izmena izgleda,strukture biljke (patuljasti mutanti
cerealija, žbunast rast pasulja)• Nutricione osobine (sastav endosperma kod
kukuruza)• Promene hemijskog sastava (radi izbegavanja
alergena)• Hortikulturalne varijante (ukrasne biljke)• Muška sterilnost (radi lakšeg ukrštanja kod kukuruza)• Oplemenjivanje bespolno propagirajućih vrsta• Razvoj genetički konsturisanih linija
ograničenja mutageneze kao pristupa oplemenjivanju
• slučajnost mutacija kao dogadjaja
• sporedni efekti• potrebna velika segregirajuća populacija F2
(većina mutacija se ne može uočiti ili je štetna)• recesivnost mutacija (prepoznaju se kao
homozigoti, što je pogodno samo kod vrsta koje prirodno inbreduju)
Hromozomske mutacije - odstupanja od normalnog kariotipa
• numeričke• aneuplodije• euploidije
• strukturne• delecije
• duplikacije• inverzije
• translokacije
Poliploidija kao metod u oplemenjivanju
Ekstremi-minimalni i maksimalni broj hromozoma• Podvrsta mrava Myrmecia pilosula
– Ženke imaju jedan par hromozoma. Vrsta se razmnožava haplodiploidijom, oplodjena jaja se razviju u ženski pol (diploidi), neoplodjena (haploidi) u mužjake.
• Familija paprati, maksimalni broj kod Ophioglossum reticulatum. Oko 630 pari hromozoma u ćeliji
EUPLOIDIJE – promene u broju celih setova hromozoma
poliploidijeneparne
parne
monoploidije
monoploidija
• pogodno u oplemenjivanju biljaka, hortikulturi, jednostavnija manipulacija nego sa diploidima
• stvaranje monoploida sa željenim genotipovima, zatim dupliranje genoma u fertilnu jedinku
Upotreba kolhicina pri dobijanju diploida od monoploidaKolhicin se dodaje u ćelije u metafazi ili anafazi inhibira stvaranje deobnog vretena, hromatide ostaju zajedno u jednoj ćeliji
Dobijanje monoploidnih biljaka iz kulture tkivaHaploidni polen se zaseje na agaru sa hormonimarasta.Raste haploidna biljka
AUTOPOLIPLOIDIJA – udvajanje setova genoma iste vrste;krupniji usled krupnijih ćelija; ALOPOLIPLOIDIJA – kombinacija setova genoma različitih vrsta
• Triploidija• nastanak: nerazdvajanje hromozoma u
mejozi, oplodjenje sa 2 spermatozoida, eksprimentalno..
• Triploidi reñi u prirodi od tetra zbog nestabilnosti genoma
• najčešće sterilni- usled nejednakogsegregiranja u mejozi, stvaraju nebalansirane gamete
• niska verovatnoća da će univalenti otići na isti pol i dati haploidni gamet (1/2x-1)
• – bez semenki,vegetativno razmnožavanje
• ekonomski značajni triploidi: krompir, Winesap jabuke, banane, lubenice, ljiljani...
AUTOPOLIPLOIDIJA
• Retke unije diploidnih gametaviše produkata genakomercijalna prednost: veličina ploda,
cveta...• Tetraploidi: alfalfa, kafa, kikiriki,
Mcintosh jabuke, jagoda – oktoploid
AUTOTETRAPLOIDI (parna ploidija)
Balansirani, parni genomi–bivalenti u mejozi često daju kompletne gamete
alopoliploidi
• Ukrštanjem srodnih vrsta i udvajanjem broja hromozoma kod hibrida
• alopoliploidi su retko fertilni• nebalansirani gameti – hromozomski setovi su
homeologi• udvajanje diploidnog genoma ćelijskom fuzijom
(kolhicin)
• amfidiploidija – od dva diploidna roditelja
• Amfidiploidi mogu stvarati fertilne gamete
• Nalaze se češće u prirodi
Nicotiana tabacum, 48 hromozoma, amfidiploid
Gossypium, kiltivisani američki pamuk,ima 26 pari hromozoma, 13 velikih i 13 malih
Vrsta iz Starog sveta, ima samo 13 velikih, a divlji američki ima 13 malih - amfidiploidija
Amfidiploidija roda Brassica
• Hibridi obično ispoljavaju osobine oba roditelja, ali...
• teško je predvideti kod hibrida kombinacijuosobina roditeljskih vrsta (Raphanobrassica)
Ploidija kod žita
21 par hromozoma u mejozi, homologo sparivanje- svaki hromozomima samo 1 homologa, a ne 6 mogućih homeologa
Supresija homeologog sparivanja-alel Ph na 5. hromozomu B seta
FUZIJA PROTOPLASTA monoploidnih linija duvana,osetljivih na svetlost usled 2 recesivne mutacije na različitim lokusima,daje diplodini zeleni hibrid
SOMATSKA ALOPOLIPLOIDIJA
poliploidija kod životinja
• reñe nego kod biljaka• pljosnati crvi, vaši, neki rakovi, brojni
vodozemci i reptili, neke ribe• familija Salmonidae – nastala poliploidijom• uglavnom partenogenetska reprodukcija• ostrige: komercijalne (triploidi)-ukusne jer
su sterilne, obične (diploidi)- neukusne
biotehnologija u oplemenjivanju
• Izazivanje ciljane mutacije, a mutageneza izaziva “random”-slučajne
• Transgeni organizmi• Klonirani organizmi
– Nije isto!
Transgene tehnologije• tehnologija rekombinantne DNK – bitna u primeni:
– genske terapije– kreiranja transgenih organizama– sekvenciranja genoma
Transpozoni se široko koriste u transgenezi kod biljaka i insekata.
podru čja primene transgenih organizama
medicinai farmacija
šumarstvo
ostalo
poljoprivreda
Potrebe za primenom rezultata istraživanja
�Globalne�Regionalne�Lokalne
poljoprivredaMIKROORGANIZMI, GLJIVE, KVASCI
– enzimi za procesovanje hrane, sokova, sireva (nema ih u krajnjem proizvodu)
BILJKEkukuruz, soja, lucerka, pirina č, šećerna repa, uljana repica, pamuk, krompir, duvan, šljiva, bundeva...itd.
• hrana, sto čna hrana • proizvodi dobijeni preradom GMO
biljaka– ulje, brašno,še ćeri, sirupi, etanol
• osnovni ciljevi: – veći prinos
• kroz otpornost na šteto čine i patogene, vremenske uslove, herbicide
– hranljive vrednosti• pove ćanje vitamina, minerala,
antioksidanata, gvož ña• smanjenje alergena
ŽIVOTINJE– promena kvaliteta mesa, mleka
• otpornost na patogene– povećanje prinosa mesa, mleka– biofarming (za dobijanje terapeutika kroz mleko)
GM biljke
40
48
46
51
35
36
32
34
45
52
38
21
24
27
44
20
39
22
45
33
22
31
30
22
21
44
29
44
10
15
0 20 40 60 80 100
United Kingdom
Switzerland
Sweden
Netherlands
Italy
Germany
France
Austria
United States
Canada
Percent Response
False (Correct) Don't Know True
DA LI JE TAČAN STAV:“običan paradajz ne sadrži gene, genetički modifikovani
sadrži”
Source: Tom Hoban
1996 - 1998
Način pripreme hrane bez obzira da li sadrži GM , predstavlja najbitniji i sveprisutni faktor rizika za nastanak mutacija u ćelijama
mutacija u genomu GM organizma koji se jede“ne ulazi” u genom onih koji ga jedu
šumarstvo
• Common name - Botanical name - Year of release for fi rst field trials• 1. GE European Aspen - Populus tremula - 1988
2. GE North American Black Walnut (nut) - Juglans nigra - 19893. GE Hawaiian Papaya (fruit) - Carica papaya - 1991 and later approved for commercial crop planting in Hawaii4. GE North American Apple (fruit) - Malus domestica - 19915. GE European Sweet Chestnut - Castanea sativa - 19926. GE North American Plum (fruit) - Prunus domestica - 19927. GE Red River Gum - Eucalyptus camaldulensis - 19938. GE North American Black Spruce (conifer) - Picea mariana - 19939. GE North American Sweetgum - Liquidambar styraciflua - 199410. GE Plum (fruit) - Prunus domestica - 199411. GE Apricot (fruit) - Prunus armenica - 199412. GE Hardy Orange (fruit) - Poncirus trifoliata - 199413. GE Sweet Orange (fruit) - Citrus sinensis - 199514. GE European Black Poplar - Populus nigra - 1994 field trials; 1998 large scale plantation release in China.15. GE Gray Sheoak tree - Casuarina glauca - 199616. GE North American Silver Birch - Betula pendula - 199617. GE North American Chestnut - Castanea dentata - 199618. GE Sweet Orange (fruit) - Citrus sinensis - 199619. GE Tasmanian Blue Gum - Eucalyptus globulus - 199620. GE Norway Spruce (conifer) - Picea abies - 199621. GE North American Scots Pine (conifer) - Pinus sylvestris - 199622. GE Tropical Acacia - Acacia species - 199723. GE Western North American Monterey Pine (conifer) - Pinus radiata - 199724. GE Teak - Tectona grandis - 199725. GE Lime (fruit) - Citrus aurantifolia - 199726. GE Sour Orange (fruit) - Citrus aurantium - 199727. GE Pummelo (fruit) - Citrus grandis - 1997 6 field trials28. GE Casuarina tree - Allocasuarina verticiliata - 199729. GE Flooded Gum - Eucalyptus grandis - 199830. GE Italian Olive (fruit) - Olea europea - 199831. GE Eastern North American Cottonwood - Populus deltoides - 199832. GE North American Quaking Aspen - Populus tremuloides - 199833. GE North American Cherry (fruit) - Prunus avium - 199834. GE Tropical Avocado (fruit) - Persea species - 1 field trial35. GE South American Coffee (bean) - Coffea arabica - 3 field trials36. GE Grapefruit (fruit) - Citrus paradisi hybrid (C. maximum x C. sinensis) - 6 field trials37. GE North American Pear (fruit) - Pyrus communis - 5 field trials38. GE Persimmon (fruit) - Diospyros species - 4 field trials39. GE North American Walnut (nut) - Juglans species - 13 field trials40. GE Southeastern North American Loblolly Pine (conifer) - Pinus taeda - field trials41. GE Western North American Douglas fir (conifer) - Pseudotsuga menziesii - future field trials42. GE English Elm - Ulmus species - field trials43. GE New Zealand Kiwi fruit tree (fruit) - Actinidia chinensis - 1999 - 4 field trials44. GE Chinese White Poplar - Populus tomentosa - 1999 China45. GE Tropical Banana (fruit) - Musa acuminata - 2000 - 5 field trials46. GE-pharmaceutical Indonesian Rubber tree - blood clotting factor - Hevea brasiliensis - 200047. GE Eastern North American Rhododendron - Rhododendron species - 2000 -48. GE North American Cottonwood Hybrid - Populus trichocarpa x P. deltoides - 200149. GE North American Cottonwood Hybrid - Populus trichocarpa x P. nigra - 200150. GE North American Cottonwood Hybrid - Populus deltoides x P. nigra - 200151. GE North American Cottonwood Hybrid - Populus simonii x P. nigra - 200152. GE Chinese Larch/Tamarack (conifer) - Larix species (L. decidua, L. sibirica) - China53. GE Chinese Empress (Supa) trees - Paulownia species (P. tomentosa, P. fortunei)54. GE Persian Walnut (nut) - Juglans regia - field trials55. GE Chinese Poplar hybrid 741 - Populus alba x P. davidiana x P. simonii x P. tomentosa - 2001 China56. GE Western Australia Eucalyptus - Eucalyptus occidentalis - 200257. GE Brazilian Eucalyptus hybrids - Eucalyptus grandis x E. urophylla - 200258. GE Chinese Birch - Betula platyphylla - China59. GE Indonesian Sandalwood (essential oils) - Santalum album -60. GE North American Beech - Fagus sylvatica -61. GE Mandarin Orange (fruit) - Citrus reticulata - 200262. GE Poplar/Quaking Aspen hybrids - Populus tremula x P. tremuloides - 200463. GE North American Elm - Ulmus americana - 2004
svrha primene broj vrsta
drvena masa, papir
34
plod, ulje 25
ukrasne 2
pošumljavanje 2
etarsko ulje 1
detoksikacija zemljišta
1
biofarmacija 1
Stotine poljskih ogleda širom sveta, od 1980.samo 2 primera u komercijalnom gajenju
• samo dva slu čaja komercijalne primene
• papaja – Havaji– otpornost na ringspot virus
• Bt topola – Kina– pošumljavanje, sprečavanje
erozije
• primeri problemati čnih probnih primena
– ArborGen GMeukaliptus, Novi Zeland
• otpornost na hladnoću– FuturaGene GM
eukaliptus, Izrael• brži rast
proizvod ili rezultat modifikacijeporeme ćaj ili oboljenje organizam doma ćin
modifikacije
insulineritropoetininterferonitkivni plazminogen tPAhormon rastafaktori koagulacijeAntitrombin (Atryn)antitripsinantigen hepatitisa Bantigen Vibrio choleraeglikoproteiniS1 inhibitorletalnost larvi u potomstvu komaracaletalnost Plasmodium falciparium
dijabetesanemijamutlipla skleroza, kancerinfarkt srca i mozgapatuljasti rasthemofilija Anasledni nedostatak antitrombinaefizem plućahepatitis Bkolerakancernasledni angioedemmalarijamalarija
E. coliE. coli, sisarske ćel. u kulturiE. coli, sisarske ćel. u kulturisisarske ćelije u kulturiE. coli, sisarske ćelije u kulturiovca, svinjakozaovcakvasac, banane pirinač, šargarepa bakulovirus/ćelije insekatazeckomaracP. agglomerans/komarac
medicina i farmacija
neki primeri genskih modifikacija u primeni ili u procesu proveravanja i odobravanja
medicina i farmacija
– GM malari čni komarac• preko redukcije brojnosti larvi
unošenjem letalnog gena u mužjake
• unošenjem GM bakterije P. agglomerans, izaziva se smrtnost Plasmodium falciparium uzročnika malarije
– praćenje širenja i populacione dinamike
Proizvodnja vakcina– kolera, hepatitis B
• subjedinice patogena kao antigeni se unose u npr. kvasac i prečišćavaju
• izazov: unos vakcine preko plodova koji su široko zastupljeni u ishrani
– kancer• ćelije insekata na stupnju
gusenice i bakulovirus
– grip (Flublok) • sa proteinima tri soja virusa,
rekombinovanih sa bakulovirusom
epidemiologija
OSTALO... šire potrebe čoveka... • biogorivo
– GM gljive, mikroalge• efikasno razdvajanje
lignina od celuloze
• predivo– gen za svileni protein pauka
unet u epitelne ćelije mlečnih žlezda koze
– u hirurgiji, zaštitni prsluci, ribarske mreže, optička vlakna
• hortikultura– dodavanje gena i blokada
gena, u sintezi pigmenata
Santori, Florigen
• zaštita sredine– detekcija minskih
ostataka, teških metala
OSTALO...primarna namena i sekundarna upotreba
•zeleni fluorescentni protein•meduza Aequorea victoria
•enzim luciferaza
•svitac, Photinus pyralis
•geni reporteri
koral - Anthozoa, Scleractinia
•Shimomura, Chalfie i Tsien, Nobelova nagrada 2008, hemija
• u medicinskim istraživanjima– praćenje regeneracije tkiva putem
matičnih ćelija, regeneracija neuronskih ćelija, transplantacija
– neurogenetika, optogenetika– imunologija
• biomonitoring– detekcija teških metala i drugih
sastojaka u zemljištu, vodi
osnovna primena GMO sa fluorescentim pigmentom
..izazovi....i komercijalna primena...
GM Abies nordmanniana
GloFish
BioArtBrainbow
kućni ljubimcidekoracijaumetnost
Kloniranje gena, tkiva, organa, organizama
• U jedrima potpuno diferenciranih ćelija mali skup gena se uključuje, a ekspresija ostalih je sprečena– Ova regulacija je uglavnom rezultat epigenetičkih promena u
hromatinu, kao što je acetilacija histona ili metilacija DNK. – Mnoge od ovih promena moraju biti povratne u jedru donora da
bi se geni pravilno eksprimirali ili represirali u ranim stupnjevimarazvića.
– Nadjeno je da DNK ćelija iz kloniranih embriona, kao i kod diferenciranih ćelija često ima više metil grupa nego DNK ekvivalentni molekuli iz nekloniranih iste vrste.
– Pošto DNK metilacija pomaže u regulaciji genske ekspresije, metilisana DNK jedra donora može ometati gensku ekspresiju neophodnu za normalno razviće.
Odavno je moguće klonirati različite vrste sisara upotrebom jedara ili ćelija ranih embriona
• 1997. godina, Edinburg• Doli, jagnje klonirano iz
odrasle ovce, jedarnom transplantacijom iz diferencirane ćelije mlečnih žlezda, koja je fuzionisana sa jajnom ćelijom druge ovce kojoj je uklonjeno jedro.
• Rezultujuće ćelije su se delile i rani embrioni su implantirani u surogat majke. Pri tome je samo jedan od stotine embriona kompletirao razviće
Nastanak prvog kloniranog sisaraneke somatske ćelije održe genetičku informaciju za celokupno razviće, pa ih je moguće koristiti za kloniranje organizma
• Eksperimentalno kloniranje dalo je neke bitne rezultate– Klonirane jedinke iste vrste ne
ponašaju se i ne izgledaju potpuno identično
– Uticaj sredine i slučajni fenomeni se ne mogu zanemariti tokom razvića
– Godine 2003, Dolly je obolela od oboljenja pluća i artritisa, uobičajeno za ostarele jedinke i uginula je što možda ukazuje na nekompletno reprogramiranje transplantiranog jedra.
• Kloniranje u farmaceutske i medicinske svrhe je od značaja u kombinaciji sa transgenim tehnologijama