DAMGO által hyperpolarizált substantia gelatinosa neuronok különbözõ mértékû -opioid-receptor-1 expressziója patkány gerincvelõben m Kozsurek Márk, Puskár Zita , Marosfõi László, Gerber Gábor és Réthelyi Miklós Szentágothai Laboratórium, Anatómiai, Szövet- és Fejlõdéstani Intézet, Semmelweis Egyetem, Budapest A gerincvelõ hátsó szarvában a substantia gelatinosa (SG, lamina II) meghatározó szerepet játszik a fájdalomérzés és - továbbítás spinális szintû folyamataiban. Itt végzõdik a nociceptív C-rostok többsége, és a μ-opioid-receptor (MOR-1 receptor) agonisták, az ópiát fájdalomcsillapítók is elsõsorban itt fejtik ki hatásukat. A II. laminában a MOR-1 receptor ellenes antitest egy olyan sejtcsoportot tesz láthatóvá, amelynek mind a sejttestét, mind a dendritjeit kirajzolják a sejtmembránban sûrûn elhelyezkedõ receptorok. Optikai disszektor eljárással a lamina II teljes neuronpopulációjának kb. 10%-a bizonyul MOR-1 immunoreaktívnak (Spike és munkatársai, 2001). Ugyanakkor in- vitro whole- cell patch-clamp kísérletek szerint a -opioid-receptor szelektív agonista [D-Ala2,N-Me-Phe4,Gly5-ol]-enkephalin (DAMGO) a II. lamina véletlenszerûen kiválsztott sejtjeinek mintegy 50%-ában okoz hyperpolarizációt (Eckert és munkatársai, 2003).Kombinált elektrofiziológiai, farmakológiai ill. immunhisztokémiai technikákkal kíséreltük meg ezt az ellentmondást feloldani. m Anyagok és módszerek: Következtetések: Elektrofiziológia Immunhisztokémia Vizsgálatainkat 20-28 napos Wistar patkányokból származó gerincvelõ-szeleteken végeztük a whole-cell patch-clamp technika alkalmazásával. Az állatokat intraperitonealis urethán injekcióval altattuk el, majd eltávolítottuk a lumbalis gerincvelõ szakaszt. Vibratommal 600-700 μm vastag transzverzális gerincvelõ-szeleteket készítettünk, lehetõség szerint megtartva a belépõ hátsó gyökereket is. A mérõkamrába helyezett szeleteket 33°C-os, oxigenizált (90% O ,5% CO ) mesterséges cerebrospinális folyadékkal (mM-ban: NaCl 128,0; KCl 1,9; KH PO 1,2; MgSO 1,3; NaHCO 26,0; CaCl 2,4; glükóz 10; pH=7,4 ), 4-5 ml/perc sebességgel áramoltattuk át. A 8-15 M ellenállású patch-elektródok feltöltéséhez K-glukonát alapú intracelluláris oldatot használtunk, melyhez a fizilógiailag vizsgált sejtek késõbbi morfológiai elemzése érdekében 0.1% biocytint adtunk. A sejtek kiválasztása vakon vagy vizuális kontroll mellett történt. Az excitatórikus posztszinaptikus potenciálokat (EPSP) a hátsó gyöker szívóelektródás ingerlésével váltottuk ki. A mérésekhez Axoclamp-2A erõsítõt (Axon Instruments), az adatok rögzítéséhez és kiértékeléséhez a pCLAMP 9.0 szoftvert (Axon Instruments) használtuk. Az elektrofiziológiai méréseket követõen a szeleteket 4%-os paraformaldehidbe helyeztük, és 3-5 napon át 4°C-on fixáltuk. Ezt követõen a transzverzális szeleteket 10%-os Agarba ágyaztuk, és a sagittális síkban Vibratommal 50 μm-es metszeteket készítetünk. Alkoholos feltárás után a metszeteket normál szérumos oldatban blokkoltuk. Ezt követõen tengerimalacban termelt -opioid-receptor ellenes, nyúlban termelt protein-kináz C -alegység (PKC ellenes és kecskében termelt nitrogén-monoxid- szintetáz ellenes antitest koktélban egy éjszakán át inkubáltuk, melyet másnap fluoreszcens festékkel konjugált állatspecifikus szekunder antitestelegy követett. Végül a sejtbe jutott biocytint fluoreszcens streptavidinnel tettük láthatóvá. A lefedett metszeteket Bio-Rad Radiance 2100 Rainbow konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk. 2 2 2 4 4 3 2 W m g g) A DAMGO-ra válaszoló, biocytinnel jelölt sejtek morfológiája és MOR-1 receptor expressziója Bevezetés: 2. ábra. A DAMGO-ra hyperpolarizációval válaszoló sejtek közül öt esetében váltottunk ki hátsó gyökér ingerléssel EPSP-t. A regisztrátum minden esetben monoszinaptikus bemenetet igazolt. Egy EPSP-t akkor tekintettünk monoszinaptikusnak, ha a 10Hz-es ingerlés minden egyes impulzusa kiváltotta és a válasz állandó látenciát mutatott. A felsõ sor egyetlen ingerrel kiváltott EPSP-ket mutat. Az alsó sorban sorozatingerléssel kiváltott EPSP-k láthatók. A bal oldali oszlopban egy kis, a középsõben egy közepes, a jobb oldaliban egy nagy hyperpolarizációval válaszoló sejtbõl elvezetett EPSP-k láthatók. A nyílhegyek a hátsó gyökér elektromos ingerlésének idõpontját mutatják. (10Hz) 3. ábra. a): b): c): DAMGO-ra kisfokú hyperpolarizációval válaszoló, sziget (islet) típusú sejt konfokális optikai sorozatmetszetek összevetítésével készült képe. Ugyanazon sejt immunfestett környezetében, sorozatmetszetekbõl összevetítve. A b) kép egyetlen optikai metszetbõl álló kinagyított részlete. ( a sejt axonelágazódásai; MOR-1 receptorok; *: klasszikus MOR-1 immunreaktív neuronok; biocytinnel töltött sejt; PKC ; MOR-1 immunfestés. Mérték: 20 m) nyilak: nyílhegyek: piros: kék: zöld: g m 4. ábra. a): b): c): Közepes mértékû hiperpolarizációval válaszoló, kisantenna típusú sejt és immunfestett környezete konfokális optikai sorozatmetszetek összevetítésével nyert képe. A biocytinnel feltöltött sejt összevetített képe. A sejt axonjának egy darabja egyetlen optikai metszeten, amint szorosan összefekszik PKC immunreaktív dendritekkel. ( a sejt axonja; *: klasszikus MOR-1 immunreaktív neuronok; biocytinnel töltött sejt; PKC ; MOR-1 immunfestés. Mérték: 20 m) g g nyilak: piros: kék: zöld: m 5. ábra. a) : b), c), d): DAMGO-ra nagymértékû hyperpolarizációval válaszoló, biocytinnel feltöltött sziget (islet) tipusú sejt konfokális optikai sorozatmetszetek összevetítésével készült képe. A fentiekhez hasonló immunfestéssel készült gerincvelõszelet különbözõ optikai síkjai. ( a sejt axonja; MOR-1 receptorok; *: klasszikus MOR-1 immunreaktív neuronok; biocytinnel töltött sejt; PKC ; MOR-1 immunfestés. Mérték: 20 m) nyilak: nyílhegyek: piros: kék: zöld: g m Hátsó gyökér ingerléssel kiváltott monoszinaptikus EPSP-k a DAMGO-érzékeny neuronokban DAMGO által kiváltott hyperpolarizáció mértéke a válaszoló SG neuronokban 1. ábra. A grafikon a whole-cell patch-clamp technikával vizsgált 42 SG neuron közül azt a 23-mat tartalmazza, amely DAMGO-ra válaszolt. Az oszlopok az egyes sejtekhez tartozó, DAMGO által kiváltott hyperpolarizáció amplitúdóját mutatják. A grafikon felett egy kis-, egy közepes és egy nagyfokú hyperpolarizációt mutató neuron típusos regisztrátumát tüntettük fel. Ezeket a membránpotenciál- változásokat a piros oszloppal jelölt sejtekben mértük. (DAMGO koncentráció: 1 M, az alkalmazás idõtartama: 1 perc). m 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 050106_cell3 041229_cell4 050103_cell1 041105 cell1 041228_cell3 041203 sl2 cell1 041230_cell4 041229_cell1 041228_cell1 041229_cell2 041229_cell3 041228_cell2 041201 sl1 cell2 050104_cell2 041228_cell4 050107_cell4 041214 sl2 cell1 041201 sl2 cell1 050107_cell3 041230_cell1 050104_cell1 041228_cell5 050103_cell2 Sejt kódja Hyperpolarizáció (mV) DAMGO 2mV 0,5min 50ms 2mV 1. 2. 3. 4. 5. Vizsgálataink szerint - az irodalmi adatokhoz hasonlóan - a substantia gelatinosa elektrofiziológiailag vizsgált neuronjainak 60 %-a válaszolt DAMGO-ra különbözõ mértékû hyperpolarizációval. Minden olyan DAMGO-ra válaszoló sejt, melynél hátsó gyökér ingerléssel EPSP-t lehetett kiváltani, primer afferens bemenettel rendelkezett. A DAMGO-ra hyperpolarizációval válaszoló sejtek változatos morfológiai megjelenést mutattak, közülük csupán kettõ hasonlított a klasszikus MOR-1 sejthez. A lamina II MOR-1 receptorok által jól kirajzolt sávján belül is találtunk DAMGO-ra kismértékben vagy egyátalán nem válaszoló neuronokat, ugyanakkor egyes sejteknél, melyek ezen a rétegen kívüli somával rendelkeztek, nagymértékû hyperpolarizációt mértünk. A sejtek többségén elszórva találtunk csak a MOR-1 antitest által kimutatott receptort. A DAMGO-ra válaszoló sejtek axonjainak többsége PKC struktúrákkal mutatott szoros összefekvéseket. g a c b