OPEN JOURNAL SYSTEMS - repositori.unud.ac.id fileVol. 9, no. 1 Januari 2015 Table of Contents Articles EFEKTIVITAS LUMPUR AKTIF DALAM MENURUNKAN NILAI BOD (Biological Oxygen Demand)

OPEN JOURNAL SYSTEMS

Journal Help

USER

Username

Password

Remember me

Log In

NOTIFICATIONS

View

Subscribe / Unsubscribe

JOURNAL CONTENT

Search

All

Search

Browse

By Issue

By Author

By Title

Other Journals

FONT SIZE

INFORMATION

For Readers

For Authors

For Librarians

HOME ABOUT LOG IN REGISTER SEARCH CURRENT ARCHIVES

Home > Archives > Vol. 9, no. 1 Januari 2015

J o u r n a l o f C h e m i s t r y

Vol. 9, no. 1 Januari 2015 file:///D:/My Documents/publikasi jurnal ilmiah&seminar/sampul.html

1 of 3 2/21/2016 9:46 PM

Vol. 9, no. 1 Januari 2015

Table of Contents

Articles

EFEKTIVITAS LUMPUR AKTIF DALAM MENURUNKAN NILAI BOD (Biological Oxygen Demand) DAN COD

(Chemical Oxygen Demand) PADA LIMBAH CAIR UPT LAB. ANALITIK UNIVERSITAS UDAYANA

PDF

Yudith Rizkia Widyawati, Ida Bagus Putra Manuaba, Ni Gst Ayu Made Dwi Adhi

Suastuti

PIGMEN MERAH DARI JAMUR YANG DIISOLASI DARI TANAH TEMPAT PEMBUANGAN LIMBAH SUSU PDF

I D. K. Sastrawidana, Siti Maryam, I Ketut Sudiana

AKTIVITAS ANTIINFLAMASI EKSTRAK ETER KULIT BATANG TENGGULUN (Prot ium javanicum Burm)

TERHADAP EDEMA PADA TIKUS WISTAR YANG DIINDUKSI DENGAN KARAGENAN

PDF

A. A. Tia Santika Dewi, Ni Made Puspawati, Putu Suarya

IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS SENYAWA FLAVONOID DARI EKSTRAK DAUN TREMBESI (Samanea

saman (Jacq.) Merr) SEBAGAI PENGENDALI JAMUR Fusarium sp. PADA TANAMAN BUAH NAGA

PDF

Putu Sariningsih, Wiwik Susanah Rita, Ni Made Puspawati

IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS SENYAWA TANIN DARI EKSTRAK DAUN TREMBESI (Samanea saman

(Jacq.) Merr) SEBAGAI ANTIBAKTERI Escherichia coli (E. coli)

PDF

Putu Puspita Sari, Wiwik Susanah Rita, Ni Made Puspawati

AKTIVITAS ANTIOKSIDAN SENYAWA GOLONGAN FLAVONOID EKSTRAK ETANOL DAGING BUAH TERONG

BELANDA (Solanum betaceum Cav.)

PDF

Ida Ayu Raka Astiti Asih, I Wayan Sudiarta, Ade Ayu Wulan Suci

PERBANDINGAN KUALITAS DNA DENGAN MENGGUNAKAN METODE BOOM ORIGINAL DAN BOOM

MODIFIKASI PADA ISOLAT Mycobacterium tuberculosis 151

PDF

Dewi Andayani Farmawati, I Nengah Wirajana, Sagung Chandra Yowani

UJI TOKSISITAS EKSTRAK DAUN WARU (Hibiscus t iliaceus L.) TERHADAP LARVA Artemia salina Leach

SERTA IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWANYA

PDF

Ni Luh Rustini, Komang Ariati, A. A. Indah Purna Dewi, I Made Dira Swantara

EFEK BERBAGAI MINYAK PADA METABOLISME KOLESTEROL TERHADAP TIKUS WISTAR PDF

Ni Wayan Bogoriani, Ketut Ratnayani

KAPASITAS ANTIOKSIDAN SENYAWA GOLONGAN TRITERPENOID PADA DAUN PRANAJIWA (Euchresta

horsfieldii lesch benn)

PDF

Kadek Ayu Intan Sari, I Wayan Gede Gunawan, Ketut Gede Dharma Putra


2 of 3 2/21/2016 9:46 PM

UJI PEMANFAATAN DAUN SIRSAK (Annona muricata L.) DALAM MENGHAMBAT STRES OKSIDATIF PADA

TIKUS WISTAR HIPERKOLESTEROLEMIA MELALUI PENINGKATAN AKTIVITAS SUPEROXIDE DISMUTASE

PDF

Sri Wahjuni, Sri Rahayu Santi, Ni Nyoman Astuti Wulandari

SKRINING ANTIKANKER MELALUI PENDEKATAN UJI TOKSISITAS TERHADAP LARVA UDANG (Artemia salina

Leach) SERTA IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA AKTIF PADA BUAH PLUM (Prunus domestic a L.)

PDF

Ni Made Susita Pratiwi, I Made Dira Swantara, Ni Luh Rustini

PREPARASI KATALIS NIKEL-ARANG AKTIF UNTUK REAKSI HIDROGENASI ASAM LEMAK TIDAK JENUH

DALAM MINYAK KELAPA

PDF

Imam Rasidi, Anak Agung Bawa Putra, I Wayan Suarsa

EFEKTIVITAS PENURUNAN KADAR SURFAKTAN LINIER ALKIL SULFONAT (LAS) DAN COD DARI LIMBAH

CAIR DOMESTIK DENGAN METODE LUMPUR AKTIF

PDF

Ni G. A. M Dwi Adhi Suastuti, I Nengah Simpen, Nanik Ayumi

PENENTUAN LAJU REAKSI MAKSIMAL (Vmaks) DAN KONSTANTA MICHAELIS-MENTEN (KM) ENZIM LIPASE

PANKREAS PADA SUBSTRAT MINYAK KELAPA, MINYAK SAWIT, DAN MINYAK ZAITUN

PDF

Ketut Ratnayani, A. A. I. A. Mayun Laksmiwati, Maman Sudiarto

PENGOLAHAN LARUTAN DETERJEN DENGAN BIOFILTER TANAMAN KANGKUNGAN (IPOMOEA

CRASSICAULIS) DALAM SISTEM BATCH (CURAH) TERAERASI

PDF

Ni G. A. M Dwi Adhi Suastuti, I Wayan Suarsa, Dwi Kurnia Putra R

ANALISIS FENOL DALAM URIN PEKERJA SALAH SATU STASIUN PENGISIAN BAHAN BAKAR UMUM DI KOTA

DENPASAR

PDF

Abdul Rahim, Ni Made Suaniti, Wiwik Susanah Rita

PEMBUATAN KOMPOSIT ZnO-ARANG AKTIF SEBAGAI FOTOKATALIS UNTUK MENDEGRADASI ZAT WARNA

METILEN BIRU

PDF

Dewa Ayu Wismayanti, Ni Putu Diantariani, Sri Rahayu Santi

ANALISIS PRIMER UNTUK AMPLIFIKASI PROMOTER inhA MULTIDRUG RESISTANCE TUBERCULOSIS

(MDR-TB) DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

PDF

I Gusti Ayu Agung Septiari, Putu Sanna Yustiantara, Sagung Chandra Yowani

FRAKSINASI DAN BIOAVAILABILITAS LOGAM BERAT Fe DAN Mn PADA SEDIMEN DI PELABUHAN BENOA PDF

Emmy Sahara, Ida Ayu Gede Widihati, I Gede Darma Putra

BIOAVAILABILITAS DAN SPESIASI LOGAM BERAT Pb DAN Cd PADA TANAH PERTANIAN BASAH DAN

KERING DI DAERAH DENPASAR

PDF

I Made Siaka, Emmy Sahara, Gusti Agung Putu Merta Dharmayoga


3 of 3 2/21/2016 9:46 PM

ISSN 1907-9850

117

ANALISIS PRIMER UNTUK AMPLIFIKASI PROMOTER inhA MULTIDRUG RESISTANCETUBERCULOSIS (MDR-TB) DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

I Gusti Ayu Agung Septiari 1*, Putu Sanna Yustiantara 1,2, dan Sagung Chandra Yowani 1,2

1Jurusan Farmasi FMIPA Universitas Udayana, Bukit Jimbaran, Bali2Kelompok Studi MDR-TB & XDR-TB, FMIPA, Universitas Udayana, Bukit Jimbaran, Bali

*Email : [email protected]

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis beberapa pasangan primer dalam mengamplifikasi daerahpromoter inhA secara in silico dan in vitro. Analisis primer secara in silico dilakukan menggunakan program CloneManger Suite 6. Sekuen DNA templat yang digunakan dalam analisis primer diunduh dari situswww.ncbi.nlm.nih.gov dengan kode genbank : U66801.1 yang merupakan sekuens DNA gen fabG M. tuberculosisH37Rv. Deteksi primer secara in vitro dilakukan dengan teknik PCR menggunakan isolat P16 dan 86 M. tuberculosisMDR sebagai templat. Proses amplifikasi dilakukan dengan kondisi sebagai berikut: denaturasi awal pada suhu 95°Cselama 15 menit , amplifikasi sebanyak 45 siklus (denaturasi pada suhu 94°C selama 1 menit, annealing pada suhu55°C selama 1 menit 20 detik dan ekstensi pada suhu 72°C selama 1 menit 10 detik) serta ekstensi akhir pada suhu72°C selama 10 menit. Selanjutnya, deteksi produk PCR dilakukan dengan gel elektroforesis 1,5%. Kesimpulan yangdiperoleh dari penelitian ini adalah, diperoleh pasangan primer forward (mabA-inhA-promoter-FS) dengan urutansekuen 5’-ACATACCTGCTGCGCAAT-3’ (18 nukleotida) dan primer reverse (mabA-inhA-promoter-R) denganurutan sekuens 5’-CTCCGGTAACCAGGACTGAA-3’ (20 nukleotida) (Chen et al., 2011) yang memenuhi kriteriapasangan primer yang baik dilihat dari panjang primer, nilai Tm, %GC, stabilitas, jumlah hairpins, dimers dan runs.Dari deteksi secara in vitro sepasang primer tersebut juga telah mampu mengamplifikasi daerah promoter inhAsebesar 284 pb.

Kata kunci : Analisis primer, PCR, promoter inhA, M. tuberculosis, in silico, in vitro, Clone Manager Suite 6

ABSTRACT

The aim of this study was to analyze several primary combinations for amplifying inhA promoter region byin silico and in vitro ways. Primary in silico’s analysis was done by Clone Manager Suite 6 program. fabG genesequence of M. tuberculosis was downloaded from www.ncbi.nlm.nih.gov (genbank: U66801.1) and used as DNAtemplate. In vitro detection was done by PCR technique using P16 and 86 M. tuberculosis MDR isolates as DNAtemplate. Amplification was done in described conditions: predenaturation at 95°C for 15 minutes, 45 cycle ofamplication (denaturation on 94°C for 1 minute, annealing on 54°C for 1 minute 20 seconds dan extension on 72°Cfor 1 minute 10 seconds) and also post extension on 72°C for 10 minutes. PCR product was detected by agarose gelelektroforesis (1,5%). In conclusion, combination of primary forward (mabA-inhA-promoter-FS) 5’-ACATACCTGCTGCGCAAT-3’ (18 nucleotide) and primary reverse (mabA-inhA-promoter-R) 5’-CTCCGGTAACCAGGACTGAA-3’ (20 nucleotide) (Chen et al., 2011) have met the good criteria of primarycombination which was seen from several aspects such as: primary length, Tm value, %GC, stability, number ofhairpins, dimers and runs. In vitro detection showed that the primary combination also amplified inhA promoterregion with the length of 284 pb.

Keywords : Primer analysis, PCR, inhA promoter region, M. tuberculosis, in silico, in vitro, Clone Manager Suite 6

JURNAL KIMIA 9 (1), JANUARI 2015: 117-123

118

PENDAHULUAN

Salah satu masalah kesehatan utama yangmasih dihadapi dunia adalah penyakit tuberkulosis(TB). TB merupakan penyakit infeksi dengantingkat mortalitas yang tinggi. Berdasarkan laporanWorld Health Organization (WHO), pada tahun2011 terjadi 1,4 juta kematian karena TB diseluruh dunia (WHO, 2012).

Usaha dalam menurunkan angka kejadianTB menghadapi tantangan baru dengan munculnyafenomena Multi Drug Resistance-Tuberculosis(MDR-TB). MDR-TB merupakan TB yangdisebabkan oleh bakteri yang resisten terhadapsetidaknya isoniazid (INH) dan rifampisin (RIF)(WHO, 2012). Isoniazid (INH) merupakan OATlini pertama yang termasuk dalam regimen standarpengobatan TB (Dipiro et al., 2008). Terdapatbeberapa penelitian sebelumnya yang telahmendeteksi adanya mutasi pada daerah promoterinhA penyebab resistensi terhadap INH denganteknik PCR.

Salah satu komponen yang berperanpenting dalam proses PCR adalah primer (Innisdan Gelfand, 1990). Primer akan membatasifragmen DNA target yang akan diamplifikasi(Handoyo dan Ari, 2001). Sebelum digunakandalam proses amplifikasi, perlu diperhatikanbeberapa hal sehingga suatu primer dapatmenempel secara efisien dan spesifik padafragmen DNA target yang nantinya akanberpengaruh terhadap keberhasilan proses PCR.Pertimbangan tersebut meliputi, panjang primer,%GC, Tm, dimer pada ujung 3’, stabilitas, jumlahruns, repeats, hairpins dan false priming (Bartlettdan Stirling, 2003; Borah, 2011). Perkembanganilmu bioinformatika memungkinkan dilakukannyadesain dan analisis primer. Penggunaan softwaremerupakan salah satu hal yang identik denganbioinformatika. Penggunaan software hanyamerupakan suatu proses analisis secara in silicoyang perlu diikuti dengan deteksi secara in vitrountuk mengukuhkan kemampuan suatu primerdalam menghasilkan produk melalui proses PCRdan visualisasi dengan gel elektroforesis.Penelitian ini menjadi bagian dari proses untukmendeteksi adanya mutasi pada daerah promoterinhA. Tujuan khusus dari penelitian ini adalahuntuk menganalisis kombinasi pasangan primer

yang digunakan dalam proses PCR untukmengamplifikasi daerah promoter inhA.

MATERI DAN METODE

Gen fabG (mabA) M. tuberculosis H37RvGen mabA (fabG) M. tuberculosis H37Rv

digunakan sebagai templat untuk menganalisapasangan primer (kode genbank U66801.1) yangdapat diunduh pada situs www.ncbi.nlm.nih.gov.

PrimerTerdapat beberapa pasangan primer yang

diperoleh dari penelitian-penelitian sebelumnyayang selanjutnya akan dianalisis secara in silicomenggunakan program Clone Manager Suite 6(University of Groningen).

Software dalam Analisis PrimerPada penelitian ini dilakukan analisis

primer secara in silico dengan menggunakansoftware Clone Manager Suite 6 (University ofGroningen).

Cara KerjaProsedur Kerja Software Clone Manager Suite 6(University of Groningen)

Untuk melakukan analisis pasanganprimer, langkah-langkah yang dilakukan adalahmengunduh sekuens gen mabA (fabG) pada situswww.ncbi.nlm.nih.gov kemudian sekuens tersebutdi-copy. Langkah selanjutnya adalah memasukkansekuens gen mabA (fabG) dengan cara membukaprogram Clone Manager Suite 6. Pada menu bar,dipilih menu File klik New kemudian akan munculkotak Create New Molecule Wizard, ditandaibagian Paste Sequence. Kemudian pada menu bardipilih menu Primer, diklik submenu Direct Entrymasukkan urutan nukleotida primer forward danprimer reverse. Setelah memasukkan urutansekuens masing-masing primer selanjutnya dikliktoolbar Link to Molecule untuk mengetahui daerahpenempelan primer pada sekuens gen mabA(fabG). Untuk memperoleh hasil analisis pasanganprimer tersebut, pilih kembali menu Primer, dikliksubmenu Analyze dan Analyze Mix Wizard.

ISSN 1907-9850

119

Amplifikasi Daerah Promoter inhA denganTeknik PCR

DNA templat yang digunakan untukamplifikasi berasal dari DNA kromosomal yangdiisolasi dari isolat P16 dan 86 M. tuberculosisMulti Drug Resistance. Kondisi PCR yangdiaplikasikan adalah, denaturasi awal pada suhu95°C selama 15 menit , amplifikasi sebanyak 45siklus (denaturasi pada suhu 94°C selama 1 menit,annealing pada suhu 55°C selama 1 menit 20 detikdan ekstensi pada suhu 72°C selama 1 menit 10detik) serta ekstensi akhir pada suhu 72°C selama10 menit.Deteksi Produk PCR

Produk PCR dideteksi dengan teknikelektroforesis gel agarosa 1,5% b/v.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Data sekuens gen mabA (fabG) M.tuberculosis H37Rv yang diperoleh dari database

NCBI pada URL http://www.ncbi.nlm.nih.govdengan kode genbank : U66801.1 dimasukkan kedalam program Clone Manager Suite 6. Setelah itudimasukkan beberapa sekuens primer yang akandibandingkan dari hasil penelusuran pustaka(Morlock et al., 2003; Leung et al.,2006; Chen etal., 2011). Kemudian dilakukan analisis terhadapbeberapa pasangan primer tersebut. Analisis hasilperbandingan dari beberapa primer dapat dilihatpada Tabel 1. Primer yang relatif paling memenuhikriteria dilihat dari panjang primer, nilai Tm,%GC, stabilitas, jumlah hairpins, dimers dan runsadalah primer forward (mabA-inhA-promoter-FS)dengan urutan sekuen 5’-ACATACCTGCTGCGCAAT-3’ (18 nukleotida) dan primer reverse(mabA-inhA-promoter-R) dengan urutan sekuens5’-CTCCGGTAACCAGGACTGAA-3’ (20 nuk-leotida) (Chen et al., 2011).

Tabel 1. Analisis Perbandingan Primer dengan Program Clone Manager Suite 6 (University of Groningen)

Keterangan:Primer 1*: Forward (mabA-inhA-promoter-FS): 5’-ACATACCTGCTGCGCAAT-3’

Reverse (mabA-inhA-promoter-R): 5’-CTCCGGTAACCAGGACTGAA-3’Primer 2*: Forward (inhA-1): 5’-CCTCGCTGCCCAGAAAGGGA-3’

Reverse (inhA-2): 5’-ATCCCCCGGTTTCCTCCGGT-3’Primer 3*: Forward (MabA-115F): 5’-ACAAACGTCACGAGCGTAACC-3’

Reverse (MabA+336R): 5’-GTTGGCGTTGATGACCTTCTC -3’

KriteriaPrimer 1* Primer 2* Primer 3* Acuan

CloneManagerSuite 6

Forward Reverse Forward Reverse Forward Reverse

Panjang Primer (pb) 18 20 20 20 21 21 Tidak adaPersen GC (%GC) 50 55 65 65 52 52 50-60Tm (°C) 61 62 68 69 65 63 55-80Dimer pada ujung 3’ 2 1 2 0 1 2 < 3Stabilitas (kcals) 1,5 2,2 1 0,4 2 2,7 ≥ 1,2Runs 2 2 3 5 3 2 < 3Repeats 2 Tidak ada Tidak ada 2 Tidak ada 2 <3Hairpins Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak adaFalse Priming (°C) Tidak ada Tidak ada Tidak ada 17 Tidak ada Tidak ada Tidak adaPustaka (Chen et al., 2011) (Morlock et al., 2003) (Leung et al., 2006)


120

Hal ini terlihat pada Gambar 1 danGambar 2.

Gambar 1. Hasil Analisis Sekuens PasanganPrimer pada Program Clone ManagerSuite 6

Gambar 2. Hasil Analisis Kriteria PasanganPrimer pada Program Clone ManagerSuite 6

Dari hasil analisis yang telah dilakukanterlihat bahwa kedua primer telah memenuhikriteria primer yang baik dilihat dari panjangprimer seperti hasil yang ditunjukkan pada Gambar1. Dimana secara berturut-turut primer forward(mabA-inhA-promoter-FS) dan primer reverse

(mabA-inhA-promoter-R) memiliki panjang 18dan 20 nukleotida.

Menurut Innis dan Gelfand (1990), primeryang baik tersusun atas 18-28 nukleotida. Panjangminimal suatu primer adalah 18 nukleotida, jikalebih pendek akan mengakibatkan berkurangnyaspesifisitas primer. Pada primer dengan ukuranyang pendek akan memungkinkan terjadinyamispriming (penempelan primer pada tempat lainyang tidak diinginkan) yang tinggi. Hal ini akanmempengaruhi efektifitas dan efisiensi prosesPCR. Sedangkan, primer dengan panjang lebih dari30 nukleotida tidak akan meningkatkan spesifisitasprimer secara bermakna (Handoyo dan Ari, 2000).

Gambar 2 menunjukkan bahwa primermabA-inhA-promoter-FS (forward) dan mabA-inhA-promoter-R (reverse) masing-masingmemiliki nilai %GC 50% dan 55% dengan nilaimelting temperature (Tm) masing-masing 61°C dan62°C. Besarnya %GC suatu primer akanmempengaruhi nilai Tm dan Ta primer tersebut.Primer dengan panjang 18-28 nukleotidaseharusnya memiliki %GC antara 50-60 % (Innisdan Gelfand, 1990).

Primer dengan nilai %GC yang tinggi akanmemiliki nilai Tm yang tinggi pula karena terdapatlebih banyak ikatan hidrogen di dalamnya (3ikatan hidrogen). Terdapat hubungan yang linearantara nilai %GC dengan nilai Tm dan Ta primer(Chen dan Janes, 2002). Pada kedua primertersebut terdapat perbedaan nilai Tm sebesar 1°C,nilai ini masih dapat diterima didasarkan padapenelitian Barlett dan Stirling (2003) yangmenyatakan nilai perbedaan Tm di antara duaprimer yang diperbolehkan adalah 2-5 °C. Hal iniakan menjamin diperolehnya nilai Ta yang tepatuntuk kedua primer (Bartlett dan Stirling, 2003).

Nilai Tm yang terlalu tinggi akanmengakibatkan terjadinya hibridisasi yang tidakadekuat antara primer dan templat dimana akanterbentuk ikatan yang terlalu kuat antara primerdengan DNA target sehingga produk PCR yangdihasilkan rendah namun lebih spesifik. Sedangkannilai Tm yang terlalu rendah akan menyebabkanterbentuknya produk yang tidak spesifik karenatingginya penempelan primer pada daerah yangtidak tepat (mismatches) (Lee et al., 1997; Borah,2011). Menurut Burden dan Whitney (1995) untukprimer dengan panjang 18-22 nukleotida dan %GC45-55°C umumnya memiliki rentang nilai Tm 55-

ISSN 1907-9850

121

80 °C. Sehingga dapat disimpulkan bahwa primeryang akan digunakan telah memenuhi kriteria%GC dan Tm yang baik.

Dimers yang terjadi pada ujung 3’ harusdihindari karena akan menyebabkan terjadinyapemanjangan primer PCR dengan menggunakanprimer kedua sebagai templat yang nantinyamembentuk struktur sekunder yang disebut denganprimer-dimers. Hal ini akan mengakibatkan primerkehilangan fungsinya sehingga amplikon yangdihasilkan akan berkurang jumlahnya (CloneManager Suite 6). Dari hasil analisis in silico nilaidimers masing-masing primer telah memenuhikriteria primer yang baik.

Kriteria lain yang harus dipenuhi olehprimer adalah dalam hal stabilitas. Parameter iniberkaitan dengan perbedaan nilai stabilitas antaraujung 5’ dan 3’ primer. Afinitas maksimal primerterhadap templatnya terdapat pada ujung 5’ primer.Karenanya, ujung 3’ primer hanya perlu berikatansecukupnya sehingga DNA polimerase dapatmemulai replikasi.

Namun, jika ujung 3’ primer mempunyaistabilitas termal yang tinggi, hal tersebut akanmengakibatkan terjadinya penempelan ujung 3’primer pada templat dan selanjutnya memulaireplikasi, walaupun ujung 5’ tidak cocok. Hal iniakan menyebabkan penurunan spesifisitashibridisasi. Sehingga nilai stabilitas ujung 5’ haruslebih besar dibandingkan ujung 3’ (Clone ManagerSuite 6). Dari hasil analisis in silico terhadapprimer mabA-inhA-promoter-FS dan mabA-inhA-promoter-R dengan nilai stabilitas masing-masingsebesar 1,5 kcals dan 2,2 kcals. Sehingga dapatdisimpulkan bahwa kedua primer tersebut telahmemenuhi kriteria stabilitas yang ditetapkan.

Hasil analisis terhadap kualitas masing-masing primer secara terpisah ditunjukkan padaGambar 3 dan 4.

Gambar 3 dan 4 secara terpisahmenunjukkan bahwa primer forward dan reversetersebut telah memenuhi kriteria runs, repeats danhairpins sesuai yang dipersyaratkan programClone Manager Suite 6 (University of Groningen)Runs, repeats dan hairpins merupakan struktursekunder yang terbentuk akibat adanya interaksiintramolekular dan intermolekular. Struktursekunder yang terbentuk ini akan mengurangiketersediaan primer untuk berinteraksi dengan

templat target. Jumlah maksimal runs dan repeatsyang diperbolehkan adalah 4 pb (Borah, 2011).

Gambar 3. Hasil Analisis Kualitas PrimerForward pada Program Clone ManagerSuite 6

Gambar 4. Hasil Analisis Kualitas Primer Reversepada Program Clone Manager Suite 6

Kemudian dilakukan simulasi padasepasang primer tersebut secara in silico denganmenggunakan analyze mix wizard denganmenggunakan gen fabG (mabA) M. tuberculosissebagai DNA templat. Hasil analisis yangdiperoleh terdapat pada Gambar 5.

Hasil analisis tersebut menunjukkanbahwa produk PCR (amplikon) yang akandihasilkan memiliki ukuran 284 pb yang terletak


122

pada posisi nukleotida 7 sampai dengan 290.Berdasarkan studi pustaka dan acuan kriteria dariClone Manager Suite 6, diperoleh kesimpulanbahwa secara keseluruhan primer yang akandigunakan telah memenuhi kriteria primer yangbaik dan daerah target yang diharapkan.

Gambar 5. Hasil Analisis Sepasang Primer dengangen fabG (mabA) sebagai DNA templat

Keterangan :Marker DNA ladder 100 pb (M);isolat P16 (P16); isolat 86 (86).

Gambar 6. Elektroforegram amplifikasi fragmenpromoter inhA isolat P16 dan 86 padasuhu annealing 54°C

Selain analisis in silico, dilakukan jugadeteksi secara in vitro terhadap pasangan primertersebut melalui proses PCR dan deteksi produkPCR dengan teknik elektroforesis gel agarosa1,5%. Kondisi PCR yang diaplikasikan adalah,denaturasi awal pada suhu 95°C selama 15 menit ,amplifikasi sebanyak 45 siklus (denaturasi padasuhu 94°C selama 1 menit, annealing pada suhu55°C selama 1 menit 20 detik dan ekstensi padasuhu 72°C selama 1 menit 10 detik) serta ekstensiakhir pada suhu 72°C selama 10 menit. DNAtemplat yang digunakan berasal dari DNAkromosomal yang diisolasi dari isolat P16 dan 86M. tuberculosis Multi Drug Resistance. Hasil yangdiperoleh berupa elektroforegram yangdiperlihatkan pada Gambar 6.

Hasil elektroforegram pada Gambar 6menunjukkan bahwa primer mabA-inhA-promoter-FS (forward) dan mabA-inhA-promoter-R (reverse) telah berhasil mengamplifikasi daerahpromoter inhA dengan ukuran produk 284 pbsesuai dengan hasil analisis secara in silico.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan1. Primer mabA-inhA-promoter-FS (forward)

dengan urutan nukleotida 5’-ACATACCTGCTGCGCAAT-3’ dan primer mabA-inhA-promoter-R (reverse) 5’- CTCCGGTAACCAGGACTGAA-3’ (Chen et al., 2011)memenuhi kriteria primer yang baik dilihatdari panjang primer, %GC, Tm, dimer padaujung 3’, stabilitas, jumlah runs, repeats,hairpins dan false priming.

2. Pasangan primer berhasil mengamplifikasidaerah promoter inhA dan menghasilkanproduk PCR (amplikon) dengan ukuran 284 pbsesuai dengan hasil analisis secara in silicopada program Clone Manager Suite 6.

SaranPerlu dilakukan analisis lebih lanjut

terhadap produk PCR (amplikon) dengan tekniksekuensing untuk mengetahui urutan nukleotidaamplikon.

ISSN 1907-9850

123

UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis mengucapkan terimakasih kepadasemua pihak yang telah membantu sehinggapenelitian ini dapat terlaksana dengan baik.

DAFTAR PUSTAKA

Bartlett, J. M. S. dan Stirling, D., 2003, Methods inMolecular Biology, Vol. 226 : PCRProtocols 2nd Editions, Human Press Inc.,Totowa, NJ, p. 81-604

Borah, P., 2011, Primer Designing for PCR,Science Vision, 11 (3) : 134-136

Burden, D.W. dan Whitney, D.B., 1995,Biotechnology Proteins to PCR: Proteinsto PCR : A Course in Strategies and LabTechnique, Birkhauser, USA, p. 304

Chen, B.Y. dan Janes, H. W. 2002. Methods inMolecular Biology Vol. 192: PCR CloningProtocols 2nd Edition, Humana Press Inc.,Totowa, NJ, p. 19-21

Chen, X., Kong, F., Wang, Q., Li, C., Zhang, J.,dan Gilbert, G.L., 2011, Rapid Detectionof Isoniazid, Rifampin, and OfloxacinResistance in Mycobacterium tuberculosisClinical Isolates Using High-ResolutionMelting Analysis, Journal of ClinicalMicrobiology, 49 (10) : 3450–3457

Dipiro J.T., Talbert, R.T., Yee, G.C., Matzke,G.R., Wells, B.G., dan Posey, L.M.Michael P., 2008, Pharmacotherapy: APathophysiologic Approach, 7th Edition,The McGraw Hill Companies Inc., UnitedStates of America, p. 1839-1854

Handoyo, D. dan Ari, R., 2000, Prinsip Umum danPelaksanaan Polymerase Chain Reaction(PCR), Unitas, 9 (1) : 17-29

Innis, M.A. dan Gelfand, D.H., 1990, PCRProtocols: A Guide to Methods andApplications, Academic Press Inc.,London, UK, p. 3-11

Lee, H. H., Morse, S.A., and Olsvik, Ø., 1997,Nucleic Acid Amplification Technologies:Application to Disease Diagnosis, EatonPublishing, USA

Leung, E. T. Y., Ho, P. L., Yuen, K. Y., Woo, W.L., Lam, T. H., Kao, R. Y., Seto, W. H danYam, W. C., 2006, MolecularCharacterization of Isoniazid Resistance inMycobacterium tuberculosis: Identifica-tion of a Novel Mutation in inhA, Journalof Clinical Microbiology, 50 (3) : 1075-1078

Machado, D., Perdigao, J., Ramos, J., Couto, I.,Portugal, I., Ritter, C., Boettger E.C., danViveiros, M., 2013, High-level Resistanceto Isoniazid and Ethionamide inMultidrug-resistant Mycobacteriumtuberculosis of the Lisboa Family isAssociated with inhA Double Mutations,Journal of Clinical Microbiology, p. 1-5

Morlock, G.P., Metchock, B., Sikes, D., Crawford,J.T., and Cooksey, R.C., 2003, ethA,inhA, and katG Loci of Ethionamide-Resistant Clinical Mycobacteriumtuberculosis Isolates, Journal of ClinicalMicrobiology, 47 (12) : 3799-3805

World Health Organization, 2012, GlobalTuberculosis Report 2012, World HealthOrganization, Geneva, Switzerland, p. 1-66