1 Übungen zur Wasser- und Lebensmittelqualität JULI 2019 Verhalten im Labor • Rauch-, Ess- und Trinkverbot • Äußerste Sauberkeit und Ordnung im Raum und am Arbeitsplatz • Nach Beendigung der Arbeit Hände desinfizieren • Schutzkleidung (weißer Arbeitsmantel) • Arbeitsfläche nach Beendigung der Arbeit desinfizieren • Nicht mit dem Mund pipettieren.
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Übungen zur Wasser- und Lebensmittelqualität• Die Katalaseaktivität einer Kultur läßt sich einfach prüfen, indem man sie direkt oder nach Übertragung einer kleinen Menge Koloniemasse
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Übungen zur Wasser- und Lebensmittelqualität
JULI 2019
Verhalten im Labor
• Rauch-, Ess- und Trinkverbot
• Äußerste Sauberkeit und Ordnung im Raum und am
Arbeitsplatz
• Nach Beendigung der Arbeit Hände desinfizieren
• Schutzkleidung (weißer Arbeitsmantel)
• Arbeitsfläche nach Beendigung der Arbeit desinfizieren
• Nicht mit dem Mund pipettieren.
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• Bunsenbrenner nicht unbeaufsichtigt lassen (nur bei Bedarf
anzünden). Bei Gasgeruch sofort Gaszufuhr abdrehen.
• Lange Haare nicht offen tragen (Haare zusammenbinden!
Kontaminations- und Verletzungsgefahr)
• Sachgemäße Entsorgung der kontaminierten Gegenstände
ENTSORGUNG !
OBJEKTTRÄGER/AMPULLEN
(Agarplatten, Plastikpipette, Handschuhe) KEIN GLAS
Papier
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DRIGALSKISPATEL
ÖSEVERDÜNNUNGSMEDIUM
PASTEUR PIPETTE
TUPFER
BAKTERIOLOGISCHE WASSERUNTERSUCHUNG
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WASSERUNTERSUCHUNG
1.1. Qualitative Untersuchung auf das Vorhandensein von coliformen Bakterien und E.
coli in einer Probenmenge von 100 ml Wasser: Ansatz eines Presence-Absence-Tests mit
Readycult Coliforms
1.2. Qualitative Untersuchung auf das Vorhandensein von Enterokokken in einer
Probenmenge von 100 ml Wasser: Ansatz eines Presence-Absence-Tests mit Readycult
Coliforms
1.3. Quantitative Untersuchung auf das Vorhandensein von E.coli and Coliformen
Bakterien in einer Probenmenge von 100 ml Wasser (Membranfiltration) mit CC Agar
1.4.Quantitative Untersuchung auf das Vorhandensein von Enterokokken in einer
Probenmenge von 100 ml Wasser (Membranfiltration) mit Kanamycin-Äsculin-Azid-Agar
1.5.Quantitative Untersuchung auf das Vorhandensein von P. aeruginosa in einer Probenmenge
von 100 ml Wasser (Membranfiltration) mit PSM-Agar
Qualitative Methode
Presence-Absence-Test
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Presence-Absence mit Readycult Coliforms
• Ein Blister von Readycult in 100 ml Wasserprobe geben, 37°C/1d
• Beurteilung von Blaufärbung und Fluoreszenz: wenn positiv, weitere Bestätigung
• ↓
• CCA, frakt. Ausstrich, 37°C/1d
• blaue - violette Kolonien: E. coli, Indol-positiv, Cytochromoxidase-negativ → API
10E
• rosa - rote Kolonien:coliforme Bakterien, Cytochromoxidase-negativ → API 10E
• Angabe der Ergebnisse:
• Coliforme Bakterien/100 ml (nachweisbar/nicht nachweisbar) ......................
• E. coli/100 ml (nachweisbar/nicht nachweisbar) ............................................
1. ÖSE
Der Primärstrich wird durch Sekundärstriche verdünnt, diese
wieder durch Tertiärstriche.
2. ÖSE
3. ÖSE
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Readycult
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Presence-Absence mit Readycult Enterokokken
• Ein Blister von Readycult in 100 ml Wasserprobe geben, 44°C/1d
• Beurteilung von Blaufärbung: wenn positiv, Frakt. Ausstrich auf KANA
• ↓
• Schwarze Kolonien weisen auf die Enterokokken hin, weitere Bestätigung mit Katalase-Test
• Kanamycin-Äsculin-Azid-Agar: Kanamycin und Azid hemmen die Begleitflora, Äsculin wird von Enterokokken (ß-Glucosidase) zu Äsculetin hydrolysiert, welches mit Fe3+ einen schwarzen Komplex bildet.
• Readycult Enterokokken: 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-ß-D-Glucopyranosid wird durch das Enzym ß-D-Glucosidase abgespalten. Der Farbumschlag der Bouillon nach blau weisen auf die Enterokokken hin.
Quantitative Methode
Membranfiltration
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Quantitative Untersuchung einer Wasserprobe (Membranfilterverfahren)
Das Membranfilterverfahren ist eine Methode zur mechanischen Anreicherung von
Mikroorganismen aus einer beliebigen Menge eines filtrierbaren Untersuchungsmaterials. Dies
erlaubt selbst bei minimalem Keimgehalt eine exakte Keimzahlbestimmung.
MEMBRANFILTERVERFAHREN
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Trichter mit Alkohol befeuchten/
Abflammen (nicht in dieser Übungen)
mit sterilem Wasser befeuchten
sterilen Filter entnehmen und auflegen
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Wasserprobe filtrieren
Filter ablösen und auf Agar legen
MEMBRANFILTRATION
E.COLI/COLIFORMEN
• je 100 ml Wasser werden durch Membranfilter (0,45 µm) filtriert
• ↓
• CCA, 37°C/1d
• ↓
• blau-violette Kolonien weisen auf die E. coli hin
• rote Kolonien weisen auf die Coliformen hin
• ↓
• Oxidase Test
• Angabe der Ergebnisse: Coliforme / E.coli ....................
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MEMBRANFILTRATION
ENTEROKOKKEN
• je 100 ml Wasser werden durch Membranfilter (0,45 µm) filtriert
↓
• Agar:Bile-Äsculin-Azid (KANA), 44°C/1d.
• Schwarze Kolonien die Katalase-negativ sind Enterokokken
• Angabe der Ergebnisse: Enterokokken pro 100 ml
Wasser:……………………………………
MEMBRANFILTRATION
PSEUDOMONAS AERUGINOSA
• je 100 ml Wasser werden durch Membranfilter (0,45 µm)
filtriert
↓
• Agar: PSM, 44°C/1d GRÜNE KOLONIEN
• Angabe der Ergebnisse:
• PSEUDOMONAS AERUGINOSA pro 100 ml Wasser:……………………………………
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MIKROBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNG EINER
LEBENSMITTELPROBE
STOMACHER
VORTEXER
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DRIGALSKISPATEL
ÖSE
VERDÜNNUNGSMEDIUM
TUPFER
90 ml RV
90 ml Peptonwasser
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Verdünnungsreihe
• Verdünnungsreihen müssen angelegt werden, um bei der
späteren Kultivierung auswertbare Koloniezahlen auf dem
Agar zu erhalten. In der Praxis ist die dezimale Verdünnung
am gebräuchlichsten.
• Aus der zuvor hergestellten Verdünnungsreihe werden genau
abgemessene Mengen zur Anzüchtung von Mikroorganismen
verwendet. Üblicherweise werden Plattenguß- und
Oberflächenverfahren verwendet.
• Zum Anlegen einer Verdünnungsreihe wird die Originalprobe
(Verdünnungsstufe 0) 1:10 verdünnt (z.B. 10 g auf 100 ml mit
• 1 ml einer Verdünnungsstufe wird mit einer sterilen Pipette
in eine leere, sterile Petrischale eingebracht.
• Dazu gibt man ca. 10-15 ml verflüssigten und ca. 40°C
warmen Agar (z. B. PCA). Diese beiden Lösungen werden
durch kreisende Bewegungen (in Form einer 8) verteilt.
• Die verschlossene Petrischale bleibt bis zum Erstarren des
Nährbodens stehen und wird anschließend mit dem Deckel
nach unten bebrütet.
Plattengussverfahren
• 0,1 ml einer Verdünnungsstufe wird mit einer sterilen
Pipette auf eine fertig gegossene Agarplatte
aufgebracht.
• Der Tropfen wird mit einem sterilen gebogenen Glasstab
(Drigalski-Spatel) gleichmäßig auf der Platte verteilt.
• Die Petrischale wird mit dem Deckel verschlossen.
• Erst wenn der Ausstrich getrocknet ist, wird die Schale
mit dem Deckel nach unten bebrütet.
Oberflächenspatelverfahren
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Plattengussverfahren
Oberflächenspatelverfahren
QUANTITATIVE UNTERSUCHUNG
HOMOGENISAT: 10 G PROBE MIT 90 ML GEPUFFERTER PEPTONLÖSUNG HOMOGENISIEREN= HH= VERDÜNNUNG 1:10 = STUFE –1,VERDÜNNUNGSREIHE: -1, -2, -3, -4, -5
B. cereus: Oberflächenspatelverfahren, BC Stufen: -1, -2, -3, -4, -5E. coli, Coliforme: Oberflächenspatelverfahren, CCA, Stufen: -1, -2, -3, -4, -5Enterokokken: Oberflächenspatelverfahren, KANA Stufen: -1, -2, -3, -4, -5Hefen und Schimmelpilze: Oberflächenspatelverfahren,YGC Stufen: -1, -2, -3, -4, -5Staphylococcus aureus: Oberflächenspatelverfahren, BP Stufen: -1, -2, -3, -4, -5
YGC-Agar: Chloramphenicol unterdrückt die bakterielle Begleitflora.Baird-Parker-Agar: Tellurit und Lithiumchlorid hemmen die Begleitflora. Eigelb wird durch Lipolyse und Proteolyse abgebaut (Bildung eines Doppelhofes),Tellurit wird zu Tellur reduziert, es kommt zur Schwarzfärbung.Verdächtige Kolonien werden durch positiven Katalase-Test und durch positiven Koagulase-Test(Latex-Agglutinationstest) bestätigt.
• Verschiedene Oberflächen (Arbeitsplatz, Sterilbank, etc.)
werden mittels Rodac-Platten oder Eintauchobjektträger
abgeklatscht.
• Inkubation: 37°C/1d
• Auszählen der KBE/ml: ..........................................
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3.2. LUFT
• IMPAKTION-VERFAHREN:
• Die zu untersuchende Luft wird mittels eines Zentrifugalsammlers angesaugt und durch einen Spalt auf einen im Inneren des Gerätes befindlichen Nährbodenstreifen aufgeschleudert. Luftkeimsammler, Abscheidevolumen 40 l/min
• Nährbodenstreifen in den Zentrifugalsammler einlegen• ↓• Zentrifugalsammler 1 min betreiben• ↓• Nährbodenstreifen entnehmen und inkubieren: 37°C, 1d• ↓• Ergebnis: KBE/m3 = KBE x 1000:40 =...........................
3.3. ANLEGEN EINES ANTIBIOGRAMMS
0,1 ml einer Keimsuspension auf einer Agarplatte gleichmäßig mit einem Glasspatel verteilen und trocknen lassen. Mittels eines Dispensers werden die Antibiotikablättchen auf die Agaroberfläche aufgebracht. Inkubation: 37°C, 1 d
• Man erhält eine relativ scharf begrenzte Hämolysezoneum die Kolonien, die Erythrozyten sind aufgelöst, und der Blutfarbstoff ist abgebaut, sodaß eine klare Zone im sonst undurchsichtigen Blutagar entsteht (ß-Hämolyse).
Hämolyse
• Um die Kolonien findet man grüne Höfe von
unterschiedlicher Farbintensität, in deren Bereich der