ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THỊ VÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA DO Xanthomonas oryzae LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014
25
Embed
NGUYỄN THỊ VÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG XẠ KHUẨN (345).pdf · diện rộng dẫn đến tình trạng các chủng Xoo có khả năng gây bệnh
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
NGUYỄN THỊ VÂN
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG XẠ KHUẨN
Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA DO
Xanthomonas oryzae
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2014
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------
NGUYỄN THỊ VÂN
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG XẠ KHUẨN
Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA DO
Xanthomonas oryzae
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Dương Văn Hợp
TS. Phạm Thế Hải
Hà Nội - 2014
1
MỞ ĐẦU
1.Lý do chọn đề tài:
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra, xuất hiện khá
phổ biến trên các khu vực trồng lúa ở Việt Nam, đặc biệt tập trung ở khu vực đồng bằng sông Cửu
Long. Bệnh gây hại trong vụ lúa hè thu nhiều hơn trong vụ đông xuân do thời tiết ẩm ướt, nhiều
sương mù, độ ẩm không khí cao. Bệnh xuất hiện và gây hại từ giai đoạn lúa đẻ nhánh đến đòng trổ
và chín.Bệnh bạc lá lúa gây thiệt hại rất nặng nề cho ngành nông nghiệp, làm giảm năng suất lúa 25
- 50 %, thậm chí mất trắng(Số liệu thống kê của cục bảo vệ thực vật).Một trong những giải pháp
quan trọng nhất phòng trừ bệnh bạc lá lúa hiện nay là sử dụng các dòng lúa mang gen kháng
bệnh.Tuy nhiên, các dòng lúa chỉ mang một vài gen kháng đơn lẻ, được nuôi trồng liên tục trên
diện rộng dẫn đến tình trạng các chủng Xoo có khả năng gây bệnh ngay cả khi có các gen kháng đó
[18]. Chính vì vậy, việc kiểm soát bệnh bạc lá lúa bằng biện pháp sinh học đang thu hút được sự
chú ý của nhiều nhà nghiên cứu [36].
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram dương, được biết đến như nguồn sinh các chấtkháng
sinh và các chất có hoạt tính sinh học [6]. Bộ sưu tập hơn 3000 chủng xạ khuẩn đang đượcbảo quản
tại Bảo tàng giống chuẩn, Viện Vi Sinh và Công nghệ sinh học, ĐHQGHN hứa hẹn tiềm năng tìm ra
các chất có hoạt tính sinh học mới dùng cho việc khống chế và tiêu diệt vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lá
lúa ở Việt Nam hiện nay. Trong nghiên cứu này, được sự tài trợ của quỹ đề tài NAFOSTED, TS.
Phan Thị Phương Hoa và các cộng sự đã sàng lọc 2690 chủng xạ khuẩn và lựa chọn được 17 chủng
có khả năng kháng tất cả 10 chủngXoo. Trong đó, lựa chọn chủng VN08-A12 là một tác nhân kiểm
soát sinh học của bệnh bạc lá lúa. Chủng VN08-A12 có nhiều ưu điểm nổi bật đã được thử nghiệm
ngoài đồng ruộng và thu được kết quả rất đáng mừng. Kết quả cho thấy chủng VN08-A12 không
chỉ có thể làm giảm chiều dài tổn thương của cây lúa do nhiễmXoo, mà còn làm giảm đáng kể tổn
thất năng suất của giống lúa bị nhiễm Xoo [23][24]. Chính vì vậy, để phát triển một chế phẩm
khống chế sinh học để kiểm soát bệnh bạc lá lúa, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên
cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini (VN08-A12) kháng bệnh bạc lá
lúa do Xanthomonas oryzae”.
2. Nhiệm vụ và mục đích nghiên cứu
- Phân loại chủng xạ khuẩn VN08 - A12.
- Lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất để khả năng sinh hoạt chất của chủng xạ khuẩn là
cao nhất.
- Tinh sạch và xác định cấu trúc của hoạt chất kháng Xoo sinh ra bởi chủng xạ khuẩn VN08
- A12.
2
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Bệnh bạc lá lúa và tác hại của bệnh bạc lá lúa
1.1.1. Giới thiệu chung
Bệnh bạc lá lúa - hay còn gọi là bệnh cháy bìa lá lúa (Bacterial leaf blight disease) là một
trong những bệnh phổ biến trong các nước trồng lúa. Bệnh bạc lá lúa được phát hiện lần đầu ở
vùng Fukuoko, Kyushu, Nhật Bản ngay từ những năm 1884 [45]. Hiện nay, bệnh bạc lá đã xảy ra
trên rất nhiều quốc gia, đặc biệt ở châu Á. Ở nhiều nước châu Á, căn bệnh này đã trở thành đại dịch
trên lúa. Bệnh có thể làm giảm sản lượng ở mức độ khác nhau, tùy thuộc vào giai đoạn nhiễm bệnh
của cây, mức độ nhạy cảm của giống lúa và ảnh hưởng của môi trường. Ở một số nước châu Á và
Đông Nam Á, bệnh bạc lá lúa thường làm giảm năng suất 10-20 %nhưng có thể lên đến 50%
[33][38]. Ở Nhật Bản, thiệt hại năng suất ước tính là 20-30% thậm chí đến 50%. Ở vùng nhiệt đới,
bệnh phá hoại gây ảnh hưởng nặng tới hàng triệu ha lúa. Ở Ấn Độ, thiệt hại về sản lượng từ 6 đến
60%. Việc giảm sản lượng chủ yếu là do giảm số lượng bông và trọng lượng hạt [43].
Hình 1.Lúa bị nhiễm bệnh bạc lá do vi khuẩnXoo.
(www.thaibinhseed.com.vn/benh-bac-la-lua)
1.1.2. Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa
Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa là vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). Vi khuẩn này có
tế bào hình que với đầu tròn, với chiều dài từ 0,8 đến 1 µm, chiều rộng 0,4 đến 0,7 μm, bao quanh
tế bào là một màng nhầy. Đây là loại vi khuẩn Gram âm và không sinh bào tử, khuẩn lạc hình tròn,
lồi, bề mặt nhẵn, màu vàng (hình 2) [9].Vi khuẩn này chủ yếu xâm nhập vào hệ thống mạch dẫn rồi
dẫn đến nhiễm trùng toàn thân cây lúa. Ngoài ra vi khuẩn còn có thể xâm nhập qua lỗ thùy khổng ở
mép lá, đầu mút lá dễ dàng gây tổn thương dọc theo gân lá [39].
3
Hình 2. Khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Xoo [9]
Loại vi khuẩn này đầu tiên được các nhà khoa học Nhật Bản, Hori và Bokura đặt tên là
Bacillus oryzae từ năm 1911 và được đổi tên nhiều lần..[49][50].
1.2. Các cách phòng trừ bệnh bạc lá lúa
1.2.1. Sử dụng thuốc hóa học
Thuốc hóa học được sử dụng để giết chết hoặc ức chế sự nhân lên của các tác nhân gây
bệnh bằng cách ngăn chặn con đường trao đổi chất của vi khuẩn. Một số hóa chất được sử dụng để
kiểm soát bệnh bạc lá lúa như Bordeaux có hoặc không có đường, hỗn hợp đồng xà phòng, thuốc
diệt nấm và đồng thủy ngân, dịch phun oxychloride. Ở Ấn Độ, sử dụng bột Clo trong xử lý nước
cũng làm giảm bệnh [11]... [54]. Việc sử dụng các thuốc hóa học luôn mang lại hậu quả rất nặng
nề đối với môi trường. Đồng thời, cũng chưa có phương thức kiểm soát bằng hóa chất nào mang lại
hiệu quả cao bởi vì khả năng tồn tại và phát triển của các chủng kháng thuốc.
1.2.2. Chọn giống lúa kháng bệnh
Chọn giống lúa kháng bệnh hiện nay cũng là phương pháp đang được quan tâm. Hiện nay,
23 gen kháng bệnh bạc lá lúa (Xa) đã được công bố (bảng 1).Các đoạn mồi cũng đã được thiết kế
để phát hiện các gen Xa trên các giống lúa khác nhau (bảng 2).
Bảng 1. Đặc điểm và nguồn gốc của các gen Xa kháng bệnh bạc lá lúa[37]
Tên gen Xa mới Tên gen Xa cũ Nhiễm sắc thể Giống, dòng lúa đại diện
Xa1 Xa1 NST 4 Kogyoku
Xa1-h Xa-1h NST 4 IR28, IR29, IR30
Xa2 Xa2 NST 4 Rentai Emas2, tẻ tép
Xa3 Xa-w NST11 Wase Aikoku3
Xa-4b NST11 Semora Mangga
Xa-6 NST-5 Zenith
Xa-9 NST-6 Sateng
5µm
4
Tên gen Xa mới Tên gen Xa cũ Nhiễm sắc thể Giống, dòng lúa đại diện
Xa4 Xa-4 NST11 TKM6, IR20, UR22
Xa5 Xa-5 NST 4 DZ192,IR1545-339
Xa7 Xa-7 NST 4 DV85, DZ78
Xa8 Xa-8 NST 4 PI231129
Xa10 Xa-10 NST11 Cas 209
Xa11 Xa-11 RP 9-3, IR8
Xa12 Xa-kg NST4 Kogyoku, Java14
Xa12-h Xa-kgh NST 4 IR28, IR29, IR30
Xa13 Xa-13 NST 5 BJ1, Chinsura Boro II
Xa14 Xa-14 Tai chung Native 1
Xa15 (t) Xa-nm (t) M41
Xa16 Xa-16 Tẻ tép
Xa17 Xa-as(t) NST 4 Asominori
Xa18 Xa-18 IR24, Milyang 23
Xa19 Xa19 Đột biến XM5
Xa20 Xa-20 Đột biến M6
Xa21 Xa-21 NST 11 IRBB21
Xa22 (t)b Xa-22 (t) NST 11 Zachanglong
Xa23 (t)b Xa-23 (t) NST 11 WBB1
Bảng 2. Trình tự các đoạn mồi đặc hiệu để phát hiện gen Xa trên lúa [15]
Mồi Trình tự nucleotide Xa-gen
MP1 5'-ATC-GAT-CGA-TCT-TCA-CGA-GG-3' Xa-4
MP2 5'-dTG-CTA-TAA-AAG-GCA-TTC-GGG-3'
RG556 F 5'-TAG-CTG-CTG-CCG-TGC-TGT-GC-3' Xa-5
RG556 R 5'-AAT-ATT-TCA-GTG-TGC-ATC-3'
P3 F 5'-CAG-CAA-TTC-ACT-GGA-GTA-GTG-GTT-3' Xa-7
P3 R 5'-CAT-CAC-GGT-CAC-CGC-CAT-ATC-GGA-3'
Xa21F 5'-ATA-GCA-ACT-GAT-TGC-TTT-GC-3' Xa-21
Xa 21 R 5'- CGA - TCG - GTA - TAA- CAG-CAA-AAC-3'
RG136 F 5' - TCC-CAG-AAA-GCT - ACA-GC-3' Xa-13
RG136 R 5' - GCA-GAC-TCC-AGT=TTG-ACT-TC-3'
Gen Xa21 lần đầu tiên được phát hiện trong một giống lúa hoang dại Oryza longistaminata
và đã dược chuyển vàogiống lúa IR24 để tạo ra giống lúa kháng bệnh IRBB21 [30]. Ở Ấn Độ và
5
Philippin, giống lúa này đã được chứng minh là có khả năng kháng với hầu hết các chủngXoo. Tuy
nhiên, cho đến nay một số chủngXoo ở một số vùng của châu Á đã được phát hiện là có thể vượt
qua được gen kháng Xa21 trong giống lúa IRBB21 (hình 3) [18].
1.2.3. Khống chế sinh học
Các thuốc hóa học đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh bạc lá lúa
nhưng không được ứng dụng rộng vì những biến đổi khó lường của các tác nhân gây bệnh. Sự xuất
hiện các quần thể kháng thuốc đặt ra mối đe dọa nghiêm trọng cho chiến lược kiểm soát hóa học
lâu dài. Đồng thời, các chất hóa học thường rất độc hại đối với người sử dụng, gây ảnh hưởng đến
các loài sinh vật khác, và tích lũy qua thời gian dài sẽ gây ảnh hưởng trầm trọng lên hệ sinh thái.
Việc chọn tạo giống kháng bệnh cũng đã được áp dụng nhưng các nhóm quần thể kháng lại gen
kháng bệnh cũng phát triển nhanh chóng. Do đó, kiểm soát sinh học được cho là một giải pháp sinh
thái có hiệu quả cho việc ngăn ngừa bệnh bạc lá lúa [27]. Islam và Bora (1998) đã đưa ra biện pháp
phòng trừ bệnh bạc lá bằng việc sử dụng 2 chủng vi khuẩn Rhizobacterial vào việc khử trùng hạt
giống. Kết quả cho thấy việc xử lý hạt giống không chỉ có tác dụng làm giảm ảnh hưởng của bệnh
bạc lá mà còn có tác dụng làm tăng năng suất lúa [17][29].
1.3. Xạ khuẩn
1.3.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram dương, thường có tỷ lệ GC trong ADN cao hơn 55%.
Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có khoảng 100 chi và 1000 loài
xạ khuẩn [12]. Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, 10 dưới bộ, 35 họ, 110
chi và 1000 loài. Xạ khuẩn phân bố chủ yếu trong đất và đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình
tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Chúng sử dụng axit humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác
trong đất. Trong đất xạ khuẩn chiếm từ 9% - 45% tổng số vi sinh vật, số lượng trung bình khoảng
106 - 10
8 tế bào/ g đất. Số lượng xạ khuẩn trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ
thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật. Đất giàu chất dinh dưỡng
hữu cơ, khoáng và lớp đất trên bề mặt (đến 40 cm) thường có số lượng xạ khuẩn lớn. Trong 1 g đất
canh tác có thể có tới 5 x 106 tế bào xạ khuẩn, trong khi đó đất vùng sa mạc, nóng, khô, độ ẩm thấp,
nghèo chất dinh dưỡng, có số lượng xạ khuẩn thấp hơn 10 - 100 lần, dao động trong khoảng 104 -
105 tế bào/ 1 g đất. Sự phân bố của xạ khuẩn trong đất còn phụ thuộc nhiều vào độ pH của môi
trường, thường có nhiều trong lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu, trong khoảng pH 6,0 -
8,0. Xạ khuẩn không có nhiều trong lớp đất kiềm hay axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm.
Số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm [4].