1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN TRỌNG HỘI NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN BỘ KIT PCR 16 GEN GẮN HU ỲNH QUANG ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU DÂN TỘC HỌC VÀ GIÁM ĐỊNH GEN Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 62420121 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
1
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
TRẦN TRỌNG HỘI
NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN BỘ KIT PCR 16 GEN GẮN
HUỲNH QUANG ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU DÂN
TỘC HỌC VÀ GIÁM ĐỊNH GEN
Chuyên ngành : Di truyền học
Mã số : 62420121
DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Hà Nội - 2015
2
Công trình được hoàn thành tại:
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Trịnh Đình Đạt
2. PGS.TS. Nguyễn Văn Hà
Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia
chấm luận án tiến sĩ họp tại . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . .vào hồi giờ ngày tháng năm 20...
3
MỞ ĐẦU
Ở mức độ di truyền, người ta đã ước tính được khoảng 99,7% hệ gen người là giống
nhau, sự khác biệt giữa hai cá thể được tìm thấy trong 0,3% của toàn bộ ADN còn lại trong cơ
thể của mỗi người [38]. Hệ gen người có rất nhiều các trình tự ADN lặp lại, trong đó có các
trình tự ngắn lặp lại liên tiếp (STR) hay còn được gọi là trình tự lặp lại đơn giản (SSR) hoặc vi
vệ tinh (microsatellite). Các STR này thường có kích thước ngắn khoảng từ 100-400 bp, mang
các đơn vị lặp lại, mỗi đơn vị lặp thường có 2-7 bp và được tìm thấy ở vùng ADN không mã
hóa. Chúng nằm rải rác trên tất cả 22 cặp NST thường, cũng như trên cặp NST giới tính X và
Y. Các STR trên NST thường có tính đa hình cao hơn so với các STR trên NST Y (Y-STR) do
thiếu sự tái tổ hợp trên NST này. Chúng có một vai trò quan trọng trong nghiên cứu di truyền
quần thể và phân tích ADN nhận dạng cá thể người (giám định ADN) [67].
Vào những năm 1990, các locus STR đầu tiên được sử dụng trong các PTN phân tích
ADN nhận dạng cá thể người. Ngày nay, kỹ thuật phân tích STR là một công cụ không thể
thiếu được trong các PTN phân tích ADN hình sự [50, 66, 123]. Hiện nay, có khoảng hơn
20.000 locus STR lặp bốn nucleotide (có 4bp trong mỗi đơn vị lặp lại) được xác định có trong
hệ gen người [44] và bộ CODIS 13 locus STR lõi do FBI (Mỹ) lựa chọn là bộ locus STR trên
NST thường được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay [67].
Mặt khác, công nghệ phân tích STR trên thế giới phát triển cũng rất đa dạng, bao gồm:
Điện di gel polyacrlamide biến tính-nhuộm bạc [27, 99]; đánh dấu huỳnh quang-điện di mao
quản [35, 85]; điện di mao quản vi mạch sử dụng microchip [74, 76, 101]; phân tích bằng khối
phổ (mass spectrometry) [38, 39] và công nghệ pyrosequencing (giải trình tự bằng tổng hợp)
[53, 56, 100]. Tuy nhiên, kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản là công nghệ đã
được nghiên cứu hoàn thiện và được sử dụng rộng rãi trong các PTN phân tích ADN hình sự
trên thế giới với những ưu điểm: độ nhạy và chính xác cao; thời gian phân tích mẫu nhanh
(được tính bằng phút); việc phân tích mẫu được thực hiện một cách tự động và có thể phân tích
với quy mô số lượng mẫu lớn (xây dựng tàng thư ADN) [35].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích STR trong nhận dạng cá thể
người cũng đã được phát triển mạnh mẽ từ những năm 2000 đến nay với những nghiên cứu về
tối ưu điều kiện PCR đa mồi cho các locus STR (từ 2- 4 locus), xây dựng thang alen cho các
locus STR (2-3 locus), chế tạo các bộ kit PCR (3-4 locus STR) và sử dụng kỹ thuật điện di gel
polyacrylamide biến tính-nhuộm bạc để phát hiện các alen STR [1-3, 7, 9-12]. Bên cạnh đó,
việc nghiên cứu khảo sát tần suất alen của các locus STR cũng được thực hiện trên dân tộc
người Mường (N=107, với ba locus D5S818-D13S317-D7S820) [5] và người Kinh [8, 13]. Tuy
nhiên, kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu thăm dò ban đầu, các dữ liệu
tần suất alen và các chỉ số thống kê nhận dạng cá thể người chưa phản ánh đầy đủ cho các quần
thể nghiên cứu. Mặt khác, công nghệ phân tách và phát hiện các alen STR được sử dụng trong
các nghiên cứu này chủ yếu là dùng kỹ thuật điện di gel polyacrylamide biến tính-nhuộm bạc
còn có nhiều mặt hạn chế như: Độ nhạy và chính xác chưa cao; thời gian phân tích mẫu lâu
4
(được tính bằng ngày); việc phân tích mẫu không thực hiện tự động được và kết quả phân tích
mẫu phụ thuộc rất nhiều vào thao tác cũng như kinh nghiệm của người làm thí nghiệm.
Xuất phát từ những lý do trên, việc thực hiện luận án “Nghiên cứu hoàn thiện bộ kit
PCR 16 gen gắn huỳnh quang ứng dụng trong nghiên cứu dân tộc học và giám định gen” là
hết sức có ý nghĩa và mang tính cấp thiết.
Mục tiêu nghiên cứu
1. Chế tạo bộ kit PCR 16 locus (gen) gắn huỳnh quang trên hệ thống điện di mao quản.
2. Ứng dụng trong nghiên cứu dân tộc học và giám định ADN.
Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Nhóm đối tượng nghiên cứu chính là các cá thể người thuộc ba dân tộc của Việt
Nam là: người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh; người
Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa Bình và người Khmer (N=110) sống tỉnh Sóc Trăng.
Nội dung nghiên cứu
1. Nghiên cứu chế tạo bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trên hệ thống điện di mao
quản.
2. Ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong nghiên cứu di truyền quần thể ở
ba dân tộc người Việt Nam (người Kinh, người Mường và người Khmer).
3. Ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong phân tích ADN nhận dạng cá thể
người (giám định ADN) tại Việt Nam.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
1. Bổ sung dữ liệu tần suất alen 15 locus STR trên NST thường (D3S1358, TH01, D21S11,
D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, vWA,
D8S1179, TPOX và FGA) của người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội và thành
phố Hồ Chí Minh; người Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa Bình và người Khmer
(N=110) sống tỉnh Sóc Trăng vào CSDL STR của người Việt Nam phục vụ cho công tác
nghiên cứu di truyền quần thể và giám định ADN tại Việt Nam.
2. Tạo ra được các bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trên hệ thống điện di mao quản,
giúp cho chủ động về công nghệ, đáp ứng các nhu cầu về phân tích ADN nhận dạng cá
thể người, xác định huyết thống, làm thẻ ADN cá nhân, xây dựng CSDL tàng thư ADN,
nghiên cứu di truyền quần thể...ở Việt Nam.
Điểm mới của luận án
Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về việc tối ưu điều kiện PCR đa mồi cho 16
cặp mồi gắn huỳnh quang và chế tạo thành công bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh trên hệ
thống điện di mao quản. Bộ kit mới này, đã được ứng dụng thành công ở hai lĩnh vực
nghiên cứu chính. Đó là:
1. Nghiên cứu di truyền quần thể ở người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội và thành
phố Hồ Chí Minh, thu được 173 alen/15 locus; người Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa
Bình, thu được 132 alen/15 locus và người Khmer (N=110) sống tỉnh Sóc Trăng, thu
được 145 alen/15 locus. Kết quả nghiên cứu này đã bổ sung vào CSDL 15 locus STR
nghiên cứu ở quần thể người Việt Nam là 32 alen mới so với kết quả nghiên cứu trước
5
đây của tác giả Shimada và các đồng nghiệp [103]. Kết quả nghiên cứu cũng đã xây
dựng được cây phả hệ di truyền theo phương pháp neighbor-joining bằng phần mềm
POPTREE 2 [109] dựa trên dữ liệu tần suất alen của 13 locus thuộc bộ CODIS 13 locus
STR lõi (do FBI-Mỹ lựa chọn) của 3 quần thể nghiên cứu và 14 quần thể tham khảo.
Cây phả hệ này, đã phản ánh được mối quan hệ di truyền giữa 3 quần thể nghiên cứu với
14 quần thể khác nhau trên thế giới. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra được người Kinh và
người Mường có quan hệ gần gũi với nhau hơn so với người Khmer dựa trên giá trị
khoảng cách di truyền chuẩn của Nei (DST).
2. Phân tích ADN nhận dạng cá thể người (giám định ADN) tại Việt Nam bằng việc truy
nguyên cá thể người từ các dấu vết sinh phẩm thu được tại hiện trường của một số vụ án
(dấu vết máu và tinh trùng) với độ tin cậy cao (≥ 99,999999999999999985%); truy tìm
tung tích nạn nhân từ mẫu răng cửa của tử thi nạn nhân qua mối quan hệ huyết thống
mẹ-con với xác suất quan hệ là 99,999%; đã xây dựng được 9/10 hồ sơ ADN cá nhân
của 10 đối tượng cần kiểm soát an ninh (KSAN) và đã làm được 1.000 thẻ ADN cá nhân
thử nghiệm phục vụ công tác an ninh và dân sinh.
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Các locus STR sử dụng trong nghiên cứu di truyền quần thể và phân tích ADN hình
sự
Ngày nay, người ta đã phát hiện ra trong hệ gen người có chứa rất nhiều trình tự ADN lặp
lại. Những trình tự lặp lại này thường nằm giữa các gen, chúng có thể khác nhau về kích thước
ở các cá thể khác nhau mà không ảnh hưởng đến sức khỏe di truyền của cá thể đó [38].
Các trình tự ngắn lặp lại liên tiếp (STR) cũng được tìm thấy trong hệ gen người. Các STR
này đã trở thành các marker di truyền được sử dụng phổ biến hơn trong nghiên cứu di truyền
quần thể và phân tích ADN hình sự vì chúng dễ dàng được nhân bội để phân tích bằng kỹ thuật
PCR đa mồi [38].
Các tiêu chí để lựa chọn các locus STR sử dụng trong phân tích ADN hình sự bao gồm
[62, 45]:
- Tính dị hợp tử được cao (≥ 70 %);
- Có vị trí riêng biệt trên các NST khác nhau;
- Có khả năng kết hợp với các locus khác để tạo thành các bộ phức nhiều locus
(multiplex);
- Có tỷ lệ stutter thấp (<15%);
- Tỷ lệ đột biến thấp;
- Kích thước của các alen nằm trong khoảng từ 100 bp đến 400 bp.
Vào năm 1997, FBI (Mỹ) đã đồng ý lựa chọn bộ CODIS 13 locus STR lõi (CSF1PO,
FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539,
D18S51 và D21S11) làm cơ sở cho việc xây dựng tàng thư ADN quốc gia của Mỹ và phục vụ
cho công tác điều tra phá án trong tương lai [32]. Bộ CODIS này cho khả năng trùng lặp là
6
khoảng 1 trong 1.000 tỷ [48]. Ngoài ra, FBI cũng sử dụng thêm locus Amelogenin để xác định
giới tính.
Hiện nay, theo như thông báo của FBI đến ngày 01/01/2017, sẽ bổ sung thêm 7 locus
STR trên NST thường mới (D1S1656, D2S441, D2S1338, D10S1248, D12S391, D19S433, và
D22S1045) vào bộ CODIS hiện có để nâng cấp thành bộ 20 locus STR sử dụng cho việc thiết
lập hồ sơ ADN thuộc Hệ thống tàng thư ADN Quốc gia, Mỹ [69, 70].
1.2. Công nghệ phân tích STR sử dụng kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản
Đánh dấu huỳnh quang vào các đoạn ADN có thể được thực hiện bằng nhiều cách khác
nhau. Tuy nhiên, phương pháp phổ biến nhất được sử dụng đánh dấu các alen STR là sử dụng
các thuốc nhuộm huỳnh quang để đánh dấu ở đầu 5' của một mồi PCR (mồi xuôi hoặc mồi
ngược). Quá trình đánh dấu này, được thực hiện ngay từ khi đặt tổng hợp mồi. Sau đó, sử dụng
các mồi này để PCR nhân bội các locus STR tương ứng sẽ tạo các sản phẩm PCR được đánh
dấu [85]. Các sản phẩm PCR này, được điện di phân tách trên hệ thống điện di mao quản. Hai
sợi ADN được phân tách ra trong quá trình điện di và chỉ sợi ADN được đánh dấu sẽ được phát
hiện bằng thiết bị phát hiện huỳnh quang chuyên dụng [35] (xem Hình 1.7).
1.3. Luận giải các vấn đề nghiên cứu của luận án
Qua các bằng chứng và cơ sở khoa học đã được phân tích ở trên cho thấy, các locus STR
trên NST thường ở người có một vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu di truyền quần thể và
phân tích ADN hình sự (giám định ADN) trên thế giới. Bên cạnh đó, ở thời điểm hiện nay,
công nghệ phân tích STR bằng kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản đã được
Hỗn hợp các sản phẩm
PCR đã được đánh dấu
huỳnh quang từ phản ứng
PCR đa mồi
CCD Panel (với các kính lọc)
Argon ion LASER
(488 nm)
Phân tách các màu Huỳnh
quang
ABI Prism
spectrograph
Phân tách theo kích thước
Phân tích bằng phần mềm GeneMapper ID
2. Lấy mẫu vào mao quản
3. Phân tách mẫu
4. Phát hiện mẫu
5. Phân tích kết quả 1. Chuẩn bị mẫu
Mao quản (chứa
dung dịch polymer)
Hình 1.7. Sơ đồ mô tả các bước phân tách và phát hiện các alen STR với hệ
thống máy điện di mao quản của hãng Applied Biosystems [35].
7
nghiên cứu hoàn thiện, được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng phân tích ADN hình sự trên thế
giới và có nhiều ưu việt hơn so với các công nghệ phân tích khác.
Chính vì vậy, trong luận án này đã lựa chọn 15 locus STR trên NST thường (D3S1358,
TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D,
vWA, D8S1179, TPOX và FGA) và locus Amelogenin xác định giới tính để nghiên cứu. Công
nghệ được sử dụng trong luận án để phân tách và phát hiện các alen STR này là đánh dấu huỳnh
quang-điện di mao quản trên hệ thống máy 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster
City, CA) đang được sử dụng phổ biến ở các PTN phân tích ADN tại Việt Nam.
Trong luận án này, vấn đề nghiên cứu thứ nhất được đặt ra: Nghiên cứu chế tạo bộ kit
PCR 16 locus gắn huỳnh quang trên hệ thông điện di mao quản. Để giải quyết được vấn đề
nghiên cứu thứ nhất này, các nội dung công việc đã được thực hiện, bao gồm: Tối ưu điều kiện
PCR đa mồi cho 16 cặp mồi gắn huỳnh quang; Xây dựng thang alen cho 16 locus nghiên cứu
và Nghiên cứu chế tạo bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh trên hệ thống điện di mao quản.
Sau khi vấn đề nghiên cứu thứ nhất được giải quyết, vấn đề nghiên cứu thứ hai của
luận án được đặt ra là: Ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong nghiên cứu di
truyền quần thể ở ba dân tộc người Việt Nam. Ba dân tộc được lựa chọn trong nghiên cứu này
là người Kinh sống ở khu vực Hà Nội (6.370.244 người) [126] và thành phố Hồ Chí Minh
(6.699.124 người) [126]; người Mường sống ở tỉnh Hòa Bình (501.956 người) [126] và người
Khmer sống ở tỉnh Sóc Trăng (397.014 người) [126]. Lý do để lựa chọn ba dân tộc nghiên
cứu là: (1) Xuất phát từ nhiệm vụ của đơn vị; (2) Ba dân tộc nghiên cứu đều là các dân tộc
chính và có dân số lớn ở Việt Nam (người Kinh có dân số 73.594.427 người, người Mường có
dân số 1.268.963 người và người Khmer có dân số 1.260.640 người [126]); (3) Hiện nay, dựa
trên ngôn ngữ sử dụng, 54 dân tộc anh em đang sinh sống trên lãnh thổ Việt Nam được chia
thành 8 nhóm dân tộc chính, trong đó người Kinh và người Mường đều thuộc nhóm Việt-
Mường (Vietic) còn người Khmer thuộc nhóm Môn-Khmer (Austroasiatic) [127, 128]. Điều
này cũng cần phải được kiểm chứng dựa trên các bằng chứng khoa học khác.
Các nội dung nghiên cứu đã được thực hiện để giải quyết vấn đề nghiên cứu thứ hai này,
bao gồm: Khảo sát tần suất alen cho 15 locus STR nghiên cứu trong ba quần thể người Kinh,
người Mường và người Khmer bằng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang và So sánh mối
quan hệ di truyền giữa ba quần thể nghiên cứu với một số quần thể tham khảo khác nhau trên
thế giới bằng cây phả hệ di truyền.
Sau khi vấn đề thứ hai được giải quyết, vấn đề nghiên cứu thứ ba còn lại của luận án
đƣợc đặt ra là: Ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong phân tích ADN nhận cá
thể người (giám định ADN) tại Việt Nam. Để giải quyết được vấn đề thứ ba còn lại này, các nội
dung nghiên cứu đã được thực hiện như sau: Ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang
trong một số vụ án; Phân tích một số loại dấu vết ADN thu được từ một số đối tượng cần
KSAN và Làm thẻ ADN cá nhân phục vụ công tác an ninh và dân sinh.
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1.Nguồn mẫu sử dụng cho nghiên cứu
8
Nguồn mẫu dùng cho tối ưu phản ứng PCR đa mồi: Mẫu ADN chuẩn 9947A (10ng/l) của
hãng Promega (Code: DD1001).
Nguồn sử dụng cho nghiên cứu khảo sát tần suất alen: 514 mẫu máu của 514 cá thể khác
nhau thuộc ba dân tộc nghiên cứu là: người Kinh (300 mẫu gồm 122 nam và 178 nữ) sống ở
khu vực Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh; người Mường (104 mẫu gồm 63 nam và 41 nữ)
sống ở tỉnh Hòa Bình và người Khmer (110 gồm 60 nam và 50 nữ) sống ở tỉnh Sóc Trăng,
Việt Nam.
Nguồn mẫu sử dụng cho ứng dụng phân tích ADN nhận dạng cá thể người (giám định
ADN)
+ Các mẫu sinh phẩm thu được tại hiện trường của một số vụ án do Phòng Kỹ thuật
Hình sự (PC54) - Công an thành phố (CATP) Hải Phòng cung cấp, bao gồm: mẫu dấu vết máu,
mẫu tinh trùng và răng của tử thi.
+ Ba mươi mẫu dấu vết ADN (9 mẫu tăm bông thu trên miệng cốc uống nước; 5 mẫu
ống hút dùng để uống nước; 3 mẫu bàn chải đánh răng; 9 mẫu đầu mẩu thuốc lá và 4 mẫu dao
cạo râu) thu được từ 10 đối tượng cần KSAN do Phòng 4 - Cục Bảo vệ Chính trị VI (A67) - Bộ
Công an cung cấp.
+ Một nghìn mẫu máu của 1.000 cá thể thuộc các nhóm đối tượng mà có nghề nghiệp
tiềm ẩn nguy cơ rủi do cao như phi công, tiếp viên hàng không và ngư dân (trong đó, đã bao
gồm cả 300 mẫu của người Kinh được lựa chọn cho nghiên cứu khảo sát tần suất alen).
Tất cả các mẫu sinh phẩm này đều được lưu giữ ở -20oC, tại PTN Công nghệ gen và Vi
sinh, Viện Kỹ thuật Hóa-Sinh và Tài liệu nghiệp vụ, Bộ Công an.
2.1.2. Bộ 16 locus nghiên cứu
Bộ 16 locus nghiên cứu bao gồm 15 locus STR nằm trên NST thường (D3S1358, TH01,
D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, vWA,
D8S1179, TPOX và FGA) và locus Amelogenin để xác định giới tính.
2.1.3. Bộ 16 cặp mồi PCR gắn huỳnh quang
Được nêu ở Bảng 2.1 như sau:
Bảng 2.1. Kết quả đặt tổng hợp 16 cặp mồi PCR gắn huỳnh quang [83] (Nguồn: IDT, 2012).
Mồi Trình tự nucleotide
(5’>>>>>>>3’)
GC
(%)
Tm
(oC)
Đầu 5’ Tinh
sạch
OD260 Nồng độ
(nmol)
MW
(g/mol)
D3_F ACTGCAGTCCAATCTGGGT 52,6 56,4 OH HPLC 8,2 40,3 5.803
D3_R ATGAAATCAACAGAGGCTTGC 42,8 53,7 FL HPLC 5,5 23,5 7.000
TH_F GTGATTCCCATTGGCCTGTTC 52,3 56,5 FL HPLC 5,8 28,1 6.916
TH_R ATTCCTGTGGGCTGAAAAGCTC 50,0 57,8 OH HPLC 7,6 31,7 6.750
D21_F ATATGTGAGTCAATTCCCCAAG 40.9 52,5 OH HPLC 9,7 39,2 6.718
D21_R TGTATTAGTCAATGTTCTCCAGAGAC 38,4 54,2 FL HPLC 4,7 17,2 8.497
D18_F TTCTTGAGCCCAGAAGGTTA 45,0 53,4 FL HPLC 4,2 19,6 6.669
D18_R ATTCTACCAGCAACAACACAAATAAAC 33.3 54,6 OH HPLC 14,2 45,3 8.182
PeE_F ATTACCAACATGAAAGGGTACCAATA 34,4 54,4 OH HPLC 11,7 37,1 7.980
PeE_R TGGGTTATTAATTGAGAAAACTCCTTACA
ATTT 27,2 55,8 FL HPLC 5,9 17,0 10.678
D5_F GGTGATTTTCCTCTTTGGTATCC 43,5 53,5 OH HPLC 7,2 31,7 7.002
D5_R AGCCACAGTTTACAACATTTGTATCT 34,6 55,1 JOE HPLC 3,4 12,6 8.570
D13_F ATTACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA 42,6 59,0 OH HPLC 12,0 38,7 8.139
D13_R GGCAGCCCAAAAAGACAGA 52,6 55,8 JOE HPLC 3,0 13,5 6.515
D7_F ATGTTGGTCAGGCTGACTATG 47,6 54,6 JOE HPLC 4,8 21,3 7.158
Bảng 2.1. Tiếp theo...
Mồi Trình tự nucleotide
(5’>>>>>>>3’)
GC
(%)
Tm
(oC)
Đầu 5’ Tinh
sạch
OD260 Nồng độ
(nmol)
MW
(g/mol)
D7_R GATTCCACATTTATCCTCATTGAC 37,5 51,9 OH HPLC 10,3 41,0 7.237
D16_F GGGGGTCTAAGAGCTTGTAAAAAG 45,8 55,5 OH HPLC 10,4 35,9 7.505
D16_R GTTTGTGTGTGCATCTGTAAGCATGTATC 41,3 58,2 JOE HPLC 3,3 11,1 9.611
CSF_F CCGGAGGTAAAGGTGTCTTAAAGT 45,8 56,4 JOE HPLC 4,2 15,9 8.123
CSF_R ATTTCCTGTGTCAGACCCTGTT 45,5 56,3 OH HPLC 7,9 35,8 6.667
PeD_F GAAGGTCGAAGCTGAAGTG 52,6 53,3 JOE HPLC 2,5 11,4 6.608
PeD_R ATTAGAATTCTTTAATCTGGACACAAG 29,6 51,7 OH HPLC 12,0 38,3 8.281
9
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Luận án đã sử dụng 2 nhóm phương pháp nghiên cứu chính như sau:
2.2.1. Các phương pháp sinh học phân tử
2.2.1.1. Tách chiết ADN hệ gen người bằng Chelex [118]
2.2.1.2. Tách chiết ADN hệ gen người bằng phương pháp “salting out”
2.2.1.3. Tách chiết ADN hệ gen người từ mẫu xương bằng kit DNA IQ Systems
2.2.1.4. Định lượng ADN bằng máy quang phổ Nanodrop
2.2.1.5. Phương pháp tối ưu phản ứng PCR đa mồi [81, 83, 89]
2.2.1.6. Phương pháp xây dựng thang alen bằng PCR đa mồi
2.2.1.7. Phương pháp chế tạo kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trên hệ thống điện di mao
quản
2.2.1.8. Phương pháp PCR sử dụng kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang
2.2.1.9. Kỹ thuật điện di mao quản trên hệ thống máy 3130 Gentic Analyzer
2.2.2. Các phương pháp tin sinh học và xử lý số liệu bằng phần mềm
2.2.2.1. Kiểm tra mồi bằng phần mềm FastPCR, OligoAnalyzer và BLAST
2.2.2.2. Phân tích kiểu gen bằng phần mềm GenMapper® ID
2.2.2.3. Xử lý dữ liệu thống kê bằng phần mềm EasyDNA_PopuData
2.2.2.4. Xây dựng cây phả hệ di truyền bằng phần mềm POPTREE 2
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu chế tạo bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh trên hệ thống điện di mao
quản
3.1.1. Kết quả tối ưu điều kiện PCR đa mồi cho 16 cặp mồi gắn huỳnh quang
3.1.1.1. Kết quả tối ưu thành phần PCR đa mồi
Từ các kết quả tối ưu thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi cho 16 cặp mồi gắn
huỳnh quang, luận án đã lựa chọn được các thành phần tối ưu được nêu trong Bảng 3.1 như sau:
Bảng 3.1. Thành phần tối ưu được lựa chọn cho PCR đa mồi của 16 cặp mồi nghiên
cứu
Thành phần Thể tích cần lấy
(l)
Nồng độ tối ƣu (cuối
cùng)
Colorless GoTaq® Flexi Buffer (5X) 4,8 1,2X
dNTP (10mM) 0,5 250M
10
MgCl2 (25mM) 1,4 1,75mM
HQ 16 plex 10X Primer Mix 2,0 1,0X
GoTaq® Hot Start polymerase
(5unit/l)
0,6 3,0 unit
ADN 9947A (0,2 - 2,0 ng) 1,0 0,2 - 2,0 ng
Nước deion-không có nuclease 9,7 -
Tổng thể tích (l) 20,0
3.1.1.2. Kết quả tối ưu chu trình nhiệt PCR đa mồi
Từ các kết quả tối chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đa mồi cho 16 cặp mồi gắn huỳnh
quang, luận án đã lựa chọn được chu trình nhiệt tối ưu là: 96 oC - 2 phút; (94 oC - 1 phút; 60 oC - 1 phút; 72 oC - 1 phút) x 30 chu kỳ; 60 oC - 30 phút và giữ ở 15 oC.
3.1.2. Kết quả xây dựng thang alen cho 16 locus nghiên cứu
Sau khi xây dựng được thang alen cho 16 locus nghiên cứu (thực hiện theo phương pháp
được nêu ở Mục 2.2.1.6), chất lượng thang alen được kiểm tra bằng cách như sau: Lấy 1,5l
thang alen tinh sạch và 0,5 l ILS-600 trộn với 10,0l Hi-Di Formamide. Hỗn hợp này được
biến tính bằng máy GenAmpPCR System 9700 ở 95oC trong 3 phút và giữ ở 4oC trong 5 phút.
Sau đó, hỗn hợp này được điện di trên hệ thống máy 3130 Gentic Analyzer. Kết quả điện di
được phân tích bằng phần mềm GenMapper® software v.3.2.1 và được nêu trong Hình 3.1 như
sau:
3.1.3. Kết quả chế tạo bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang
Thang alen sau
khi tinh sạch
Thang alen
chưa tinh sạch
Thang alen
chưa tinh sạch
Thang alen
chưa tinh sạch
Hình 3.1. Kết quả xây dựng thang alen 16 locus nghiên cứu bằng phương pháp PCR đa
mồi, được điện di trên hệ thống máy 3130 Gentic Analyzer và phân tích bằng phần mềm
GenMapper® software v.3.2.1. Nhóm 6 locus đánh dấu JOE (D5S818, D13S317, D7S820,
D16S539, CSF1PO và Penta D)
11
Bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang chế tạo thành công được mô tả ở Hình 3.2 như
sau:
Bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang này, đã được gửi đi thử nghiệm đánh giá tại 02
PTN phân tích ADN của Viện Khoa Học Hình Sự - Bộ Công an và Viện Pháp Y Quân Đội - Bộ
Quốc phòng. Kết quả thử nghiệm đánh giá cho thấy: Bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang (có
ký hiệu KIT PCR HQ 16 plex) có chất lượng tốt với độ nhạy, độ đặc hiệu cao, có thể sử dụng
tốt cho việc giám định ADN theo công nghệ đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản, cụ thể
như sau:
- KIT PCR HQ 16 plex có nhạy và độ đặc hiệu tương đương với các bộ kit thương mại
cùng loại đang được sử dụng ở Việt Nam hiện nay (PowerPlex 16 HS System và
AmpFlSTR Identifiler PCR amplification) trên cùng mẫu ADN thử nghiệm là 9947A
với dải nồng độ: 0,2 - 0,5 - 1,0 - 2,0 (ng/20l phản ứng).
- Khả năng sử dụng của KIT PCR HQ 16 plex trong phân tích kiểu gen nhận dạng cá thể
người được thử nghiệm đối với 5 mẫu ADN có nồng độ từ 0,5 đến 1,0 (ng/l) và 2 mẫu
đối chứng (chứng dương sử dụng 9947A và chứng âm sử dụng nước deion diH2O) đều
cho kết quả phân tích kiểu gen chính xác.
- Bộ KIT PCR HQ 16 plex hoàn toàn tương thích với hệ thống máy 3130 Genetic
Analyzer và phân tích kiểu gen bằng phần mềm phân tích kết quả GeneMapper ID
v3.2.1 của hãng Applied Biosystems.
3.2. Kết quả ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong nghiên cứu di truyền
quần thể ở ba dân tộc ngƣời Việt Nam
3.2.1. Kết quả khảo sát tần suất alen của 15 locus STR trên NST thường ở ba quần thể người
Kinh, người Mường và người Khmer
Sau khi chế tạo thành công bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang, đã được ứng dụng để
khảo sát tần suất alen ở ba quần thể nghiên cứu là người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội
và thành phố Hồ Chí Minh; người Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa Bình và người Khmer
(N=110) sống ở tỉnh Sóc Trăng, Việt Nam. Kết quả phân tích thống kê bằng phần mềm
EasyDNA_PopuData [60] cho 15 locus STR nghiên cứu được nêu trong Bảng 3.4, Bảng 3.5 và
Bảng 3.6 như sau:
Hình 3.2. Mô tả thành phần bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang
12
Bảng 3.4. Tần suất alen và các chỉ số thống kê của 15 locus STR trên NST thường ở quần thể người Kinh (N=300)
Alen D3S1358 TH01 D21S11 D18S51 Penta_E D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1P0 Penta_D vWA D8S1179 TPOX FGA
5 --- 0,002 --- --- 0,057 --- --- --- --- --- 0,002 --- --- --- ---
6 --- 0,135 --- --- --- --- --- --- --- --- 0,002 --- --- --- ---
7 --- 0,31 --- --- 0,002 0,037 0,003 0,01 --- 0,01 0,03 --- --- 0,003 ---
8 --- 0,073 --- --- 0,002 0,002 0,315 0,138 0,002 0,002 0,087 --- 0,002 0,55 ---
9 --- 0,397 --- 0,002 0,015 0,048 0,127 0,05 0,225 0,04 0,307 --- 0,003 0,115 ---
9.1 --- --- --- --- --- --- --- 0,005 --- --- --- --- --- --- ---
9.3 --- 0,04 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
10 --- 0,04 --- 0,002 0,037 0,241 0,147 0,165 0,132 0,202 0,155 --- 0,17 0,032 ---
11 --- 0,003 --- 0,005 0,252 0,305 0,211 0,393 0,288 0,302 0,158 --- 0,145 0,278 ---
12 --- --- --- 0,055 0,123 0,217 0,157 0,207 0,222 0,352 0,142 0,002 0,11 0,02 ---
13 0,003 --- --- 0,137 0,063 0,135 0,03 0,028 0,098 0,08 0,075 0,002 0,137 0,002 0,002
13.2 --- --- --- 0,017 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
14 0,018 --- --- 0,204 0,078 0,013 0,01 0,002 0,03 0,007 0,027 0,295 0,157 --- ---
15 0,352 --- --- 0,202 0,095 0,002 --- 0,002 0,003 0,003 0,005 0,025 0,178 --- ---
16 0,345 --- --- 0,166 0,057 --- --- --- --- 0,002 0,008 0,128 0,082 --- 0,002
17 0,210 --- --- 0,077 0,067 --- --- --- --- --- 0,002 0,257 0,015 --- 0,003
18 0,060 --- --- 0,037 0,048 --- --- --- --- --- --- 0,173 0,002 --- 0,017
19 0,012 --- --- 0,037 0,04 --- --- --- --- --- --- 0,095 --- --- 0,092
20 --- --- --- 0,025 0,02 --- --- --- --- --- --- 0,02 --- --- 0,053
21 --- --- --- 0,017 0,015 --- --- --- --- --- --- 0,003 --- --- 0,122
21.2 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,012
22 --- --- --- 0,005 0,012 --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,17
22.2 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,012
23 --- --- --- 0,007 0,008 --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,131
23.2 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,022
24 --- --- --- 0,002 0,007 --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,151
24.2 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,017
25 --- --- --- 0,003 0,002 --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,085
25.2 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,007
26 --- --- 0,002 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,075
27 --- --- 0,002 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,022
27.2 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,002
28 --- --- 0,055 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,002
28.2 --- --- 0,005 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
29 --- --- 0,268 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
30 --- --- 0,231 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
30.2 --- --- 0,02 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
31 --- --- 0,077 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
31.2 --- --- 0,065 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
32 --- --- 0,012 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
32.2 --- --- 0,193 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
33 --- --- 0,007 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
33.2 --- --- 0,055 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
34.2 --- --- 0,008 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
OH 0,670 0,74 0,803 0,823 0,897 0,77 0,797 0,75 0,797 0,763 0,813 0,803 0,847 0,593 0,867
EH 0,709 0,72 0,82 0,857 0,885 0,78 0,793 0,753 0,789 0,734 0,821 0,791 0,856 0,605 0,889
EH_SE 0,026 0,026 0,022 0,02 0,018 0,024 0,023 0,025 0,024 0,026 0,022 0,023 0,02 0,028 0,018
PD 0,862 0,877 0,945 0,964 0,978 0,917 0,927 0,905 0,923 0,885 0,947 0,925 0,962 0,786 0,978
PE 0,450 0,474 0,65 0,719 0,774 0,574 0,599 0,532 0,591 0,494 0,653 0,594 0,716 0,308 0,78
CHI 5,18 3,36 3,48 6,43 11,35 2,42 5,84 6,6 5,44 1,4 12,32 12,69 14,41 1,46 18,49
CHI(c) 7,81 7,81 7,81 12,59 12,59 12,59 18,31 12,59 18,31 7,81 18,31 18,31 32,67 7,81 25
p1 0,498 0,936 0,199 0,099 0,171 0,200 0,269 0,167 0,939 0,818 0,343 0,195 0,541 0,691 0,376
Bảng 3.5. Tần suất alen và các chỉ số thống kê của 15 locus STR trên NST thường ở quần thể người Mường (N=104)
Alen D3S1358 TH01 D21S11 D18S51 Penta_E D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1P0 Penta_D vWA D8S1179 TPOX FGA
5 --- --- --- --- 0,029 --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
6 --- 0,106 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
7 --- 0,365 --- --- --- 0,014 --- 0,019 --- 0,029 0,024 --- --- 0,005 ---
8 --- 0,029 --- --- --- --- 0,403 0,154 --- --- 0,072 --- --- 0,602 ---
9 --- 0,385 --- --- --- 0,043 0,082 0,043 0,188 0,010 0,289 --- --- 0,072 ---
13
Bảng 3.6. Tần suất alen và các chỉ số thống kê của 15 locus STR trên NST thường ở quần thể người Khmer (N=110)
Alen D3S1358 TH01 D21S11 D18S51 Penta_E D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1P0 Penta_D vWA D8S1179 TPOX FGA
5 --- --- --- --- 0,027 --- --- --- --- --- --- --- --- 0,005 ---
6 --- 0,105 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
7 --- 0,286 --- --- 0,018 0,023 --- 0,005 --- 0,005 0,018 --- --- --- ---
8 --- 0,055 --- --- --- 0,005 0,382 0,141 0,014 --- 0,082 --- --- 0,564 ---
9 --- 0,359 --- --- 0,009 0,036 0,077 0,05 0,186 0,014 0,332 --- --- 0,114 ---
9.1 --- --- --- --- --- --- --- 0,005 --- --- --- --- --- --- ---
9.3 --- 0,109 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
10 --- 0,086 --- --- 0,032 0,286 0,118 0,217 0,132 0,281 0,132 --- 0,095 0,068 ---
10.1 --- --- --- --- --- --- --- 0,005 --- --- --- --- --- --- ---
14
Tóm lại: Bằng việc sử dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh, luận án đã tiến hành khảo
sát thành công sự phân bố tần suất alen cho 15 locus STR (D3S1358, TH01, D21S11, D18S51,
Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, vWA, D8S1179, TPOX và
FGA) ở ba quần thể nghiên cứu: người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội và thành phố Hồ
Chí Minh, khảo sát thu được 173 alen/15 locus; người Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa Bình,
khảo sát thu được 132 alen/15 locus và người Khmer (N=110) sống ở tỉnh Sóc Trăng, khảo sát
thu được 145 alen/15 locus. Kết quả nghiên cứu này, đã bổ sung vào CSDL tần suất alen 15
15
locus STR nghiên cứu ở quần thể người Việt Nam là 32 alen mới so với nghiên cứu trước đây
của tác giả Shimada và các đồng nghiệp [103]. Các giá trị tần suất alen và các chỉ số thống kê
cho thấy 15 locus STR sử dụng trong nghiên cứu này đều là các locus STR có tính đa hình cao,
có thể sử dụng tốt trong phân tích ADN nhận dạng cá thể, xác định huyết thống và trong nghiên
cứu di truyền quần thể. Sự phân bố tần suất alen của 15 locus STR nghiên cứu thu được từ thực
nghiệm hoàn toàn phù hợp với định luật Hardy-Weinberg ở trạng thái cân bằng theo tiêu chuẩn
2 với độ tin cậy 95%. Điều này được thể hiện ở các giá trị CHI tính toán từ thực nghiệm của 15
locus STR này ở mỗi quần thể nghiên cứu đều nhỏ hơn các giá trị CHI(c) tương ứng. Ngoài ra,
giá trị xác suất trong kiểm định theo định luật Hardy-Weinberg của mỗi locus (p1) cũng được
xác định (xem Bảng 3.4; 3.5 và 3.6).
3.2.2. Mối quan hệ di truyền giữa ba quần thể nghiên cứu với một số quần thể khác trên thế
giới
Từ dữ liệu tần suất alen 13 locus STR thuộc bộ CODIS (do FBI-Mỹ lựa chọn) của ba
quần thể nghiên cứu (người Kinh; người Mường và người Khmer) và 14 quần thể tham khảo
[26, 52, 71, 72, 84, 98, 103, 119, 121, 122], đã xây dựng được cây phả hệ di truyền theo
phương pháp neighbor-joining bằng phần mềm POPTREE2 [109]. Cây phả hệ di truyền này, đã
phản ánh được mối quan hệ di truyền giữa 3 quần thể nghiên cứu với 14 quần thể tham khảo
dựa trên các giá trị khoảng cách di truyền chuẩn của Nei (DST) giữa các quần thể với nhau (xem
Hình 3.19). Kết quả nghiên cứu này đã đáp ứng được mục đích mong đợi và cho thấy rằng từ
dữ liệu tần suất alen của các locus STR nằm trên NST thường có thể sử dụng tốt cho các nghiên
cứu về mối quan hệ di truyền giữa các quần thể người khác nhau trên trên thế giới (mặc dù các
quần thể này hoàn toàn cách ly về địa lý) hoặc các quần thể phân nhỏ (các quần thể người dân
tộc) cùng sống trên lãnh thổ của một quốc gia.
Hình 3.19. Cây phả hệ di truyền giữa ba quần thể nghiên cứu với 14 quần thể
Iraqi-Iraq
African-USA
Caucasian-USA
Hispanic-USA
Kinh-VN
Muong-VN
Vietnamese
Thai
Malay-Sing
Khmer-VN
Manchu-TQ
Chinese-Sing
Han-TQ
Hui-TQ
Japanese
Korean
Indian-Sing
0.01
16
3.3. Kết quả ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong phân tích ADN nhận
dạng cá thể ngƣời
3.3.1. Kết quả ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong một số vụ án
Việc ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang để truy nguyên cá thể và truy tìm
tung tích nạn nhân từ các mẫu dấu vết sinh phẩm thu được từ hiện trường của một số vụ án tiêu
biểu do Phòng PC54 - CATP Hải Phòng cung cấp như sau:
Trường hợp 01 (vụ án mạng):
Mẫu phân tích do Phòng PC54 - CATP Hải Phòng cung cấp bao gồm: (1) Dấu vết máu
dính trên dao bàu (DV_MÁU_DAO) và (2) mẫu máu của nạn nhân (MÁU_NN).
Kết quả phân tích được thể hiện ở Bảng 3.8 như sau:
Bảng 3.8. Kết quả phân tích ADN từ mẫu DV_MÁU_DAO và mẫu MÁU_NN trong một vụ
án mạng xảy ra tại quận Lê Chân, Tp. Hải Phòng bằng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh
quang.
LOCUS DV_MÁU_DAO MÁU_NN
TẦN SUẤT KIỂU GEN
(2pq hoặc p2 hoặc q2)
(Tính theo dữ liệu tần suất alen
của người Kinh, N=300)
D3S1358 16 17 16 17 0,1449
TH01 7 9 7 9 0,2461
D21S11 30 32.2 30 32.2 0,0892
D18S51 13 21 13 21 0,0047
Penta E 11 16 11 16 0,0287
D5S818 11 13 11 13 0,0824
D13S317 11 13 11 13 0,0127
D7S820 11 12 11 12 0,1627
D16S539 11 13 11 13 0,0564
CSF1PO 10 12 10 12 0,1422
Penta D 9 10 9 10 0,0952
Amelogenin X Y X Y 1,0000
vWA 16 16 16 16 0,0164
D8S1179 12 15 12 15 0,0392
TPOX 8 11 8 11 0,3058
FGA 24.2 24.2 24.2 24.2 0,0003
TẦN SUẤT KIỂU GEN KẾT HỢP 16 LOCUS: 0,0000000000000000000031
17
ĐỘ TIN CẬY (CI): 99,99999999999999999969%
Từ kết quả được nêu trong Bảng 3.8 cho thấy: Mẫu DV_MÁU_DAO và MÁU_NN là
của cùng một người với độ tin cậy là 99,99999999999999999969%. Điều này có nghĩa là dao
bàu chính là hung khí mà đối tượng đã sử dụng để gây án. Từ kết quả này, qua công tác nghiệp
vụ điều tra, cơ quan Cảnh sát Điều tra của quận Lê Chân đã bắt được đối tượng gây án chịu tội
trước pháp luật.
Trường hợp 02 (vụ án hiếp dâm trẻ em):
Mẫu phân tích do Phòng PC54 - CATP Hải Phòng cung cấp bao gồm: (1) Dấu vết tinh
dịch thu được trên quần lót của nạn nhân (DV_Q. LÓT_NN); (2) mẫu máu của đối tượng nghi
vấn 01 (MÁU_ĐT_01); (3) mẫu máu của đối tượng nghi vấn 02 (MÁU_ĐT_02) và (4) mẫu
máu của nạn nhân (MÁU_NN).
Kết quả phân tích được thể hiện ở Bảng 3.9 như sau:
Bảng 3.9. Kết quả phân tích ADN từ mẫu DV_Q. LÓT_NN và mẫu MÁU_ĐT_01 trong một
vụ án hiếp dâm xảy ra tại quận Dương Kinh, Tp. Hải Phòng bằng bộ kit PCR 16 locus gắn
huỳnh quang.
LOCUS DV_Q. LÓT_NN MÁU_ĐT_01
TẦN SUẤT KIỂU GEN
(2pq hoặc p2 hoặc q2)
(Tính theo dữ liệu tần suất alen
của người Kinh, N=300)
D3S1358 16 16 16 16 0,1190
TH01 7 9 7 9 0,2461
D21S11 30 30 30 30 0,0534
D18S51 13 14 13 14 0,0559
Penta E 14 14 14 14 0,0061
D5S818 10 12 10 12 0,1046
D13S317 11 11 11 11 0,0445
D7S820 8 12 8 12 0,0571
D16S539 12 13 12 13 0,0435
CSF1PO 10 12 10 12 0,1422
Penta D 11.2 12 11.2 12 0,0449
Amelogenin X Y X Y 1,0000
vWA 14 16 14 16 0,0755
D8S1179 13 13 13 13 0,0375
TPOX 8 11 8 11 0,3058
FGA 18 23 18 23 0,0045
TẦN SUẤT KIỂU GEN KẾT HỢP 16 LOCUS: 0,00000000000000000015
ĐỘ TIN CẬY (CI): 99,999999999999999985%
Từ kết quả được nêu trong Bảng 3.9 cho thấy: Kiểu gen 16 locus thu được từ mẫu
DV_Q. LÓT_NN hoàn toàn trùng khớp với kiểu gen 16 locus của mẫu MÁU_ĐT_01. Điều
này có nghĩa là: Mẫu DV_Q. LÓT_NN và mẫu MÁU_ĐT_01 là của cùng một người với độ tin
18
cậy là 99,999999999999999985%. Từ kết quả này, qua công tác nghiệp vụ điều tra đối tượng
tình nghi 01 đã khai nhận với cơ quan Cảnh sát điều tra và chịu tội trước pháp luật.
Trường hợp 03 (vụ án truy tìm tung tích nạn nhân):
Mẫu phân tích do Phòng PC54 - CATP Hải Phòng cung cấp bao gồm: (1) 02 răng cửa
của một xác chết chưa rõ tung tích (RĂNG_NN) và (2) mẫu máu của bà Đặng Thị L
(MÁU_ĐTL).
Kết quả phân tích được thể hiện ở Bảng 3.10 như sau:
Bảng 3.10. Kết quả phân tích ADN từ mẫu RĂNG_NN và mẫu MÁU_ĐTL trong một vụ án
truy tìm tung tích nạn nhân xảy ra tại phường Anh Dũng, quận Dương Kinh, Tp. Hải Phòng
bằng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang.
LOCUS RĂNG_NN MÁU_ĐTL
MI
(Tính theo dữ liệu tần suất alen của
người Kinh, N=300)
D3S1358 14 15 15 17 0,7175
TH01 7 9 7 9 1,4410
D21S11 31.2 32.2 31 31.2 3,8226
D18S51 13 15 15 17 2,1716
Penta E 13 17 11 13 4,3398
D5S818 10 12 10 12 3,1342
D13S317 8 8 8 8 3,1466
D7S820 8 10 10 11 1,4326
D16S539 9 11 9 11 1,9334
CSF1PO 10 11 10 14 1,2065
Penta D 9 12 9 12 3,5818
Amelogenin X X X X 1,0000
vWA 19 19 14 19 4,7223
D8S1179 13 15 13 14 1,7078
TPOX 9 11 8 11 0,9171
FGA 19 21 19 25.2 4,0867
CMI: 106.376
XÁC SUẤT QUAN HỆ HUYẾT THỐNG MẸ-CON: 99,999%
Từ kết quả được nêu trong Bảng 3.10 cho thấy: Kiểu gen 16 locus thu được từ mẫu so
sánh MÁU_ĐTL và RĂNG_NN đều thấy có sự cho-nhận các alen ở cả 16 locus tương ứng.
Điều này có nghĩa là: Bà Đặng Thị L là mẹ đẻ của tử thi nạn nhân với xác suất quan hệ mẹ-con
là 99,999%. Từ kết quả này, cơ quan Cảnh sát Điều tra - Công an quận Dương Kinh đã làm thủ
tục cho gia đình bà Đặng Thị L nhận tử thi nạn nhân về để làm các thủ tục cho người đã chết.
3.3.2. Kết quả ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang phân tích một số loại dấu vết
ADN thu được từ 10 đối tượng cần KSAN
Việc xác lập hồ sơ ADN cá nhân từ 30 mẫu dấu vết ADN thử nghiệm thu được từ 10 đối
tượng cần KSAN bằng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang, cho tỷ lệ thành công khác nhau
đối với từng loại mẫu dấu vết: Mẫu đầu mẩu thuốc lá và ống hút cho tỷ lệ thành công cao nhất
tương ứng là 8/9 và 4/5 mẫu phân tích; mẫu tăm bông thu từ miệng cốc-chén cho tỷ lệ thành
19
công là 5/9; mẫu dao cạo râu cho tỷ lệ thành công là 2/4 mẫu phân tích và mẫu bàn chải đánh
răng cho tỷ lệ thành công thấp nhất là 1/3. Hồ sơ ADN cá nhân gồm 16 locus nghiên cứu của
9/10 đối tượng cần KSAN đã được xác lập và được nêu ở Bảng 3.12 như sau:
3.3.3. Kết quả ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang để làm thẻ ADN cá nhân
phục vụ công tác an ninh và dân sinh
Bằng việc sử dụng bộ kit PCR 16 gen gắn huỳnh quang, luận án đã làm được 1.000 thẻ
ADN cá nhân thử nghiệm có kích thước, chất liệu giống với mẫu thẻ nhựa CMND hiện đang
lưu hành phục vụ cho công tác an ninh và dân sinh (xem Hình 3.20). Thẻ ADN này được thiết
kế họa tiết vân nền bảo an chống làm giả cao, có kích thước quy chuẩn với hình ảnh và các
thông tin trên bề mặt thẻ được bố trí hợp lý đảm bảo yếu tố thẩm mỹ cao.
Hình 3.20. Mô tả mặt trước và mặt sau của mẫu thẻ ADN cá nhân thử nghiệm.
I: Mặt trước của thẻ ADN cá nhân với các thông tin: Tên thẻ, mã số thẻ, ảnh chủ thẻ và các thông tin
cá nhân (tên chủ thẻ, ngày sinh, dân tộc, quê quán và nơi trường trú).
II: Mặt sau của thẻ ADN cá nhân với thông tin về mã vạch và đặc điểm nhận dạng ADN gồm 16 locus
(D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta
D, Amelogenin, vWA, D8S1179, TPOX và FGA)
I II
Bảng 3.12. Kết quả phân tích kiểu gen 16 locus của 10 đối tượng cần KSAN bằng bộ kit PCR 16
locus gắn huỳnh quang
Mẫu
D3
S1
35
8
TH
01
D2
1S
11
D1
8S
51
Pen
ta E
D5
S8
18
D1
3S
31
7
D7
S8
20
D1
6S
53
9
CS
F1
PO
Pen
ta D
Am
el
vW
A
D8
S1
17
9
TP
OX
FG
A
ĐT_01_DCR 18
18
9
10
28
29
14
16
11
14
11
12
8
12
11
12
11
12
10
11
9
12
X
Y
14
16
10
13
8
11
21
23
ĐT_02_TB 16
17
7
8
31
32.2
13
16
10
11
7
12
9
12
11
12
12
12
11
13
11
12
X
Y
14
17
10
10
9
11
22
23
ĐT_03_DCR 15
15
6
6
32.2
33.2
17
17
11
18
10
12
9
11
11
13
9
11
12
14
10
11
X
Y
14
14
11
14
8
8
22
26
ĐT_04_TB 14
17
6
7
32.2
32.2
12
15
10
10
11
12
8
13
8
11
9
12
11
11
10
11
X
Y
17
18
12
15
8
8
22
22
ĐT_05_BC 16
17
7
9
30
31.2
20
21
12
19
11
12
8
12
12
12
9
12
10
10
8
10
X
Y
14
17
10
15
8
8
22
22
ĐT_06_TB 16
17
7
9
30
30
15
16
10
12
10
11
10
12
11
12
9
11
11
12
8
9
X
Y
14
16
11
13
8
9
26
26
ĐT_07_OH Nhiễm mẫu trong quá trình thu mẫu
ĐT_08_TL 16
17
7
9
30
30
20
21
12
19
11
12
8
12
8
12
9
12
10
10
8
10
X
Y
14
17
10
12
15
8
8
22
22
ĐT_09_TL 15
17
6
7
29
29
13
17
14
16
10
11
12
12
10
11
9
14
10
11
10
13
X
Y
14
18
14
16
8
9
22
22
ĐT_10_OH 15
17
7
7
32.2
32.2
14
16
9
18
11
12
8
9
11
12
11
12
9
11
9
11
X
X
16
17
10
10
8
11
19
21
20
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN:
1. Đã chế tạo thành công bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh trên hệ thống điện di mao quản. Bộ
kit này đã được thử nghiệm đánh giá tại 02 PTN phân tích ADN của Viện Khoa học Hình sự
- Bộ Công an và Viện Pháp Y Quân đội - Bộ Quốc phòng, cho kết quả về độ nhạy và độ đặc
hiệu tương đương với các bộ kit thương mại cùng loại (PowerPlex 16 HS System và
AmpFlSTR Identifiler PCR amplification) trên cùng một mẫu ADN thử nghiệm là
9947A.
2. Đã xây dựng được bảng tần suất alen và các chỉ số thống kê nhận dạng cá thể người cho 15
locus (D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539,
CSF1PO, Penta D, vWA, D8S1179, TPOX và FGA) ở người Kinh (N=300) sống ở khu vực
Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh; người Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa Bình và người
Khmer (N=110) sống ở tỉnh Sóc Trăng. Kết quả nghiên cứu này đã bổ sung vào CSDL 15
locus STR nghiên cứu ở quần thể người Việt Nam là 32 alen mới so với kết quả nghiên cứu
trước đây của tác giả Shimada và các đồng nghiệp [103].
3. Đã xây dựng được cây phả hệ di truyền theo phương pháp neighbor-joining bằng phần mềm
POPTREE 2 [109] dựa trên dữ liệu tần suất alen của 13 locus thuộc bộ CODIS (do FBI-Mỹ
lựa chọn) của ba quần thể nghiên cứu và 14 quần thể tham khảo. Cây phả hệ này đã phản
ánh được mối quan hệ di truyền giữa ba quần thể nghiên cứu với 14 quần thể khác nhau trên
thế giới. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra được người Kinh và người Mường có quan hệ gần
gũi với nhau hơn so với người Khmer dựa trên giá trị khoảng cách di truyền chuẩn của Nei
(DST).
4. Đã ứng dụng thành công bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang để phân tích ADN nhận
dạng cá thể người (giám định ADN) tại Việt Nam bằng việc truy nguyên cá thể người từ các
dấu vết sinh phẩm thu được tại hiện trường của một số vụ án (dấu vết máu và tinh trùng) với
độ tin cậy cao (≥ 99,999999999999999985%); truy tìm tung tích nạn nhân từ mẫu răng cửa
của tử thi nạn nhân qua mối quan hệ huyết thống mẹ-con với xác suất quan hệ là 99,999%;
đã thiết lập được 9/10 hồ sơ ADN cá nhân của 10 đối tượng cần KSAN và đã làm được
1.000 thẻ ADN cá nhân thử nghiệm phục vụ công tác an ninh và dân sinh.
KIẾN NGHỊ:
Tiếp tục ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang này trong nghiên cứu di truyền
quần thể ở các quần thể người dân tộc khác nhau; phân tích các loại mẫu dấu vết sinh phẩm
khác nhau thường gặp ở hiện trường của các vụ án và xây dựng CSDL nhận dạng ADN (tàng
thư) cho các đối tượng khác nhau như: tội phạm, các đối tượng làm việc trong các ngành nghề
21
đặc thù có nguy cơ rủi do cao (phi công, tiếp viên hàng không, ngư dân, thợ mỏ…), người mất
tích, chết vô tung tích… để phục vụ công tác quản lý và công tác giám định.
22
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH
ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Lương Thị Yến, Lê Thị Bích Trâm, Trần Trọng Hội, Bùi Nguyên Hải, Nguyễn Thị Thu
Hoài (2012), “Nghiên cứu tối ưu thành phần PCR sử dụng 16 cặp mồi gắn huỳnh quang trên
hệ thống điện di soi gel huỳnh quang Pharos® FX”, Tạp chí Khoa học Công nghệ & Môi
trường Công an, Số 29 tháng 10/2012, tr. 51-55 (ISSN: 1859-4514).
2. Lê Thị Bích Trâm, Trần Trọng Hội, Bùi Nguyên Hải, Nguyễn Thị Thu Hoài (2012),
“Nghiên cứu phân tích mẫu dấu vết ADN thử nghiệm trên một số vật mang trong điều kiện
phòng thí nghiệm”, Tạp chí Khoa học Công nghệ & Môi trường Công an, Số 30 tháng
11/2012, Tr. 42-45 (ISSN: 1859-4514).
3. Trần Trọng Hội, Lê Thị Bích Trâm, Trịnh Đình Đạt, Nguyễn Văn Hà (2013), “Nghiên
cứu tối ưu thành phần mutiplex PCR cho 16 cặp mồi gắn huỳnh quang trên hệ thống điện di
mao quản”, Tạp chí Phân tích Hóa-Lý và Sinh học, T-18 - Số 3/2013, tr. 29-34 (ISSN:
0868-3224).
4. Trần Trọng Hội, Lê Thị Bích Trâm, Phạm Đăng Khoa, Hồ Quang Huy, Trịnh Đình Đạt,
Nguyễn Văn Hà (2015), “Khảo sát tần suất alen của 15 locus STR trên nhiễm sắc thể
thường trong quần thể người Mường sống ở tỉnh Hòa Bình, Việt Nam”, Tạp chí Phân tích
Hóa-Lý và Sinh học, T-20 - Số 3/2015, tr. 208-214 (ISSN: 0868-3224).
5. Trần Trọng Hội, Trần Thị Hạnh, Phạm Đăng Khoa, Hồ Quang Huy, Trịnh Đình Đạt,
Nguyễn Văn Hà (2015), “Sự đa dạng di truyền của 15 locus STR trên nhiễm sắc thể thường
trong quần thể người Khmer sống ở tỉnh Sóc Trăng, Việt Nam”, Tạp chí Phân tích Hóa-Lý
và Sinh học, T-20 - Số 4/2015, tr. 152-160 (ISSN: 0868-3224).
Related Documents
