ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------------------------- Vũ Thị Hoa Phƣợng NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẬP CHỐNG CHỊU HẠN HÁN CỦA KHOAI TÂY (Solanum tuberosum L.) Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2015
25
Embed
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẬP CHỐNG CHỊU HẠN HÁN CỦA ...
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------------------
Vũ Thị Hoa Phƣợng
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG
TẬP CHỐNG CHỊU HẠN HÁN CỦA KHOAI TÂY
(Solanum tuberosum L.)
Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14
TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2015
Công trình được hoàn thành tại:
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội
Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Quỳnh Mai
Phản biện 1: TS. Lê Thị Nguyên Bình
Phản biện 2: TS. Phạm Thị Lý Thu
Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc sĩ họp tại:
Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên.
Vào hồi 14 giờ 00 ngày 3 tháng 2 năm 2016.
Có thể tìm hiểu luận văn tại:
- Trung tâm thư viện Đại học Quốc gia Hà Nội
1
MỞ ĐẦU
Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là thành phần quan trọng trong hệ
thống lương thực thế giới (FAO). Ở Việt Nam, các nghiên cứu về khoai tây tập
trung chủ yếu vào việc khảo nghiệm, lai giống, tạo củ nhỏ và một số bệnh cây
hầu như chưa có nghiên cứu nào về cơ chế tập chống chịu của loại cây này
trước các điều kiện phi sinh học. Trên cơ sở đó, chúng tôi lựa chọn đề tài:
“Nghiên cứu khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây (Solanum
tuberosum L.)”.
Các nghiên cứu trong luận văn này nằm trong đề tài “Nghiên cứu các mối
liên quan giữa khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố nhiệt độ
cao, hạn hán, độ mặn cao” được Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc
gia (NAFOSTED) tài trợ với mã số 106.06-2012.14.
Các mục tiêu được đặt ra cho đề tài như sau:
- Đánh giá khả năng tập chống chịu hạn của khoai tây giống.
- Xác định cường độ hạn trong giai đoạn tập chống chịu cho hiệu quả
nâng cao khả năng chống chịu hạn của khoai tây.
- Đánh giá sự thay đổi hàm lượng proline, một chất điều hòa thẩm thấu
trong tế bào được coi là chỉ thị cho quá trình đáp ứng bất lợi về áp suất thẩm
thấu của thực vật, ở cây khoai tây đã qua tập chống chịu hạn.
- Xác định biểu hiện một số gen yếu tố phiên mã ở khoai tây tương đồng
với các gen liên quan đến khả năng đáp ứng với hạn ở A. thaliana.
2
Chƣơng 1- TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về khoai tây
1.1.1. Nguồn gốc lịch sử
Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là cây thân thảo, có củ thuộc họ
cà, có nguồn gốc ở vùng cao nguyên thuộc dãy núi Andes (Nam Mỹ) ở độ cao
2000-5000m.
1.1.2. Phân loại học
Phân loại học của khoai tây trong hệ thống học thực vật (USDA, NRCS,
2010):
Giới: Plantae (plants)
Ngành: Magnoliophyta (flowering plants)
Lớp: Magnoliopsida (dicotyledons)
Bộ: Solanales
Họ: Solanaceae
Chi: Solanum L.
Loài: Solanum tuberosum L.
1.1.3. Đặc điểm của cây khoai tây
Thân cây khoai tây là một hệ thống gồm thân, tia củ và củ. Lá khoai tây là
lá kép lông chim, không đối xứng. Hoa khoai tây mọc thành chùm, là hoa lưỡng
tính. Khoai tây là cây tự thụ phấn nhưng cũng có trường hợp giao phấn. Sau
thời kỳ ra hoa, một vài loài kết quả.
1.1.4. Vai trò của khoai tây
Khoai tây là thực phẩm cung cấp năng lượng và là nguồn dinh dưỡng có
giá trị. Ngoài việc dùng khoai tây làm lương thực và thực phẩm, các nước phát
triển sử dụng khoai tây làm thức ăn cho gia súc. Bên cạnh đó, khoai tây còn
được dùng nhiều trong công nghiệp sản xuất axit hữu cơ như axit lactic, axit
xitric; các dung môi hữu cơ như ethanol, butanol, xeton, …
1.2. Hạn và đáp ứng của thực vật ở cạn trƣớc điều kiện hạn
Ngày nay, do biến đổi khí hậu toàn cầu, hiện tượng hạn, mặn, úng, nóng,
lạnh, … (các yếu tố cực đoan phi sinh học, abiotic stress) xảy ra ngày càng
3
nhiều. Trong đó, hạn là một trong các yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn nhất tới
sinh trưởng và năng suất cây trồng.
1.2.1. Đặc điểm thích nghi của thực vật chịu hạn
Tính chịu hạn của những thực vật ở cạn hạn sinh có bản chất di truyền,
thể hiện ra ở các thích nghi về hình thái và sinh lý.
1.2.2. Ảnh hưởng của hạn đến sinh trưởng và phát triển của thực vật
Ảnh hưởng của hạn đến sự sinh trưởng và hấp thu nước
Đáp ứng đầu tiên của thực vật đối với điều kiện bất lợi gây ra bởi hạn là
ngừng sinh trưởng. Sự hạn chế sinh trưởng xảy ra ở chồi, ở rễ. Trong điều kiện
hạn, các phân tử carbohydrate cung cấp cho quá trình sinh trưởng trong điều kiện
bình thường được dùng cho sinh trưởng rễ hoặc để tổng hợp các chất điều chỉnh
thẩm thấu.
Ảnh hưởng của hạn đến quang hợp
Sự thiếu hụt nước đã làm tăng cường tổng hợp ABA. Sự hạn chế carbon
dioxide do kéo dài thời gian đóng khí khổng dẫn đến sự tích lũy các hợp chất
làm giảm khả năng vận chuyển electron, làm giảm các phân tử oxy và tăng
cường các dạng ROS. Các phân tử bị oxy hóa bởi ROS có thể bị biến đổi cấu
trúc và cơ chế tổng hợp, gây rối loạn phản ứng sinh lý, sinh hóa nội bào, dẫn
đến sai hỏng hoặc mất chức năng, thậm chí gây chết tế bào.
Ảnh hưởng của hạn đến hô hấp nội bào
Trong điều kiện hạn, các quá trình mà chúng sửa dụng sản phẩm của hô
hấp bị ảnh hưởng và dẫn đến sự tăng cường hô hấp.
Ảnh hưởng của hạn đến hormone
Khi thiếu nước, ABA được tổng hợp ở rễ và vận chuyển lên lá làm khí
khổng đóng lại và cản trở quá trình sinh trưởng của thực vật. Bên cạnh sự tăng
cường hàm lượng ABA, hàm lượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực vật
chống chịu với hạn. Sự giảm nhanh chóng hàm lượng zeatin và gibberellin nội
sinh cũng đã xảy ra ở lá ngô để đối phó với hạn. Bên cạnh đó, hàm lượng và
khả năng hoạt động của cytokinin cũng giảm trong điều kiện hạn.
Brassinosteroid (BR) cũng đã được báo cáo rằng có khả năng bảo vệ thực vật
chống lại nhiều yếu tố bất lợi phi sinh học.
4
1.2.3. Đáp ứng hạn của thực vật
Thực vật đáp ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường qua 2 con đường:
phụ thuộc ABA và không phụ thuộc ABA. Các tín hiệu được dẫn truyền đến
nhân gây ra sự tăng cường biểu hiện của các gen mã hóa yếu tố phiên mã. Các
yếu tố phiên mã gây ra sự tăng cường biểu hiện của các gen liên quan đến tính
chống chịu. Các đáp ứng này sẽ bị mất đi khi điều kiện bất lợi mất đi.
1.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng hạn đến khoai tây
Hạn thường tác động mạnh ở 3 giai đoạn: sinh trưởng sinh dưỡng, phình
to củ và chín.Đã có những nghiên cứu chứng minh sự đáp ứng hạn của khoai tây
có liên quan đến biểu hiện gen. Khoai tây tăng cường biểu hiện gen StMYB1R-1
cho khả năng chống chịu cao với hạn mà đồng thời lại không ảnh hưởng tới các
tính trạng nông học khác. Trong điều hiện hạn khoai tây tăng cường biểu hiện
của một số gen mã hóa yếu tố phiên mã họ NAC.
1.4. Tính tập chống chịu của thực vật
Khả năng tập chống chịu (acclimation) với yếu tố bất lợi từ môi trường
của thực vật cho phép thực vật tăng cường tính chống chịu với các điều kiện bất
lợi ở ngưỡng lớn sau giai đoạn được tiếp xúc với các điều kiện bất lợi ở ngưỡng
nhỏ và vừa.
Hình 1.3. Sơ đồ đơn giản của một quá trình nhận, truyền tín hiệu gây ra đáp
ứng tập chống chịu
5
Cơ chế tập chống chịu được biết đến bao gồm cơ chế nhận tín hiệu từ các
biểu hiện bất lợi từ môi trường, tiếp đến là quá trình truyền tín hiệu đó từ “cảm
biến” vào nhân. Trong nhân, một số gen đặc hiệu liên quan đến việc đáp ứng lại
với yếu tố bất lợi sẽ được hoạt hóa và các protein được biểu hiện các đáp ứng
thích hợp (Hình 1.3). Các đáp ứng đó sẽ đảm bảo tái lập cân bằng nội môi trong
tế bào, bảo vệ chức năng màng sinh chất và protein nhằm chống chịu lại điều
kiện bất lợi. Rất nhiều gen được hoạt hóa theo chiều hướng giữ cân bằng trao
đổi nước và các ion của tế bào, bảo vệ chức năng các chaperone, giảm oxi hóa
và bảo vệ áp suất thẩm thấu. Riêng trong cơ chế cân bằng thẩm thấu của mô, tế
bào, các cây có xu hướng tăng sinh proline và một số loại đường như galactinol,
glucose, fructose, sucrose, raffinose những chất này được biết đến là các chất
bảo vệ thẩm thấu khi thực vật cần chống lại những bất lợi từ môi trường. Những
hoạt động đáp ứng qua gen biểu hiện như thế của thực vật đa phần được điều
hòa qua các yếu tố phiên mã.
Các cơ chế liên quan đến quá trình đáp ứng của thực vật với các yếu tố
bất lợi từ môi trường từ lâu đã trở thành tâm điểm của các nghiên cứu về sinh
học nói chung và thực vật nói riêng [21]. Đề tài “Nghiên cứu tính tập chống
chịu hạn hán của khoai tây (Solanum tuberosum L.)” được thực hiện theo định
hướng đó và mong muốn góp phần tìm hiểu thêm về sức sống của thực vật
trong các biến đổi của môi trường.
6
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu tính tập chống chịu hạn được tiến hành trên cây khoai tây có
nguồn gốc từ hạt, giống HH7.
2.1.2. Hóa chất
2.1.3. Thiết bị
2.2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp vào mẫu, nuôi cấy in vitro và tạo tập chống chịu
Hạt khoai tây giống HH7 được khử trùng và được gieo trên môi trường
khoáng cơ bản Murashige & Skoog (MS, 1962), có bổ sung 30g/l sucrose, 7g/l
agar và sorbitol với hàm lượng khác nhau. Các nồng độ sorbitol sử dụng là: 0
mM; 50 mM; 100 mM; 200 mM. Tỷ lệ nảy mầm của hạt được đánh giá và các
hạt nảy mầm trên môi trường có bổ sung sorbitol được coi là đã qua giai đoạn
tập chống chịu.
2.2.2. Phương pháp cấy chuyển mẫu và đánh giá các chỉ số sinh lý
Sau 30 ngày gieo hạt, cắt lấy phần thân cây con có chiều cao 1,5 cm mang
2 lá chuyển sang môi trường có nồng độ sorbitol tương đương với giai đoạn nảy
mầm và cao hơn (Hình 2.2).
Hình 2.2. Sơ đồ cấy chuyển mẫu sau khi gieo trên các môi trường tập chống chịu
7
Sau 4 - 6 tuần, tiến hành đánh giá khả năng tập chống chịu bằng cách so
sánh giữa mẫu đã qua tập chống chịu và mẫu chưa qua tập chống chịu trong
từng nhóm TN, thông qua một số chỉ số: hệ số nhân chồi, chiều cao chồi, số lá,
số rễ, trọng lượng tươi, trọng lượng khô, hàm lượng Chl. và hàm lượng proline.
Hệ số nhân chồi
Hệ số nhân chồi = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖 𝑐ủ𝑎 𝑚ẫ𝑢
𝑆ố 𝑚ẫ𝑢 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑚ô𝑖 𝑡𝑟ườ𝑛𝑔
Chiều cao chồi
Chiều cao chồi = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑐ℎ𝑖ề𝑢 𝑐𝑎𝑜 𝑐á𝑐 𝑐ℎồ𝑖
𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖 𝑐ủ𝑎 𝑚ẫ𝑢 (cm)
Số lá
Số lá = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑙á
𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖
Số rễ
Số rễ trung bình=Tổng số rễ
Số chồi ch ính
Trọng lượng tươi và trọng lượng khô
Trọng lượng tươi = Tổng trọng lượng tươi của các mẫu
Tổng số mẫu
Trọng lượng khô = Tổng trọng lượng kh ô của các mẫu
Tổng số mẫu
2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll
Hàm lượng Chl. được xác định dựa theo phương pháp của của Robert J.
Porra [60]. Hàm lượng Chl. được tính toán theo công thức:
Chla (µg/ml) = [12.7 × (A664) – 2.69 × (A646)] × hệ số pha loãng
Chlb (µg/ml) = [22.9 × (A646) – 4.68 × (A664)] × hệ số pha loãng
2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng proline mẫu
Hàm lượng proline của mẫu được xác định bằng phương pháp so màu
(Bates và cs., 1973). Hàm lượng proline trong mẫu được tính toán bằng cách so
sánh với đường chuẩn.
8
Hình 2.3. Đường chuẩn proline
Công thức xác định nồng độ proline là:
x = (A520 + 0,001) / 0,007 (mM)
Nồng độ proline mM được quy ra hàm lượng µg/mg theo công thức:
Hàm lượng proline (µg/mg) = 𝑋∗𝑉∗𝐻𝑆𝑃𝐿
𝑚
Trong đó:
x: nồng độ proline (mM)
V: thể tích dịch chiết proline
(ml)
HSPL: hệ số pha loãng
m: khối lượng mẫu tươi
(mg)
2.2.5. Xác định biểu hiện của một số gen mã hóa cho yếu tố phiên mã ở khoai
tây (Solanum tuberosum L.) tương đồng với các gen liên quan đến khả năng
tập chống chịu ở Arabidopsis thaliana
Kết quả đánh giá khả năng tập chống chịu thông qua các chỉ số nuôi cấy
mô, hàm lượng Chl. và proline cho biết nồng độ sorbitol trong môi trường là 50
mM mang lại hiệu quả tập chống chịu hạn cao nhất cho khoai tây HH7. Tiến
hành xác định biểu hiện của một số gen mã hóa yếu tố phiên mã trong cây con
khoai tây thu được từ môi trường MS có bổ sung 50 mM sorbitol (mẫu TN) và
môi trường không có sorbitol ( mẫu ĐC).
y = 0.007x - 0.001
R² = 0.993
-0.1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 20 40 60 80 100 120
Độ h
ấp
th
ụ ở
520 n
m
Nồng độ proline (mM)
A520
Linear (A520)
9
2.2.5.1.Thu mẫu
Chồi khoai tây in vitro giống HH7 được cấy chuyển đồng thời trên môi
trường MS không có sorbitol và môi trường MS có bổ sung 50 mM sorbitol.
Thu mẫu ở 10 mốc thời gian: 0h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 12h, 24h, 72h và 120h.
2.2.5.2.Tách RNA tổng số
RNA tổng số được tách bằng TRIzol. RNA trong pha nước được hút ra
sau đó tủa bằng isopropanol và NaCl 2M, li tâm và rửa lại bằng ethalnol 70%
và sau đó thu hồi RNA tinh khiết.
2.2.5.3.Kiểm tra, định lượng và xác định độ tinh sạch RNA tổng số
RNA được kiểm tra sơ bộ bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose. Hàm
lượng RNA tổng số được xác định bằng máy đo quang phổ định lượng và chất
lượng được đánh giá sơ bộ qua đường cong hấp thụ. Các mẫu RNA có giá trị
A260/280 trong khoảng 2,0 và giá trị A260/230 > 1,8 là những mẫu RNA đạt tiêu
chuẩn.
2.2.5.4.Xử lý DNA
Để đảm bảo không còn lẫn DNA hệ gen trong cDNA sau này, mẫu được
xử lý bằng DNAse.
2.2.5.5.Tổng hợp cDNA
cDNA được tổng hợp theo bộ kit The Thermo Scientific RevertAid First
Strand cDNA Synthesis Kit.
2.2.5.6.Kiểm tra chất lượng cDNA
Chất lượng cDNA được kiểm tra bằng qPCR. Cặp mồi được sử dụng để
kiểm tra chất lượng cDNA là cặp mồi GAPDH 3’ (G3) và GAPDH 5’ (G5).
2.2.5.7.Chọn gen đích
2.2.5.8.Thiết kế mồi
2.2.5.9.Xác định tương quan mức độ biểu hiện
Gen tham chiếu và gen đích đã chọn được tiến hành qPCR với các cặp
mồi tương ứng.
2.2.5.10. Xử lý số liệu
Sử dụng phương pháp 2-ΔΔCt
của Livak và cs 2001 để xác định tương quan
mức độ biểu hiện giữa mẫu TN và mẫu ĐC.
10
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hƣởng của sorbitol đến tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây Hồng Hà
7
Kết quả cho thấy giống khoai tây đang nghiên cứu chịu ảnh hưởng rõ rệt
của điều kiện hạn. Khả năng nảy mầm của hạt giảm khi nồng độ sorbitol tăng
(Hình 3.1).
Hình 3.1. Tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây HH7 sau 30 ngày gieo trên
môi trường có bổ sung sorbitol
11
Hình 3.2. Cây khoai tây trên đĩa thạch sau 30 ngày gieo hạt
Quan sát các cây con khoai tây sau 30 ngày gieo hạt, ta thấy các cây con
trong môi trường có nồng độ sorbitol cao hơn nảy mầm chậm hơn và có thân
ngắn hơn (hình 3.2).
3.2. Đánh giá các chỉ số nuôi cấy mô sau giai đoạn tập chống chịu
3.2.1. Hệ số nhân chồi
Hệ số nhân chồi chịu ảnh hưởng không nhỏ của hàm lượng sorbitol tăng
cao trong môi trường nuôi cấy. Các mẫu chưa qua tập chống chịu khi chuyển
sang các môi trường có nồng độ sorbitol tăng có hệ số nhân chồi giảm dần. Các
mẫu đã qua tập chống chịu không thể hiện khả năng nhân chồi trong nuôi cấy
khi được chuyển sang các môi trường tiếp tục duy trì mức độ hạn nhân tạo hoặc
nâng cao mức hạn.
12
Hình 3.3: Hệ số nhân chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng
độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm
3.2.2. Chiều cao chồi
Hình 3.4. Chiều cao chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ
sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm
Ở những mẫu chưa qua tập chống chịu, chiều cao chồi trung bình chịu
ảnh hưởng lớn bởi hàm lượng sorbitol trong môi trường. Những mẫu đã qua tập
0
1
2
3
4
5
6
7
Hệ
số n
hân
ch
ồi
(lần
)
Nồng độ sorbitol trong các công thức chuyển môi trƣờng (mM)
4 tuần
6 tuần
0
2
4
6
8
10
12
Ch
iều
cao c
hồi
tru
ng b
ình
(cm
)
Nồng độ sorbitol trong các công thức chuyển môi trƣờng (mM)
4 tuần
6 tuần
13
chống chịu trong các môi trường chứa sorbitol không thể hiện rõ sự phát triển
về chiều cao chồi. Nhìn chung có thể nhận thấy các công thức TN có hệ số nhân
tương đối cao thì chiều cao chồi thấp và ngược lại. Điều này thể hiện sinh khối
của mẫu in vitro có những giới hạn nhất định trong điều kiện hạn. Việc đánh giá
khối lượng mẫu sẽ cho thông tin quan trọng hơn về sinh trưởng của khoai tây
trong điều kiện hạn nhân tạo.
3.2.3. Số lá
Trong môi trường không có sorbitol, số lá trung bình của mẫu đạt giá trị
thấp nhất sau cả 4 tuần và 6 tuần (Hình 3.5). Ở những mẫu đã qua tập chống
chịu, trong các công thức 50-50, 100-100, 100-200 và 200-200, cho số lá trung
bình lớn hơn so với những mẫu chưa qua tập chống chịu khi được cấy chuyển
sang môi trường có nồng độ sorbitol tương đương hoặc cao hơn cả sau 4 tuần
và 6 tuần. Tuy nhiên sự khác biệt này tương đối nhỏ.
Hình 3.5. Số lá trung bình của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng
độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm
3.2.4. Số rễ
14
Hình 3.6. Số rễ trung bình của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng
độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm
Biểu đồ về số rễ của mẫu chồi nuôi cấy cho thấy có xu hướng tăng khi
hàm lượng sorbitol trong môi trường tăng ở những mẫu đã qua tập chống chịu
so với những mẫu chưa qua tập chống chịu trong cùng môi trường nuôi cấy.
Đặc biệt là, những mẫu đã qua tập chống chịu ở ngưỡng 50 mM và 100 mM
sorbitol trong các công thức chuyển môi trường 50-50 và 100-100 có số rễ
trung bình cao hơn cả mẫu trong điều kiện môi trường không bị hạn.
3.2.5. Trọng lượng tươi và trọng lượng khô
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
Số
rễ t
run
g b
ình
(rễ
)
Nồng độ sorbitol trong các công thức chuyển môi trƣờng (mM)
4 tuần
6 tuần
15
Hình 3.7. Trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chồi khoai tây HH7
trên môi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu
hạn ở giai đoạn nảy mầm (đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy)
Trọng lượng tươi của khoai tây HH7 chịu ảnh hưởng lớn bởi điều kiện
hạn. Khi chuyển cây con nảy mầm sau 30 ngày sang các môi trường có chứa
sorbitol, hàm lượng sorbitol càng cao thì trọng lượng tươi của mẫu càng giảm.
Trong khi đó trọng lượng khô có giảm khi chuyển cây sang các điều kiện hạn
tăng cao nhưng mức giảm là tương đối ít so với biến động của trọng lượng tươi
(Hình 3.7). Kết quả cho thấy điều kiện hạn trong nuôi cấy đã làm giảm nhanh
khả năng hấp thu nước của khoai tây in vitro nhưng không làm giảm khả năng
tích lũy chất khô. Và, nếu các chồi khoai tây đã qua giai đoạn tập chống chịu
khi nảy mầm thì khả năng tích lũy chất khô của chúng được cải thiện đáng kể.
16
3.3. Hàm lƣợng chlorophyll ở khoai tây HH7 đã qua giai đoạn tập chống
chịu
Hình 3.8. Hàm lượng chlorophyll trong lá khoai tây HH7 trên môi trường có
các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy
mầm (đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy)
Kết quả nghiên cứu cho thấy, những mẫu đã qua tập chống chịu đều có
hàm lượng Chl. cao hơn so với những mẫu chưa qua tập chống chịu và cao hơn
so với môi trường đối chứng 0-0. Đặc biệt trong môi trường tiếp xúc hạn ở
ngưỡng 50 mM sorbitol cho thấy sự tăng về cả hàm lượng Chla, Chlb và tăng cả
về tỷ lệ hàm lượng Chla/ Chlb.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
Hà
m l
ƣợ
ng
Ch
l. (
µg
/mg
)
Nồng độ sorbitol trong các công thức chuyển môi trƣờng (mM)
Chla
Chlb
17
3.4. Hàm lƣợng proline
Hình 3.9. Hàm lượng proline trong thân và lá khoai tây HH7 trên môi
trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai
đoạn nảy mầm (đánh giá sau 4 tuần)
Xét tính tập chống chịu, hầu hết những mẫu đã qua tập chống chịu đều có
hàm lượng proline cao hơn so với những mẫu chưa qua tập chống chịu. Hàm
lượng proline đã thể hiện rất rõ ràng vai trò của giai đoạn tập chống chịu với độ
hạn thấp (50mM sorbitol) và vừa (100mM sorbitol) của cây con khoai tây đã
gia tăng hàm lượng proline ở tất cả các các điều kiện hạn ngang mức và cao
hơn.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
Hà
m l
ƣợ
ng
pro
lin
e (µ
g/m
g)
Nồng độ sorbitol trong các công thức chuyển môi trƣờng (mM)
18
3.5. Mức độ biểu hiện của một số gen yếu tố phiên mã liên quan đến tính
chịu hạn của khoai tây
3.5.1. Hàm lượng và độ tinh sạch của RNA tổng số
Bảng 3.1. Hàm lượng RNA tổng số và các giá trị đánh giá mức độ tinh sạch
Mẫu Hàm lƣợng (ng/µl) A260/280 A260/230
0 2963,7 1,9 1,99
1h0 854,1 2,03 2,32
1h50 1158,67 2,01 2,22
2h0 1075,19 2,03 2,04
2h50 1226,52 2,01 1,82
4h0 1260,5 2,05 2,13
4h50 1193,56 2,03 2,19
6h0 544,03 2 1,5
6h50 985,77 2,03 2,14
8h0 837,12 2,03 1,86
8h50 916,73 2,04 2,16
12h0 1286,44 2 2,17
12h50 1870,35 2 2,22
24h0 1177,5 2,02 2,3
24h50 1125 2,03 2,29
72h0 557,4 2,04 2,06
72h50 700,48 2,06 1,86
120h0 1407,28 2,02 2,2
120h50 568,8 2,02 1,99
RNA tổng số thu được hầu hết đều đạt chất lượng tốt ngoại trừ mẫu 6h0 có
chỉ số A260/230 thấp.
19
3.5.2. Kết quả kiểm tra chất lượng cDNA
Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra chất lượng cDNA
Mẫu
Giá trị Ct
Mồi GAPDH 3’ Mồi GAPDH 5’ ΔCt
0 24,54 25 0,46
1h0 16,89 17,51 0,62
1h50 25,67 24,34 1,33
2h0 23,82 23,09 0,73
2h50 19,77 20,43 0,66
4h0 15,72 16,41 0,69
4h50 18,36 19,54 1,18
6h0 22,89 22,1 0,79
6h50 21,88 20,55 1,33
8h0 21,77 21,06 0,71
8h50 22,71 21,98 0,73
12h0 22 20,9 1,1
12h50 21,22 20,17 1,05
24h0 16,09 16,54 0,45
24h50 16,65 16,87 0,22
72h0 24,58 23,92 0,66
72h50 24,63 23,26 1,37
120h0 24,03 23,28 0,75
120h50 26,8 25,37 1,43
3.5.3. Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMG400014309 (P1)
Trong 12h đầu, mức độ biểu hiện của gen P1 ở mẫu TN có dao động lớn
so với môi trường ĐC. Mẫu cấy trên môi trường 50 mM sorbitol có biểu hiện
mạnh hơn mẫu ĐC ở các mốc thời gian: 1h, 4h, 8h, 24h và 72h nhưng lại có
biểu hiện kém hơn ở các mốc: 2h, 6h, 12h và 120h. Sự tăng cường biểu hiện
của gen P1 ở khoai tây HH7 khi tập chống chịu hạn ở điều kiện 50mM sorbitol
20
in vitro so với mẫu trên môi trường không có sorbitol có sự dao động tương đối
lớn và với mỗi lần gia tăng sự biểu hiện của gen này lại cao hơn so với lần tăng
trước đó.
Hình 3.10. Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện giữa mẫu khoai tây được
xử lý hạn và mẫu đối chứng của gen PGSC0003DMG400014309 (P1), tương
đồng với gen mã hóa yếu tố phiên mã DREB1A ở Arabidopsis thaliana
3.5.4. Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMP400026903 (P2)
Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMP400026903 (gen P2) của khoai tây
giống HH7 trong nghiên cứu này cũng có chiều hướng biến động tương tự như
gen P1 (Hình 3.11). Tuy nhiên có thể thấy rõ tương quan mức độ biểu hiện của
gen P2 thấp hơn so với gen P1 và mốc thời gian P2 có biểu hiện của mẫu tập
chống chịu 50 mM sorbitol so với mẫu đối chứng cao nhất là ở 6h. Sau 72h,
tương quan mức độ biểu hiện có cao lên nhưng không vượt mức 6h.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 20 40 60 80 100 120
Tƣ
ơn
g q
ua
n m
ức đ
ộ b
iểu
hiệ
n (
lần
)
Thời gian (h)
21
Hình 3.11. Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện giữa mẫu khoai tây được
xử lý hạn và mẫu đối chứng của của gen PGSC0003DMP400026903 (P2),
tương đồng với gen mã hóa yếu tố phiên mã RD26 ở Arabidopsis thaliana
3.5.5. Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMT400045091 (P3)
Gen P3 mã hóa cho protein thuộc lớp thứ nhất của họ AP2/ERF protein,
tương đồng với gen At4G13040 ở A. thaliana. Ở A. thaliana, At4G13040 có
chức năng điều khiển sự tích lũy salicylic acid, chống lại các bệnh liên quan đến
vi khuẩn. Mức độ tương đồng giữa gen P3 và At4G13040 là 100%.
Hình 3.12. Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện của gen
PGSC0003DMT400045091 (Gen P3), tương đồng với gen yếu tố phiên mã
At4g13040 ở Arabidopsis thaliana
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 20 40 60 80 100 120
Tƣ
ơn
g q
ua
n m
ức đ
ộ b
iểu
hiệ
n (
lần
)
Thời gian (h)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 20 40 60 80 100 120
Tƣ
ơn
g q
ua
n m
ức đ
ộ b
iểu
hiệ
n (
lần
)
Thời gian (h)
22
Từ biểu đồ, chúng ta nhận thấy rằng mức độ biểu hiện của gen P3 trong
các mẫu TN thấp nhất so với 2 gen nghiên cứu trên. Chiều hướng biến động giá
trị tương quan mức độ biểu hiện của gen P3 tương tự với gen P2.
Trong 3 gen nghiên cứu, khi so sánh tương quan giữa khoai tây trong giai
đoạn tập chống chịu trước điều kiện có sorbitol gây hạn mức 50mM với mẫu
nuôi cấy trên môi trường đối chứng thì gen P1 có mức độ biểu hiện mạnh mẽ
hơn cả, tiếp đến là gen P2 và thấp nhất là gen P3. Điều này khẳng định vai trò
của yếu tố phiên mã DREB1A trong cơ chế chống chịu hạn của thực vật nói
chung và của khoai tây nói riêng.
23
KẾT LUẬN
1. Tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống Hồng Hà
7 giảm khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng.
2. Sự tăng lên về số lượng rễ, trọng lượng tươi, trọng lượng khô, hàm lượng
chlorophyll, hàm lượng proline của mẫu đã nảy mầm trong môi trường
hạn so với các mẫu chưa tiếp xúc hạn bước đầu cho thấy cây con khoai
tây (Solanum tuberosum L.) giống Hồng Hà 7 có khả năng tập chống chịu
hạn.
3. Hàm lượng sorbitol 50 mM trong môi trường mang lại hiệu quả tập
chống chịu tương đối cao cho khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống
Hồng Hà 7.
4. Với nồng độ 50 mM sorbitol trong môi trường đã làm tăng cường đáng kể
biểu hiện của gen mã hóa yếu tố phiên mã PGSC0003DMG400014309 ở
khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống Hồng Hà 7 (tương đồng với gen
DREB1A).
KIẾN NGHỊ
1. Nghiên cứu ảnh hưởng khả năng tập chống chịu hạn đến khả năng tập
chống chịu một số yếu tố bất lợi khác của khoai tây (Solanum
tuberosum L.) giống HH7.
2. Nghiên cứu tính tập chống chịu hạn của một số giống khoai tây (Solanum