NEKODIRAJOČE RNA PRESENEČENJE V (RNA) SVETU
NEKODIRAJOČE RNA
PRESENEČENJE V (RNA) SVETU
ORGANIZACIJA GENOMAŠe pred desetletjem nam je genom
izgledal
kot linearna ureditev ločenih posameznih genov
GEN
DNA, ki kodira proteine DNA, ki kodira ne-kodirajoče„house-keeping“
RNA
(tRNA, rRNA)
CENTRALNA DOGMA (Crick, 1958)
(GEN)
ŽE V STRUKTURI GENA SO KODIRAJOČA IN NEKODIRAJOČA ZAPOREDJA
Vrste ponavljajoče DNA,
ki se pojavlja v človeškem genomu
Tandemske
ponovitve: satelitna
DNA
• Razpršena
ponovljena
zaporedjaSINEs
(Short
INterspersed
repeated
Elements), npr.
Alu
elementi
Retrovirusom
podobna zaporedja. npr. LINEs
(Long INterspersed repeated Elements)
• Podvojeni
geni
tudi
psevdogeni
IZVENGENSKA NE-KODIRAJOČA DNA
Kratka
ponavljajoča
razpršena zaporedja
(SINEs): Alu zaporedja
Značilnosti• Konsenzno: 281 bp• Sestavljena iz dveh sorodnih enot• Precejšnja variacija v dolžini zaradi delecij, substitucij
ali
insercij
• ~1,000,000 elementov/haploidni
genom
(~12%)
Porazdeljenost• Povprečni razmik je
4-kb
• Razpršene
vendar ne naključno?• Škodljive, če se vrinejo
v gen
•
Primeri insercij,
ki pomagajo pri regulaciji izražanja,
ko se vrinejo v regulatorne
elemente genov
•
Sebična
“Selfish”
DNA ne vpliva
na
fenotip, “zanima”
jo
le
lastno pomnoževanje
1 GGCCGGGCGC GGTGGCTCAC GCCTGTAATC CCAGCACTTT 41 GGGAGGCCGA GGCGGGCGGA TCACGAGGTC AGGAGATCGA 81 GACCATCCCG GCTAAAACGG TGAAACCCCG TCTCTACTAA 121 AAATACAAAA AATTAGCCGG GCGTAGTGGC GGGCGCCTGT 161 AGTCCCAGCT ACTTGGGAGG CTGAGGCAGG AGAATGGCGT 201 GAACCCGGGA GGCGGAGCTT GCAGTGAGCC GAGATCCCGC 241 CACTGCACTC CAGCCTGGGC GACAGAGCGA GACTCCGTCT 281
Dolga
razpršena jedrna zaporedja
(LINEs)
Značilnosti• 60 bp
-
7 kb
•
Precejšnja variacija v dolžini zaradi
5’
skrajševanj, delecij
in preurejanj
• ~500,000 elementov/haploidni
genom
(15-20%)• 3000-4000 jih
je celotne
dolžine
•
1-2% sposobne prepisovanja, najverjetneje preko
RNA
intermediata (kot pri
retrovirusih)
Porazdeljenost• Najdene v regijah bogatih z A-T bp
A-Trich
5’ 3’ORF1ORF2
Psevdogeni
• Psevdogeni:
•
Nefunkcionalne
kopije
genov ali genskih fragmentov
so nastale med razširitvijo genske družine•
Vsebujejo
insercije, delecije, nepomenske
mutacije• Običajno
se ne prepisujejo
• Lahko so povezane
s
prepisi funkcionalnih genov
Struktura evkariontskega
genoma
Repetitive
DNA
“DARK MATTER”
“Kakor zgoraj, tako spodaj”?
KAKO MALOPROTEIN
-
KODIRAJOČIH GENOV
VSEBUJE
NAJVEČJE PRESENEČENJE PRI DEKODIRANJU ČLOVEŠKEGA GENOMA
GENI, KI KODIRAJO PROTEINE
•
~ 20 tisoč*•
< 2% celotnega nukleotidnega
zaporedja
genoma•
Podobno število kot npr. nematod Caenorhabditis
elegans
(C. elegans)
*Inernational
Human Genome Sequencing
Consortium, 2004
Primerjalna genomikaČLOVEK DELI GENE Z DRUGIMI VRSTAMI
96% s šimpanzom80% z mišjo75% s psom50% z vinsko mušico (Drosophila)40% z nematodo
(C. elegans)
30% s kvasovko
POMEMBNI GENI
Od 289 pri človeških boleznih mutiranih genov,jih 211 tudi pri vinski mušici povzroča bolezni
To so geni vključeni v rak prostate, rak pankreasa,bolezni srca, cistično fibrozo, levkemijo…
Večina proteinov je ortolognihin imajo enako delovanje od nematod do človeka
KJE JE INFORMACIJA, KI PROGRAMIRA NAŠO KOMPLEKSNOST?
(C. elegans)
(H. sapiens)
RAZMERJE MED KODIRAJOČO IN NEKODIRAJOČO DNA
POVEČANA KOMPLEKSNOST
•
Prepisovanje ni omejeno na predele, ki kodirajo proteine
•
Prepisi niso sami sebi namen -
“selfish gene”
•
Funkcijska vloga preostalega deleža (98%) genoma, ki ne kodira proteinov?
RNA polimeraza iz T. aquaticus
sintetizira RNA
VEČ
KOT 90% GENOMA SE PREPIŠE DO RNA
tRNA
(prenašalna
RNA, adaptor v procesu translacije)rRNA
(ribosomalna
RNA, komponenta ribosoma, katalizira
peptidil
transferazno
reakcijo za povezovanje aminokislin v tvorbi proteinov)snRNA
(majhna jedrna
RNA, komponenta
spajalnega telesca)
snoRNA
(majhna nukleolarna
RNA, sodeluje pri procesiranju rRNA)RNase
P (ribocim,
pretvarja prekurzorske
tRNA
v aktivne tRNA)
SRP RNA (RNA komponenta „signal recognition particle“)
translacija
ProteinmRNADNAtranskripcija
KRITIČNE KOMONENTE ŠTEVILNIH CELIČNIH PROCESOV
ŽE POZNANA FUNCIJSKA VLOGA RNA, KI SE NE PREVEDE DO PROTEINOV
DVA RAZREDA RNA MOLEKUL
•
INFORMACIJSKA –
mRNA•
NEKODIRAJOČA -
ncRNA
VKLJUČITEV ncRNA
V CENTRALNO DOGMO
PREPISOVANJE NI OMEJENO NA PREDELE, KI KODIRAJO PROTEINE
•
Kompleksna mreža prekrivajočih se prepisov
•
Več
deset tisoč
dolgih RNA molekul, brez ali z malo translacijske sposobnosti
Pregled v Kapranov
et
al. 2007 Nat Rev Genet
“ENCODE“
IN “FANTOM” PROJEKT
Enciklopedia
of
DNA Elements
Consortium
-
(ENCODE) Projekt transkriptom
(“deep
sequencing”
tehnologija)
Število dolgih in kratkih ncRNA
prepisov presega število protein-kodirajočih genov
Functional
Annotation
of
Mammalian
cDNA
–
(FANTOM)Projekt transkriptom
Sekveniranje
cDNA
sesalcev (pa tudi vseh višjih evkarjontov)
Transkriptom
je že na posameznem lokusu
kompleksenmozaik prekrivajočih se
obojesmernih
prepisov, kodirajočih in ne-kodirajočih in tako predstavlja kompleksno hierarhijo
prekrivajočih se izoform…
V
človeškem genomu
je10000-100000 nekodirajočih
prepisov
Transkriptom
je kompleksen mozaik prekrivajočih se prepisovv obeh smereh
Ista genomska
zaporedja si delijo številni kodirajoči in nekodirajoči
prepisi v smiselni in proti-smiselni smeri
RAZLIČNE RNA POLIMERAZE
•
Pol I prepiše ribosomalne
RNA gene•
Pol II prepiše gene, ki kodirajo proteine in snRNA, miRNA, lncRNA,…
•
Pol III prepiše tRNA, miRNA, lncRNA,…Vsaka vsebuje specifično promotorsko
področje
ne katerega se veže, da začne prepis
Isti genomski
predel lahko prepišeta Pol II in Pol III, kar še dodatno poveča kompleksnost transkriptoma
ŠTEVILNI PREPISI NA ENI MATRIČNI DNA
NEKODIRAJOČE RNA
•
Dolge ncRNAs
(lncRNAs) prepisane iz kromatinskih lokusov
•
Majhne RNA prepisane s promotorskih predelov
•
RNA različnih velikosti, ki nastanejo iz dvosmernih (bidirectional) promotorjev
•
Razširjeno prepisovanje iz ponavljajočih zaporedij
(transpozonov, Alu
ponovitev)
•
ncRNA
iz mitohondrijske
DNA
NASTANEK RAZNOLIKIH VRST RNA
PASRs, promoter-associated
RNAs
lncRNAs, long
non-coding
RNAs
miRNAs, microRNAs
snoRNAs, small
nucleolar
RNAs;
sdRNAs, sno-derived
RNAs
endo-siRNAs, endogenous
siRNAs
piRNAs, PIWI-interacting
RNAs tiRNAs, transcription
initiation
RNAs
RASTOČE ŠTEVILO OBJAV O ncRNA
*do avgusta 2009
Novo-prepoznani razredi ncRNAs
v evkariontih
Wery
et
al. 2011 System
Biol Med
cryptic
unstable
transcripts
-
CUT,
stable
unannotated
transcripts
-
SUT
PROMoter
uPstream
Transcripts
-
PROMPT
large
intergenic
ncRNAs
-
lincRNA
promoter-associated
long
ncRNAs
-
PALR
terminator-associated
small
RNAs
-
TASR
promoter-associated
small
RNAs
-
PASRs
transcription
initiation
RNAs
-
tiRNA
transcription
start site-associated
RNAsTSSa-RNA
VRSTE NE-KODIRAJOČIH RNA
•
Dolge ncRNA–
200 nt
-
> 100000 nt
•
Majhne ncRNA–
18 nt
-
200 nt
VRSTE NE-KODIRAJOČIH RNA PRI ČLOVEKU
RELATIVNA ORIENTACIJA ncRNA
in mRNA
PREPISOV
5'NDR -
5' nucleosome-depleted
region
ORF –
open reading
frame
70% prepisov je protismernih
SELEKTIVNI IN DINAMIČNI PROFILI ncRNA
V CELIČNIH IN SUBCELIČNIH PREDELIH
PRECIZNO ČASOVNO IN PROSTORSKO IZRAŽANJE ncRNAJE IZREDNO POMEMBNO
Diferenčno izraženi ne-kodirajoči prepisi med diferenciacijo zarodnih izvornih celic
0 1 2 3 4 5 6 8 10 12 16 dan
Dinger
et
al. Long noncoding
RNAs
in mouse
embryonic
stem
cell pluripotency
and
differentiation. Genome Research
18: 1433–1445 (2008)
Značilnosti nekodirajočih RNA•
Lahko tvorijo veliko število funkcionalnih sekundarnih struktur
•
Nivoji izražanja lncRNA
so nižji kot protein kodirajočih genov
•
Nekatere ncRNA
so preferenčno izražene v določenih tkivih
•
Zavzemajo večino RNA mase celice (če odštejemo ribosomalno
in mitohondrijsko
RNA)
Spcifično
časovno-prostorsko izražanje ncRNA
Pregladanih
1,328 ncRNAs849 izraženih v možganih
60 povsod623 celično in regionalno specifičnih
2009
EVOLUCIJSKA OHRANJENOST ncRNA
•
Dolge ncRNA
na splošno niso ohranjene•
Veliko jih vsebuje le močno ohranjene elemente
•
Manjša ohranjenost zaradi novejše in hitrjše prilagoditvene selekcije
–
V ncRNA
HAR1F, ki se izraža v neokorteksu
potekajo pri človeku (napram
šimpanzu) hitre evolucijske spremembe
•
Majhne RNA (npr. miRNA) so visoko evolucijsko ohranjene
•
Večja ohranjenost v RNA sekundarnih strukturah kot v primarnih zaporedjih
IZRAŽANJE RNA HAR1F
V RAZVIJAJOČIH MOŽGANIH
Pollard
et
al. Nature
Epigenetski
procesi so ključni za:
•
Diferenciacijo in razvoj•
Dogotrajne
odgovore na spremembe
okolja (dedovanje, evolucija)•
Delovanje možganov
•
Nastanek bolezni
Epigenetski
regulatorni
mehanizem
•
Epigenetski
spomin se vgradi:–
v metilacijo
in hidroksi-metilacijo
citozina
v DNA–
Z modifikacijo kromatina (preko histonskih
oznak)
To se dogaja s pomočjo izredne mreže
ENCIMOV/ KOMPLEKSOV/ MOLEKULSKIH GRADNIKOV ~ 60
ki vključujejo skupine proteinov
Polycomb
in Trithorax, ki so ključna za večino (če ne vse) razvojne procese in programe v
organizmu
Podvojevanje
DNA-metilacijskega
vzorca
Np95 odkrije mesto metilacije
v matrični verigi, sledi vezanje encima Dnmt1 (DNA-metil-transferaza) na Np95 in metilacija
podvojene verige
PCNA-”proliferating
cell
nuclear
antigen”
ki objame DNA
Histonske oznake
Mehanizem za vzpodbujanje/zaviranje izražanja DNA s skupino proteinov Polycomb
in trithorax
•
KAJ DOLOČA MESTNO-SELEKTIVNOST TEH ENCIMOV?
•
KAJ DOLOČA V KAKŠNEM STANJU JE KROMATIN?
•
KAKŠNE SO MOLEKULARNE OSNOVE INTERAKCIJ MED EPIGENOMOM IN OKOLJEM?
DNA ncRNA OKOLJE
NEKODIRAJOČE RNA IN DEDOVANJE
•
Predstavlja nov nivo v “zakonih” Mendlovega dedovanja, ki ga imenujemo
mehki-”Lamarck-izem”–
Pogoji okolja v zgodnjem življenjskem obdobju lahko povzročijo epigenetske
spremembe pri ljudeh, ki ostanejo celo življenje in so lahko posledica preko ncRNA
posredovane modifikacije metilacije
DNA ali modifikacije histonskih
oznak
–
Epigenetska
sprememba v času nosečnosti se lahko prenese v naslednjo generacijo.
Heijmans
et
al. 2008
VKLJUČENOST ncRNA
V ŠTEVILNE BIOLOŠKE PROCESE
•
Epigenetiko•
Alternativno izražanje
•
Strukturne komponente•
Importu
v jedro
•
Prekurzorji
za majne
RNA•
Regulatorji upadanja mRNA
Nekodirajoče RNA
•
Celotno področje transkripcijske
in post- transkripcijske
regulacije doživlja
renesanso
•
Vpliv na vsa področja biokemije, biologije in medicine
"dark matter" ali "junk" DNA
•
Glavna biološka vloga
–
Regulaciji genov–
Celičnem razvoju
–
Metabolizmu–
Kompleksnosti organizmov
–
Evoluciji–
Razvoju bolezni