Nachweis von Lebensmittelallergenen –Eine analytische ...

Nachweis von Lebensmittelallergenen – Eine analytische Herausforderung?

Verena Peterseil

Institut für Lebensmittelsicherheit Wien

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o Gesetzliche Grundlagen (Auszüge)

o Analytik

Allergene in der amtlichen LM-Kontrolle

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• „Allgemeine“ Rechtsvorschriften− VO (EG) 178/2002 „Basis Verordnung“

− VO (EG) 882/2004 „Amtliche Kontrolle“

• „Spezielle“ Rechtsvorschriften− VO (EG) 1169/2011 „Lebensmittelinformationsverordnung“

− VO (EG) 828/2014 „Durchführungsverordnung Gluten“

− BGBl. II 175/2014 „Allergeninformationsverordnung“

Gesetzliche Grundlagen

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Kennzeichnung AllergeneEU (VO) 1169/2011 - BGBl. II 175/2014

Warum wird freiwillig deklariert?

• Abwehr zivilrechtlicher Ansprüche (oft verschuldensunabhängig)

• Vermeidung von Produktrückrufen

• Verbraucherinfo - Gesundheitsschutz

Kennzeichnung „Allergenspuren“ProdHaftG

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Dilemma – Rechtliche Grundlagen fehlen• Durchführungsbestimmungen von EU noch nicht veröffentlicht

Freiwillige InformationenEU (VO) 1169/2011

√

tw.

?

?

Dilemma – Rechtliche Grundlagen fehlen Fehlende „Kennzeichnungs-Grenzwerte“

Kennzeichnung AllergeneDurchführungsverordnung / Spezialrecht

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Lösungsansatz: „Beurteilungswerte“

Kennzeichnung AllergenePAL (precautionary allergen labelling)

9Auszug aus Newsletter 6/2015 von Krell Weyland Grube RA, Gummersbach; Schwellenwertdosis = Referenzdosis (Taylor)

Beurteilung - RisikobewertungDiskussion Schwellenwerte

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Dilemma – Rechtliche Grundlagen fehlen• Keine „PAL-Regeln“ vorhanden� „lockere vs. strikte“ Verwendung

Zu locker: Viele Produkte werden vorbeugend gekennzeichnet (= limitierte Auswahl für betroffenene AllergikerIn)

Zu streng: Inverkehrbringer geht Risiko einer Beanstandung/ Rückholung/ Haftung ein…..

� Einheitliche PAL-Regelung wäre wünschenswert (Durchführungsrechtsakte)

� EU task force erarbeitet zurzeit neue Dokumente (inkl. FAQ-Katalog)

Kennzeichnung AllergeneEU (VO) 1169/2011

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Amtliche Kontrolle zur Überprüfung der Einhaltung des Lebensmittel- und Futtermittelrechts:

• Artikel 3: Allgemeine Verpflichtungen hinsichtlich der Organisation amtlicher Kontrollen

− Die Mitgliedstaaten stellen sicher, dass regelmäßig, auf Risikobasis und mit angemessener Häufigkeit amtlicheKontrollen durchgeführt werden….

� Multi Annual National Control Plan (MANCP)� Planproben (Schwerpunktaktionen, Monitoring,…)

− Beispiele für Planproben - Allergene

� 4S in Wurstwaren (Senf, Sesam, Sellerie, Soja)

� Laktose in Milchprodukten

Amtliche Kontrolle in Ö - Warum?

VERORDNUNG (EG) Nr. 882/2004

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Amtliche Kontrolle in Ö - Warum?

VERORDNUNG (EG) Nr. 882/2004

Bp für einen Probenahmeplan (Auszug; Risikolandkarte)

WarengruppeProbenanzahl

(Handel + PEP) aus Probenplan 2014

GlutenKrebstie

reEier Fische

Erdnüsse

Sojabohnen

MilchSchalenfrü

chteSellerie Senf

Proben für Allergenuntersuchung/ Jahr

0101 Rohes Fleisch frisch oder tiefgekühlt 327

0102 Rohes Fleisch zerkleinert, ungewürzt 291

0103 Fleischzubereitungen 347 10 10 10 10 35

0104 Pökel- und Räucherfleisch 272

0105 Würste 638 10 10 10 10 10 10 64

0106 Fleischkonserven 100 10 10 10 10 10 10 10

0107Suppen mit/aus Fleisch, Fleischextrakte und Suppen daraus 30 a a a a

0108 Naturdärme

0109 Wildbret frisch oder tiefgekühlt 100

0110 Wildbreterzeugnisse 100 10 10 10 10 10 10 10

0201 Meeresfische frisch oder tiefgekühlt 223

0202 Meeresfischerzeugnisse 183 a a a a a a a

Allergenanalytik ist eine Speziesdifferenzierung• Kein Nachweis ob ein LM eine allergische Reaktion

auslösen kann• Ergebnisangabe: mg Allergen / kg LM• 2 methodische Ansätze

a) Protein-Methoden b) DNA-Methoden

Allergen-Analytik

Repräsentative Probe

Kritisch: Homogenität & Extraktion

Herstellungsprozess meist unbekannt

Methodenwahl (DNA<->Protein)

• LM-Prozessierung -> Einfluss auf Analyt (zB. Gluten-ELISA)

• Matrixeffekte -> Analyt vorhanden/extrahierbar?

• Referenzmaterial / Kalibriermaterial

• Analyt -> Ergebnisangabe

Analytik

Indirekte Methode (Messung des

Farbumschlags nach enzymatischer Reaktion)

Quantifizierung möglich

Allergene Proteine / Markerproteine

(speziesspezifisch)

Monoklonale Polyklonale

Antikörper (erkennen multiple Epitope,

tolerant ggüber Proteinmodifizierung)

Lineare Epitope

Konformationsepitope (3D-Struktur wird

erkannt)

ELISA

Proteinextraktion in einer

Vielzahl an Matrizes möglich?

Gefahr falsch negative Ergebnisse

Auf bestimmte Proteinfraktionen

kalibriert / validiert

Unter-/Überschätzung

Ei-ELISA:

• Zielanalyt: Ovomucoid (eines von vielen Eiweißproteinen)

• Endergebnis: Gesamt-Eiweiß (bei Kitkalibrierungberücksichtigt)

• Wenn Probe andere Ei-Protein-Zusammensetzung hat -> Messfehler

• Gutachter: Umrechnung Gesamt-Eiweiß -> Gesamt-Ei

Gluten-ELISA:

• Zielanalyt: Gliadin (Gluten: Gliadin + Glutenin, ~1:1)

• Kalibierung mit PWG-Standard (>20 Weizensorten)

• Endergebnis: mg Gliadin/kg LM• Wenn Probe andere Getreideanteile (Roggen, Gerste,…)

aufweist -> Messfehler

• Gutachter: Gluten -> Gliadin x 2

ELISA-Beispiele

Gesundheitsstadt Berlin

Picquery.com

(real time) PCR (Polymerase Chain Reaction)

• Target: DNA-Sequenz (Spezies-spezifisch)-> Floureszenzmessung!

• Screening (qualitativ -> quantitative Abschätzung möglich?)

• Quantifizierung möglich (Matrix-abhängige Kalibrierung)

� DNA-Kopien ->mg?

• Sensitiv (multi-copy-gene)

• Multiplexen möglich

PCR (DNA-Nachweis)

Fotolia.comOptimum.me

Ergebnisinterpretation

• Umrechnung DNA in Protein – kein direkter Zusammenhang!

Matrixangepasste Kalibierung mit realen Modellproben -> Vergleichbarkeit Probe mit Kalibiermaterial gegeben

• Jeder Probe eigenes Kalibiermaterial…

• ODER: Zertifiziertes Referenzmaterial (ZRM)

Ausnahme: Erdnuss (IRMM-481) Eipulver: NIST RM-8445 (nicht zertifiziert)

Milch: NIST RM-1549 (nicht zertifiziert)

Lösungsansätze:

• Standardisierung (Definieren von Mindestanforderungen für Methoden)

• Referenzmaterial herstellen

• Methodenentwicklung (MS, dPCR, NGS, …)

PCR (DNA-Nachweis)

Ergebnisangabe Allergene

EN 15633-1:

EN 15634-1:

KEIN zertifiziertes RM verfügbar! (Ausnahme Erdnuss)19

„…results are expressed as total amount of

allergenic ingredient per kilogram of food (mg/kg),

or as total amount of protein per kilogram of food,

using an appropriate factor that allows conversion to

the amount of allergenic ingredient per kilogram of

food.“

„…LODs/LOQs must be expressed as the number of

copies of DNA equivalent to a total quantity of the

allergenic ingredient per kilogram of food (mg/kg).

The equivalence should be based on certified

reference material.“

*1=ELISA, 2= rt-PCR

Analytik Allergene ELISA vs. PCR

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Methode Warum ja Warum nein

ELISA

-Einfache Durchführung-Allergen kann direkt nachgewiesen werden-Direkte Quantifizierungder Proteine

-Proteine instabiler als DNA-Eine Methode je Allergen erforderlich-Antikörper nicht für alle Allergene entwickelt-Antikörper richten sich nicht unbedingt gegen allergeneProteine-Eignung matrixbezogen-Unterschiedliche Eignung bei verschiedenen Matrices-Limitierungen oft nicht bekannt-Etablierung/Validierung teuer (Kit-Kosten)

PCR-DNA ist stabiles Molekül-Multiverfahren möglich-Etablierung günstiger

-Kein Nachweis des Allergens-Keine direkte Quantifizierung der Proteine (sondern der DNA-Kopien, Umrechnung bzw. Kalibrierung notwendig)-Nicht alle LM enthalten ausreichend amplifizierbare DNA

Fazit: Die quantitative Allergen-Analytik ist zurzeit nicht zufriedenstellend.-> Kombination ELISA und PCR

Jede Beurteilung ist eine Fall-zu-Fall Entscheidung

BeurteilungAmtliche Begutachtung

Rechtliche Aspekte

ExpositionAnalytik

Irreführende Angaben

Nicht sicher

Verzehrsmengen

Action levels

Referenzdosis

PAL

Lose Ware

vorverpackt

Nachweisgrenze

Protein/DNA-Methoden

Analyt

Referenzmaterial

Unbestimmte Angaben

Gesetzliche Grenzwerte

Vor-Ort Ermittlungen

Unterscheidung zwischen Kontamination zu wissentlichem Zusatz analytisch nicht möglich

− Unvermeidbare Kontamination (= nicht kennzeichnungspflichtig); rezepturbedingter Zusatz (= kennzeichnungspflichtig)

Methodik

- was wird gemessen - DNA/Protein/Allergen?

- welche Matrix wurde validiert / auf welche Substanz wird kalibriert?

- Kein Referenzmaterial verfügbar

− Keine zufriedenstellende Validierung von quantitativen Methoden möglich

� Lösung:

− Standardisierung (CEN/ISO-Normen)

u.a. zur Festlegung von Minimum Performance Kriterien

Beurteilung – Dilemma Analytik

AGES – Österreichische Agentur für Gesundheitund Ernährungssicherheit GmbH

www.ages.at

Abt. Molekular- u. Mikrobiologie

Spargelfeldstr. 191A-1220 Wien

+43 50555 32203

[email protected]

Verena Peterseil

Quellen: Teile der Präsentation stammen aus Beiträgen der Fresenius-Praxistage

"Allergenmanagement„ vom März 2017 in Dortmund