Méthodes d'évaluation de l'efficacité des antibiotiques en biofilm Françoise Van Bambeke, PharmD, PhD Pharmacologie cellulaire et moléculaire Louvain Drug Research Institute Université catholique de Louvain, Brussels, Belgium <www.facm.ucl.ac.be> 27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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Méthodes d'évaluation de l'efficacité des antibiotiques en ... · log resorufin fluorescence log CFU/ml log OD. 620 nm Bauer, Siala et al, Antimicrob Ag Chemother. 2013;57:2726
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Méthodes d'évaluation de l'efficacité des antibiotiques
en biofilm
Françoise Van Bambeke, PharmD, PhD
Pharmacologie cellulaire et moléculaireLouvain Drug Research Institute
Université catholique de Louvain, Brussels, Belgium
<www.facm.ucl.ac.be>
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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Antibiotiques et biofilms en pratique clinique
échecs thérapeutiques pas rares …27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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Modèles statiques in vitro
pegs plaques multi-puits
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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Activité antibiotique: cultures planctoniques vs. biofilms
Macià et al, Clin Microbiol Infect. 2014 Apr 26
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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Modèles statiques: “Calgary Biofilm Device”
Détermination de la “Minimal Biofilm Eradication Concentration”
(MBEC)
Ceri et al, J. Clin. Microbiol. 1999; 37:1771-6; Herrmann et al, J Infect Dis. 2010;202:1585-9227/11/2014 Antibiotiques et biofilms
6
Activité antibiotique: cultures planctoniques vs. biofilms
Takei et al, J Infect Chemother (2013) 19:504–9
MIC
MBCMBEC
MIC MBC
MBEC
ampicilline et lévofloxacine vs. H. influenzae (< liquide de l’oreille moyenne)
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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Modèles statiques: plaques à 96 puits en polystyrène
colorantsappropriés pour évaluer
la biomasseou la charge bactérienne
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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Mesure de la biomasse / viabilité dans le biofilm
crystal violet
biomasse
Christensen et al, Infect. Immun. 1982; 37:318–26
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
Mesure de la biomasse / viabilité dans le biofilm
crystal violet
resazurin
resorufine
activité métabolique
fluoresceine diacetate
fluoresceine
Gram(+) Gram(-)
Christensen et al, Infect. Immun. 1982; 37:318–26
Tote et al, 2008; Lett. Appl. Microbiol. 46:249–254 Wanandy et al, J Microbiol Methods 2005;60:21-30
biomasse
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Distinction entre effets statique et cidal
Comptage des UFC
Hardrson et al, Nature Protocols 2010; 5:1236-54 27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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Distinction entre effets statique et cidal
S. pneumoniae
Libération de NADH
NADH oxidase(NOX)
NADH oxidase
NADH NAD+
Hardrson et al, Nature Protocols 2010; 5:1236-54 Yu et al, Microbiology. 2001;147(Pt 2):431-8
Comptage des UFC
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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Comptage des UFC vs. fluorescence de RF
relation between fluorescenceand bacterial inoculum for S. aureus
2 3 4
6
7
8
9
10
11
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
30 min. incubation
log resorufin fluorescence
log
CFU
/ml log O
D620 nm
Van den Driessche et al, J.Micr. Meth. 2014; 98:31–4Bauer, Siala et al, Antimicrob Ag Chemother. 2013;57:2726-37;
an exemple pour S. aureus
UFC & signal RF proportionnels Sensibilité ~ temps d’incubation
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NADH oxidase vs. fluorescence de RF
Vandevelde et al, ECCMID 2014; eP288
bactéries mortes bactéries vivantes restantes
un exemple pour S. pneumoniae
-7.5 -5.0 -2.5 0.0 2.5 5.00
20
40
60
80
100
120
CLRMXF
log10 concentration (X MIC)
Res
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con
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-7.5 -5.0 -2.5 0.0 2.5 5.00
20
40
60
80
100
120
CLRMXF
log10 concentration (X MIC)
NA
DH
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alue
)
clarithromycin (bacteristatic) vs moxifloxacin (bactericidal)