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Transcript
• Einführung
• Ribozyme I
• Ribozyme II
• Ribozyme III, In vitro Evolution
• in vitro Evolution neuer Ribozyme
• SELEX
• Display-Techniken:
In vitro Evolution von Proteinen
• RNA-basierte Regulation: Riboswitches
• RNA Interferenz
• small noncoding RNA
• Influenza – ein RNA-Virus
MSc-Modul RNA-Biochemie
RNA Biochemie 06/1
Isolierung der
gewünschten RNA
RT/PCR
Mutagenese
(PCR)
Systematic Evolution of Ligands
by Exponential amplification
RNA Biochemie 06/2
SELEX
Heydenreich et al., 1993
spezifische Bindungstaschen in Proteinen:
RNA Biochemie 06/3
SELEX
tRNA-
Synthetase
Komplex
RNA Biochemie 06/4
SELEX
Faltung
Protein RNA
RNA Biochemie 06/5
SELEX
randomisiertT7 Promotor
Säule
Anlagerung
in vitroTranskription
RNA Pool
Sequenzpool: 1013-1015
(sequence space: 1024)
RT/PCR
RNA Biochemie 06/6
SELEX
lat. „aptus“, passend
Selektierte RNA Moleküle, die andere Moleküle spezifisch binden:
Aptamere
RNA Biochemie 06/7
SELEX
target
target
target
target
PCR mutagenesis
RNA Biochemie 06/8
SELEX
KD-Werte von Aptameren:
90.03hairpin1130mod.
RNA
Vascular
Endothelial
Growth Factor
111bulge1032RNAHIV rev Protein
1410G-
quartet1740ssDNAElastase
13100hairpin1530mod.
RNAElastase
10700bulge8120RNAATP
?18 000?7120RNAD-Tryptophan
FreqKD [nM]MotifRdsNtsLibraryTarget
RNA Biochemie 06/9
SELEX
Agarose-O-C(NH)NH-(CH2)6-NH
Agarose-Säule
ATP
Anfangskomplexität:
1014 RNA-Moleküle
RNA Biochemie 06/10
SELEX: ATP-Aptamer
Agarose-O-C(NH)NH-(CH2)6-NH
RNA
Säulen-Matrix= Säulenbinder
RNA Biochemie 06/11
SELEX: ATP-Aptamer
1. Inkubation von RNA
mit Säulenmatrix
RNA
vorselektierte
RNA
2. Inkubation von RNA
mit immobilisiertem
Zielmolekül
Selektion
selektierte RNA (Aptamer)
RNA Biochemie 06/12
SELEX: ATP-Aptamer
ATP
gebundene RNA auf der Säule
Agarose-O-C(NH)NH-(CH2)6-NH
ATP
ATP
ATP
RNA
RNA
RNA
kompetitive Elution
RNA Biochemie 06/13
SELEX: ATP-Aptamer
Agarose-O-C(NH)NH-(CH2)6-NH
Agarose-Säule
ATP
RNA-Pool
flow through:
ungebundene RNA
Affinitätschromatographie
mit ungebundenem ATP
reverse Transkription
PCR
in vitro Transkription
Analyse
RNA Biochemie 06/14
SELEX: ATP-Aptamer
Consensus-Motiv
Sassanfar & Szostak, 1993
RNA Biochemie 06/15
SELEX: ATP-Aptamer
Consensus-Motiv und Consensus-Struktur:
Sassanfar & Szostak, 1993
RNA Biochemie 06/16
SELEX: ATP-Aptamer
• KD < 50 µM (später: 700 nM)
• Bestimmung der Ligand-Spezifität
durch modifizierte Elution
• Keine Bindung bei Methylierungen
an Positionen 1, 2, 3 und 6 an der
Base bzw. am 3‘OH der Ribose
• Entfernen der Aminogruppe an
Position 6 oder der 2‘OH-Gruppe
interferiert mit Bindung
• N7 und C8 sind nicht beteiligt
• Anzahl der Phosphate ist irrelevant
Sassanfar & Szostak, 1993
RNA Biochemie 06/17
SELEX: ATP-Aptamer
die Base wird erkannt!
ATP-Bindung: induced fit
Kethoxal
• Kethoxal interagiert mit N1
und N2 von ungepaarten
Guanosin-Resten
• Abwesenheit von ATP:
keine Modifikation
• Anwesenheit von ATP:
Konformationswechsel im
Aptamer: G6, G7, G17 im
Loop werden modifiziert
Sassanfar & Szostak, 1993
RNA Biochemie 06/18
SELEX: ATP-Aptamer
• Purin-reicher Loop bildet Bindungstasche
• Ausbildung von G-G Hoogsteen-Basenpaaren
• AMP interkaliert zwischen A10 und G11
• H-Brücken zwischen AMP und G8, A12
NMR-Struktur:
Jiang et al., 1996
Jhaveri et al., 2000
RNA Biochemie 06/19
SELEX: ATP-Aptamer
Base Stacking H-Brücken
Jiang et al., 1996
RNA Biochemie 06/20
SELEX: ATP-Aptamer
RNA-Aptamer
ATP
DNA-Aptamer
Hermann & Patel, 2000
RNA Biochemie 06/21
SELEX: ATP-Aptamer
Theophyllin
randomisiertT7 Promotor
Säule
Anlagerung
in vitroTranskription
RNA Pool
Sequenzpool: 1013-1015
(sequence space: 1024)
RT/PCR
RNA Biochemie 06/22
Theophyllin-Aptamer
10.0000-fach schlechtere Bindung!
Hermann & Patel, 2000
Theophyllin-Aptamer:
RNA Biochemie 06/23
Spezifität von Aptameren
Test auf Spezifität: kompetitive Bindungsexperimente