Medicinski fakultet Sveučilišta u Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu Zagrebu Zavod za patologiju Zavod za patologiju Laboratorij za molekularnu Laboratorij za molekularnu patologiju patologiju MOLEKULARNA MOLEKULARNA PATOLOGIJA PATOLOGIJA Marija Mišić, dipl. ing. biol.
Prezentacija iz molekularne patologije s Medicinskog fakulteta u Zagrebu (za studente ZVU)
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Medicinski fakultet Sveučilišta u ZagrebuMedicinski fakultet Sveučilišta u ZagrebuZavod za patologijuZavod za patologiju
Laboratorij za molekularnu patologijuLaboratorij za molekularnu patologiju
MOLEKULARNA MOLEKULARNA PATOLOGIJAPATOLOGIJA
Marija Mišić, dipl. ing. biol.
molekularne metode
imunohistokemijska analiza
Dijagnostička obrada u patologiji: histološka analiza
• Molekularna patologija služi utvrđivanju
promjena na biološki važnim molekulama
i staničnim strukturama radi utvrđivanja
uzroka bolesti, odnosno prognoziranja
njenog tijeka i ishoda.
• Mol. patologija omogućuje: razumijevanje temelja i uzroka bolesti postavljenje dijagnoza povezivanje specifičnih molekula s
prognozom bolesti upoznavanje mol. mehanizama bolesti i
ciljano liječenje
Materijali za dijagnostičku obradu Dijagnostika se prakticira na nukleinskim kiselinama (DNA i RNA) i proteinima. Uzorci na kojima se vrši izolacija NK i proteina mogu biti: svježi (krv, k. srž, brisevi...) konzervirani (blokovi tkiva u parafinu, tekućem dušiku...)
Molekularne metode u laboratorijskoj
dijagnostici:• izolacija NK i proteina
• PCR (Polymerase Chain Reaction), lančana reakcija polimerazom
Svježe uzorke potrebno je podvrgnuti što hitnijoj izolaciji dok za konzervirane uzorke nije nužna takva hitnost.
Izolacija NK je postupak koji se sastoji od tri
važna koraka:• liza stanica (mehanički, fizikalno i kemijski)• inaktivacija st. nukleaza• odvajanje NK od staničnog otpada
Lančana Reakcija Polimerazom
(PCR - Polymerase Chain Reaction)
• PCR je tehnika in vitro replikacije (umnožavanja) ciljanog dijela molekule DNA (1983., Kary B. Mullis).
• Djelomično oponašajući stanične mehanizme umnožavanja DNA, ova metoda omogućuje relativno brzo i ekonomski isplativo umnožavanje DNA iz vrlo malih količina početnog materijala.
Za replikaciju u uvjetima in vitro
potrebno je imati:
• Uzorak DNA / RNA - kalup• Početnice • Magnezijevi ioni• dNTP-ovi• Pufer• DNA polimeraza
Uzorak DNA / RNA - kalup
• Čistoća uzorka je presudna za efikasnost umnožavanja (nečistoće mogu sadržavati inhibitore polimeraze).
• DNA i RNA kompetiraju za Mg2+ ione (kontaminacija DNA uzoraka RNA materijalom i obratno smanjuje efikasnost umnožavanja).
• Bitna je optimalna koncentracija (previsoka koncentracija uzorka povećava postotak nespecifičnog vezanja; preniska koncentracija smanjuje prinos produkta)
• Koncentracije i čistoća uzorka se određuje spektrofotometrijski.
Početnice
Početnice su lanci koji služe kao početna točka DNA sinteze (vezuju se na komplementarne lance).
Mg2+ ioni
• formiraju topljive komplekse između
dNTP-ova i DNA uzorka - kalupa • stimuliraju aktivnost polimeraze • stabiliziraju vezanje početnica• u previsokim koncentracijama povećavaju
• deionizirana sterilna voda (Pro injectione) i dodaci (Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4)
• Odgovarajući pH
DNA polimeraza
• enzim odgovoran za sintezu DNA
• previsoka koncentracija dovodi do nespecifičnog vezanja
• preniska koncentracija smanjuje efikasnost umnožavanja
• polimeraza mora biti termostabilna na visokim temperaturama (Taq polimeraza dobiva se izolacijom iz termofilne bakterije Thermus aquaticus).
• U stanici se replikacija odvija uz pomoć
različitih enzima dok se kod PCR reakcije sve izvodi jednim enzimom - DNA polimerazom.
• Reakcija se izvodi u PCR uređaju koji može brzo mijenjati temperaturu u željenom ritmu.
• Tijekom PCR-a visoka temperatura se koristi za denaturaciju DNA, a umjesto malih RNA koje definiraju regiju koja se želi umnožiti koriste se sintetske početnice.
PCR ciklus se sastoji od tri faze:
1. Denaturacija DNA
2. Vezanje (hibridizacija) početnica na lance DNA
3. Produživanje (ekstenzija) lanaca DNA
Ciklusi se ponavljaju 30-40 puta.
Vrste Lančanih Reakcija Polimerazom
Klasična DNA lančana reakcija polimerazom
Reverse Transcription PCR
(RT-PCR)RNA se prevodi u cDNA i amplificira.
Koristi se pri: kontroli ekspresije gena utvrđivanje transkripcijskih START i STOP
regija na genomskoj DNA utvrđivanje položaja introna u genima
eukariotskih stanica
Quantitative real-time PCR (QRT-PCR)Mjeri se količina nastalih amplikona nakon
svakog ciklusa PCR reakcije (mjeri se
intenzitet fluorescencije specifično vezanih
fluorokroma u nekom vremenu).
Koristi se pri: utvrđivanju razlika u količini ekspresije različitih gena utvrđivanju razlika u
količini ekspresije jednog
te istog gena kroz dulji
vremenski period
(praćenje terapije)
Hot start PCR Proces započinje tek kada se dostigne
određena temperatura tako da je postotak
nespecifičnog vezanja početnica znatno
smanjen.
Blokada polimeraze pri nižim temeraturama
postiže se ručno, fizikalno ili kemijski.
Multiplex PCRU istoj reakcijskoj smjesi nalazi se više
različitih parova početnica te se istovremeno
amplificira nekoliko različito dugačkih
produkata.
. . .
Primjena lančane reakcije polimerazom u patološkoj dijagnostici:
• detekcija virusa i bakterija • detekcija specifičnih mutacija• kvalitativno i kvantitativno praćenje
ekspresije gena
. . .
Analiza restrikcijskih fragmenata (RFLP - Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
• Restrikcijski fragmenti su enzimi izolirani iz bakterija koji prepoznaju točno određeni slijed nukleotida od 4 do 8 baza u dvolančanoj DNA i kidaju oba lanca dvostruke uzvojnice.
• Većina mjesta prepoznavanja ima dvostruku rotacijsku simetriju (palindromi).
Nomenklatura restrikcijskih endonukleaza:EcoRI: Escherichia coli RYI3I – prva izolirana RE
Restrikcija
Po završenoj restrikciji, dobiveni DNA fragmenti analiziraju se gel elektroforezom.
Detekcija točkaste mutacije
Elektroforeza
• Elektroforeza je metoda razdvajanja nabijenih molekula koja se temelji na njihovom propuštanju prostorom u kojemu vlada razlika potencijala (prostor između dvije elektrode).
• Molekule će se u električnom polju kretati u ovisnosti o jakosti električnog polja, naboju, masi i obliku molekule koja migrira te o viskoznosti medija.
• Najčešće korišteni mediji za elektroforezu su agaroza i poliakrilamid.
Gel elektroforeza
Uređaj za horizontalnu gel elektroforezu
Agarozni gel obojan
etidij-bromidom
Elektroforeza nukleinskih kiselina:
• Nukleinske kiseline su negativno nabijene: putuju prema pozitivnoj elektrodi.
• Manji fragmenti putuju brže kroz gel od većih fragmenata.
G6 EWS/FLI-1
Metode hibridizacije
• U metodama hibridizacije iskorišten je osnovni princip sparivanja komplementarnih lanaca DNA ili RNA.
• Određuje se položaj (lokalizacija) DNA ili RNA slijeda direktno u kromosomima, interfaznoj jezgri, organelima i dr.
• Svrha: identifikacija numeričkih i strukturnih aberacija kromosoma.
• Područje: klinička citogenetika, citogenetika tumora (mikrodelecije i mikroduplikacije) i dr.
• Do danas je razvijen veći broj različitih
metoda koje koriste princip hibridizacije: Flourescencijska in situ hibridizacija - FISH Kromogena in situ hibridizacija - CISH Southern blotting Northern blotting
. . .
Flourescencijska in situ hibridizacija(FISH – Fluorescence In Situ Hybridization)
• Hibridizacijska metoda u kojoj se upotrebljava specifična DNA ili RNA proba za traženi gen koja je obilježena obilježena fluoroforom - molekulom koja flourescira.
• Najviše se koristi u dijagnostici leukemija i limfoma (otkrivanje amplifikacije gena, kromosomskih translokacija i dr.).
• Reakcija se očitava flourescencijskim mikroskopom s filterima za određenu "boju“.
• FISH analiza EWS gena ( “break-apart“ sonde): jezgre gdje se signali sondi razdvajaju → rearanžman regije EWS gena
Primjena FISH metode u dijagnostici HER-2 statusa kod karcinoma dojke
Kromogena in situ hibridizacija(CISH – Chromogenic In Situ Hybridization)
• Hibridizacijska metoda koja se koristi pri detekciji amplifikacije gena, kromosomskih translokacija i promjena u broju kromosoma.
• Prednosti CISH metode: vidljiva je morfologija stanica preparati su trajni (signali ne blijede)• CISH se dijagnostički često koristi za
određivanje HER2 statusa kod pacijentica s karcinomom dojke.
• Kopije HER2 gena obilježe se sondama in situ
hibridizacijom, a dobiveni signal vizualiziramo imunodetekcijom.
• Rezultati se očitavaju svjetlosnim mikroskopom (može se istovremeno pratiti amplifikacija gena i morfologija tumorskih stanica).
• Postupak: razgradnja DNA restrikcijskim endonukleazama razdvajanje molekula DNA elektroforezom u
agaroznom gelu razdvajanje niti DNA (denaturacija) prijenos DNA na nitroceluloznu membranu fiksiranje DNA za membranu hibridizacija s obilježenom sondom detekcija
• Northern blotting analizira RNA (ekspresija gena) i slična je metodi Southern blotting: RNA se prenosi na membranu i detektira hibridizacijom s obilježenom sondom.
Sekvenciranje
• Sekvenciranje je tehnika kojom se određuje redoslijed nukleotida molekule DNA.
• Metoda koja danas prevladava je Sangerova „dideoksi-metoda“.
• Postupak: razdvajanje lanaca molekule DNA, sparivanju početnice s 5'-krajem jednoga lanca sinteza komplementarnog lanca dok se ne ugradi ddNTP (reakcijska
smjesa: dNTP + ddNTP) analiza elektroforezom
Protočna citometrija
• Protočna citometrija omogućuje određivanje kemijskih i fizikalnih svojstava pojedinačnih stanica, te njihovo odvajanje.
Materijali za analizu: Svaka suspendirana čestica
(monodisperzija) u rasponu veličina od 0,2 do 150 µm je pogodna za analizu.
Stanični materijal može biti svjež (stanice iz kulture, krv, koštana srž, …) ili fiksiran (parafinizirani materijali).
Dijelovi protočnog citometra:
Protočni citometar sastoji se od tri sustava :• protočni sustav (čine ga tekući medij -
nosač za uzorak i splet cjevčica i rezervoara pod tlakom)
• optički sustav (izvor laserske svjetlosti- argonski ili ksenonski laser, filteri i sakupljačke leće)
• elektronski sustav (detektori i analizatori, te računalo)
Princip mjerenja
• Postupak mjerenja odvija se dok pojedinačne stanice struje u izotoničnom mediju u nosaču kroz protočni citometar. One tada bivaju obasjane laserskom svjetlošću, laserski snop se raspršuje na česticama događa se fluorescencija specifično vezanih fluorokroma nakon laserske ekscitacije.
• Na osnovu toga se dobivaju podaci o njihovoj relativnoj veličini, stupnju zrnatosti staničnog sadržaja i intezitetu fluorescencije specifično vezanih fluorokroma.
• Ovakva analiza u kojoj se istovremeno mjeri nekoliko parametara, naziva se multiparametrijska analiza.
• Protočna citometrija je analitička metoda kojom se simultano mjere:
intenzitet fluorescencije svjetlosno raspršenje laserskog snopa na
pojedinačnim česticama (najčešće stanicama) dok bivaju nošene strujom tekućine kroz svjetlosni snop.
Protočnu citometriju praktično je podijeliti na:
• strukturnu (analiza veličine i granuliranosti stanica, analiza intenziteta fluorescencije specifično vezanih fluorokroma, analiza sadržaja stanične DNA)
• funkcionalnu (analiza membranskog potencijala, aktivnosti enzima, transporta
• Analiza stupnja ploidije: brojčani pokazatelj stupnja ploidije je DNA-indeks. To je omjer relativnog sadržaja DNA G0-G1 faze staničnog ciklusa ispitivanog uzorka i relativnog sadržaja DNA stanica standarda.