Molekuláris genetikai-genomikai módszerek

Molekuláris genetikai-genomikai

módszerek

Falus András

POLIMORFIZMUS

Egy populáción belüli

genetikailag meghatározott különbség

Genomvariációk

Polimorfizmus

Deléció

Inszerció

Kromoszóma

Transzlokáció

Variációk

Gyakori szekvencia

Variációs típusok

Nagyméretű: – Kromoszóma számbeli– Kromoszóma átrendeződések, kromoszómaszegment

duplikációk, és deléciókKözepes:– Szekvencia ismétlődések (repeatek)– Transzpozonok– Kis deléciók, szekvenciális és tandem repeatek

(mikroszatelliták)Kicsi:– Single Nucleotide Polymorphisms (SNP-k)– Egyetlen bázis érintő inszerciók és deléciók (indelek)

SNP

Mi az SNP (Single Nucleotide Polymorphism)?

ATGGTAAGCCTGAGCTGACTTAGCGT ATGGTAAACCTGAGTTGACTTAGCGT snp snp

Az SNP-k replikációs hiba vagy DNS károsodás révén jönnek létre.

Ugyanahhoz a fajhoz tartozó két egyed közöttegyetlen bázis eltérése ugyanabban a DNS

pozícióban, gyakoriság >1 % .

Az SNP-k típusai

• Génben lévő, kódoló SNP-k– Nem-szinoním

• Fenntartja vagy megváltoztatja a fehérje szerkezetét/funkcióját

– szinoním• Fenntartja vagy megváltoztatja a splicing-ot

• Génben lévő, nem-kódoló SNP-k– Szabályozó/Regulációs SNP-k

• Fenntartja vagy megváltoztatja a génexpressziót

– Intronban lévő SNP-k• Fenntartja vagy megváltoztatja a génexpressziót/splicing-ot

• Kapcsolt SNP-k (túlnyomó számú)– Rendszerint gének közöttiek (intergenikusak)

Az SNP-k megváltoztathatják vagy változatlanul hagyhatják a fehérje szerkezetét

Fehérjeleucinról leucinra

Nincs változás a fehérje

szerkezetében

RNS kodonCUC-ról CUG-re

DNS SNPC-ről G-re

LeucinLeucin

mRNS

SNP térképek

• Sok ember genomjának szekvenálása

• A bázissorrendek összehasonlítása az SNP-k

felderítése céljából

• Egy olyan humán genomtérkép elkészítése, ami az összes SNP-t tartalmazza = ez az SNP térkép

• Emberi genomban ~10.000.000 SNP (1/300)

SNP térképek

Az összes szekvenált kromoszóma

Az összes regisztrált SNP

SNP pozíció

SNP Profil/Mintázat

• Minden egyes ember genomja egy sajátos SNP mintázatot hordoz.

• Az emberek SNP profiljuk/mintázatuk alapján csoportosíthatók.

• Az SNP profilok fontosak a gyógyszeres terápiában a válaszkészség meghatározásában.

• Kapcsolat lehet bizonyos SNP profilok és egy bizonyos kezelésre adott meghatározott válaszreakciók között.

Betegség iránt fogékony populáció

Az összes egyed genotipizálása sok ezer SNP-re

ATGATTATAG ATGTTTATAG

Az összes rezisztens személynek A van az X gén 4-es pozíciójában, míg minden fogékonynak T van ugyanabban

a pozícióban

génX

Rezisztens populáció

SNP Profilok

AZ SNP-k felhasználása

• Génazonosítás és –térképezés

• Diagnosztika/kockázat becslés• • A válaszreakció megbecslése

• Homogenitás vizsgálat/kísérlet tervezés

• A gén funkciójának azonosítása

Az SNP adatok felhasználása

• Evolúciós vizsgálatok Különböző polpulációk evolúciós történetének felderítésére

• „DNS ujjlenyomat”készítés Apasági vizsgálatok, bűnügyek

• Markerként használhatók poligénes jellegek térképezése során• Genotípus specifikus gyógykezelés

• A legtöbb gén SNP-ket tartalmaz – A gének 93%-ának egynél több SNP-je van– 39%-uk 10-nél több SNP-t tartalmaz!

Van-e összefüggés a marker megléte és a betegség között?

Betegségre hajlamosKontroll

Betegségre nem fogékony

Allél 1 Allél 2

Az A marker összefüggést mutat

a fenotípussal

A Marker :

Allél 1 =

Allél 2 =

Következtetés korábbi adatokból és megfigyelésekből

Patient 1Patient 2Patient 3Patient 4Patient 5Patient 6Patient 7Patient 8Patient 9Patient 10Patient 11Patient 12

Good responseNo responseNo responseGood responseNo responseNo responseGood responseGood responseGood responseGood responseNo responseNo response

ATGCTTCCCTTTTAAAATTGTTCCCTTTTAAAATTGTTGCCTTTTAAAATGGTTGCCTTTTAAAATAGTTGCCTTTTAATATAGTTGCCTTTTAATATGATTGCCTTTTAAAATGATTGGCTTTTAAAATGTTTCGCTTTTAAAATGTTTTGCTTTTAAAATTTTTTGCTTTTAAAATCTTTTGCTTTTAAA

SNP: single nucleotide polymorphism

Good response

Good responseGood responseGood responseGood response

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Következtetés előre; ki fog jól válaszolni a gyógyszerre?

From McLeod and Evans, Ann Rev of Pharmacol and Toxicol, 2001: 41,101-121

GCCCACCTC

GCCCGCCTC

A farmakogenomika nagy igérete• "Pharmacogenomics will

radically change the manner in which we develop drugs."

• "Soon, we will be able to get the right drug into the right patient."

• "Applying pharmacogenomics to drug development will cut cycle times to 1.5 - 2 years."

• "Pharmacogenomics will be able to bring removed drugs back on the market, by predicting who is susceptible to adverse events."

Közel vagyunk???

REPEATS

TRINUKLEOTID (TRIPLET) REPEAT BETEGSÉGEK

A trinukeotid repeatek nagyon gyakori szekvenciák - a legtöbb nem kapcsolódik betegséggel - sok közülük polimorf (változik a repeatek száma)

Két fő típusuk van - Nem-kódoló eltérő mechanizmusúak

- Kódoló poliglutamin polialanin

Poliglutamin Polialanin betegségek

• Neurodegeneratív betegségek

• Különböző fehérjék

• Funkciónyerés

• Változó hosszúság

• Expanzió

• Replikációs csúszás

• CAG vagy CTG repeat

• Fejlődési rendellenességek • Transzkripciós faktorok • Funkcióvesztés

• +/- Konstans hossz • Állandó

• Egyenlőtlen crossing over

• GCA, GCT, GCG, GCC repeatek - nem teljesek

a/ feltüntetett repeatszámok a normális tartományra jellemző értékek;b/ zárójelben az érintett fehérjék neve szerepel

(huntingtin)

= kódoló szakaszban = nem kódoló szakaszban

(Huntingtin)

MATLEKLMKAFESLKSFQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQPPPP

PPPPPPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPPPPPPPPPPGPAVAEEPLHRPK

KELSATKKDRVNHCLTICENIVAQSVRNSPEFQKLLGIAHELFLLCSDD...

HUNTINGTIN

350 kD fehérje

10-11 kb transzkriptum

mindenütt expresszálódik

ismeretlen funkció összefüggés a repeat-számés a betegség kezdete között

Huntington’s DiseaseCollaborative Research

Group 1993 nyomán

PCR

Q-PCR

MICROARRAY-CHIP

Összehasonlító hibridizáció

Két különbözőbiológiai forrás(pl. beteg/egészséges)

Microarray OverviewMicroarray Overview

Prepare FluorescentlyPrepare FluorescentlyLabeled ProbesLabeled Probes

ControlControl

TestTest

Hybridize,Hybridize,WashWash

MeasureMeasureFluorescenceFluorescencein 2 channelsin 2 channels

redred//greengreen

Analyze the dataAnalyze the datato identifyto identifypatterns ofpatterns of

gene expressiongene expression

Diffúz nagysejtes B sejt lymphoma

•Szövettani•Immunológiai•PCR (egyes gének) módszerrel

Eddig nem voltdiff. diagnózisa:

A melanoma máj metastasis prediktor génkészlete

Előre jelezni melyik melanomás betegnek lesz májáttétje??

Az egyes betegek mintáiból készült mikroarray-k

Az adatok számítógépes csoportosítása

Minták (X-tengely)

Gének(102 -103)

Diagnózis, megelőzés, terápia meghatározása

Prediktor gének kiválasztása

A betegségre nézve szelektív mikroarray fejlesztése

A mikroarray orvosi gyakorlatban való felhasználásának elvi háttere

SINGLE-BASE EXTENSION

3’ 5’

PCR target

SNP site

Labeled terminating NTP

TagSNP primer

5’

3’ 5’

SNP Primer

Tag complement forHybridization capture

Substrate (spot on plate)

Denature & Hybridize

Primer Extention

http://www.dgci.sote.hu/microarray

http://www.dgci.sote.hu/snpcore