Linköping Studies in Science and technology Dissertation No. 1179 Molecular Aspects of Transthyretin Amyloid Disease Karin Sörgjerd Biochemistry Department of Physics, Chemistry and Biology Linköping University, SE- 58183 Linköping, Sweden Linköping 2008
77
Embed
Molecular Aspects of Transthyretin Amyloid Disease
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Linköping Studies in Science and technologyDissertation No. 1179
Molecular Aspects of
Transthyretin Amyloid Disease
Karin Sörgjerd
BiochemistryDepartment of Physics, Chemistry and Biology
Abstract This thesis was made to get a deeper understanding of how chaperones interact with unstable, aggregation prone, misfolded proteins involved in human disease. Over the last two decades, there has been much focus on misfolding diseases within the fields of biochemistry and molecular biotechnology research. It has become obvious that proteins that misfold (as a consequence of a mutation or outer factors), are the cause of many diseases. Molecular chaperones are proteins that have been defined as agents that help other proteins to fold correctly and to prevent aggregation. Their role in the misfolding disease process has been the subject for this thesis. Transthyretin (TTR) is a protein found in human plasma and in cerebrospinal fluid. It works as a transport protein, transporting thyroxin and holo-retinol binding protein. The structure of TTR consists of four identical subunits connected through hydrogen bonds and hydrophobic interactions. Over 100 point mutations in the TTR gene are associated with amyloidosis often involving peripheral neurodegeneration (familial amyloidotic polyneuropathy (FAP)). Amyloidosis represents a group of diseases leading to extra cellular deposition of fibrillar protein known as amyloid. We used human SH-SY5Y neuroblastoma cells as a model for neurodegeneration. Various conformers of TTR were incubated with the cells for different amounts of time. The experiments showed that early prefibrillar oligomers of TTR induced apoptosis when neuroblastoma cells were exposed to these species whereas mature fibrils were not cytotoxic. We also found increased expression of the molecular chaperone BiP in cells challenged with TTR oligomers. Point mutations destabilize TTR and result in monomers that are unstable and prone to aggregate. TTR D18G is naturally occurring and the most destabilized TTR mutant found to date. It leads to central nervous system (CNS) amyloidosis. The CNS phenotype is rare for TTR amyloid disease. Most proteins associated with amyloid disease are secreted proteins and secreted proteins must pass the quality control check within the endoplasmic reticulum (ER). BiP is a Hsp70 molecular chaperone situated in the ER. BiP is one of the most important components of the quality control system in the cell. We have used TTR D18G as a model for understanding how an extremely aggregation prone protein is handled by BiP. We have shown that BiP can selectively capture TTR D18G during co-expression in both E. coli and during over expression in human 293T cells and collects the mutant in oligomeric states. We have also shown that degradation of TTR D18G in human 293T cells occurs slower in presence of BiP, that BiP is present in amyloid deposition in human brain and mitigates cytotoxicity of TTR D18G oligomers.
Included papers Paper I: Detection and characterization of aggregates, prefibrillar amyloidogenic oligomers, and protofibrils using fluorescence spectroscopy., Lindgren M, Sörgjerd K, Hammarström P., Biophys J. 2005 Jun;88(6):4200-12. Paper II: Prefibrillar Amyloid Aggregates and Cold Shocked Tetrameric Wild Type Transthyretin are Cytotoxic. Sörgjerd K, Klingstedt T, Lindgren M, Kågedal K, Hammarström P. In manuscript. Paper III: Retention of misfolded mutant transthyretin by the chaperone BiP/GRP78 mitigates amyloidogenesis., Sörgjerd K, Ghafouri B, Jonsson BH, Kelly JW, Blond SY, Hammarström P., J Mol Biol. 2006 Feb 17;356(2):469-82. Paper IV: BiP can function as a molecular shepherd that alleviates oligomer toxicity and amass amyloid. Sörgjerd K.,Wiseman R.L, Kågedal K., Berg I., Klingstedt T., Budka H, Nilsson K.P.R., Ron D., Hammarström P. In manuscript.
Sammanfattning Denna avhandling handlar om proteiner. Särskilt de som inte fungerar som de ska utan har blivit vad man kallar ”felveckade”. Anledningen till att proteiner veckas fel beror ofta (men inte alltid) på mutationer i arvsmassan. Felveckade proteiner kan leda till sjukdomar hos människor och djur (man brukar tala om amyloidsjukdomar), ofta av neurologisk karaktär. Exempel på amyloidsjukdomar är polyneuropati, där perifera nervsystemet är drabbat, vilket leder till begränsad rörelseförmåga och senare till förlamning; och Alzheimer´s sjukdom, där centrala nervsystemet är drabbat och leder till begränsad tankeförmåga och minnesförluster. Studierna som presenteras i denna avhandling har gått ut på att få en bättre förståelse för hur felveckade proteiner interagerar med det som vi har naturligt i cellerna och som fungerar som skyddande, hjälpande proteiner, så kallade chaperoner. Transtyretin (TTR) är ett protein som cirkulerar i blodet och transporterar tyroxin (som är ett hormon som bland annat har betydelse för ämnesomsättningen) samt retinol-bindande protein (vitamin A). I TTR genen har man funnit över 100 punktmutationer, vilka har kopplats samman med amyloidsjukdomar, bland annat ”Skellefteåsjukan”. Mutationer i TTR genen leder ofta till att proteinet blir instabilt vilket leder till upplösning av TTR tetrameren till monomerer. Dessa monomerer kan därefter sammanfogas på nytt men denna gång på ett sätt som är farligt för organismen. I denna avhandling har fokus legat på en mutation som kallas TTR D18G, vilken har identifierats i olika delar av världen och leder till en dödlig form av amyloidos i centrala nervsystemet. Det chaperon som vi har studerat benämns BiP och är beläget i en cellkomponent som kallas för det endoplasmatiska retiklet (ER). I ER finns cellens kontrollsystem i vilket det ses till att felveckade proteiner inte släpps ut utan istället bryts ned. Denna avhandling har visat att BiP kan fånga upp TTR D18G inuti celler och där samla mutanten i lösliga partiklar som i detta fall är ofarliga för cellen. Avhandligen har också visat att nedbrytningen av TTR D18G sker mycket långsammare när BiP finns i riklig mängd.
Abbreviations ANS 8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid Bis-ANS 4-4-bis-1-phenylamino-8- naphthalene sulfonate CNS central nervous system CtD C-terminal domain DCVJ 4-(dicyanovinyl)-julolidine ER endoplasmic reticulum FAP familial amyloidotic polyneuropathy LCP luminescent conjugated polymer MTT 3[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide NBC neuroblastoma cells NtD N-terminal domanin RBP retinol binding protein SDS-PAGE sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis SSA senile systemic amyloidosis ThT thioflavin T T4 thyroxin TEM transmission electron microscopy TTR transthyretin TTR D18G transthyretin with amino acid substitution from aspartic acid to
glycine at position 18 UPR unfolded protein response
Tack Denna bok sammanfattar vad jobbat med och kommit fram till under nästan fem års tid. Jag är glad att den äntligen är skriven, och att den verkligen blev skriven. För det hade inte hänt om det inte varit för vissa personer som finns i mitt liv. Personer som indirekt eller dierkt har stöttat mig under min tid som doktorand (och som människa). Somliga har varit involverade i mitt forskningsprojekt medan andra helt enkelt har bidragit till att göra mig lycklig. Alla bidrag har varit lika viktiga. Om jag inte nämnt någon är det inte för att jag glömt utan för att jag är tankspridd.
Per Hammarström. Du är garanterat den bästa handledare man kan ha! Tack för ditt oändliga tålamod. Tack för alla konferenser jag fått åka på. Tack för att du stöttade mig i viljan och beslutet att åka till och jobba i USA. Jag är imponerad över att du kan så mycket, förstår så mycket och för att du villigt och generöst delar med dig av det. Tack också för all den tid du har gett mig, för att du alltid trott på mig, för ditt enormt trevliga sätt, för ditt engagemang och för ditt stöd. Katarina Kågedal. Det har varit underbart att få samarbeta med dig. Vårt gemensamma projekt har varit fantastiskt roligt och det är sorgligt att det inte kan pågå för alltid. Tack för ditt varma sätt, dina uppmuntrande ord och för din hjälpsamhet. Jag tycker att du är toppen och kommer att sakna dig. Luke Wiseman and David Ron. Thank you for welcoming me in your lab and for letting me spend six months there. Thank you for your time and for your endless support. Thank you for pushing me, for helping me, and for believing in me. The people in the Ron lab. Thank you for contributing to a nice environment at Skirball institute and for making me feeling comfortable. Stefan Klintström. Tack för den positiva energi du sprider omkring dig och för allt det goda du gör för Forum Scientium och alla doktorander som är med där. Tack också alla i Forum Scientium för inspiration, härlig stämning och roliga studieresor. Mikael Lindgren. Tack för trevliga samarbeten. Du är en oändlig källa av kunskap. Tack för att du hjälpte mig att skriva en post doc ansökan. Bijar Ghafouri. Tack för tålmodigt sekvenserande av transtyretin med mig. Tack vare dig föll sista pusselbiten på plats i min första artikel. Bengt-Arne Fredriksson. Tack för hjälp med elekrtonmikroskopi-körningar som resulterade i utmärkta bilder av TTR. Rajesh Mishra. Thank you for being a nice office partner for two years, for helping me with writing my resume and for being a good companion. Sylvie Blond. Thank you for
De jag vill tacka är:
nice cooperation with the BiP work. Linda Hendershot. Thank you for providing me with BiP antibody. Tack alla på Patologen II för att ni låtit mig springa där och för att ni alltid varit trevliga och välkomnande. Min mentor Kajsa Uvdal. Tack för givande samtal som gjort mig inspirerad och glad. Tack för ditt engagemang och för att du övertygade mig om att 30 inte är en ålder när jag hade 30-årskris. Susanne Andersson, tack för hjälp med blanketter, iväg-skickande av paket, svarande på dumma frågor och mycket annat. Du verkar ha koll på det mesta. Louise Gustavsson Rydström, tack för att du är en så bra personalintendent och tack Rita Fantl för att även du har haft koll på administriva saker och alltid varit vänlig och trevlig. Tack alla medarbetare på biokemi-avdelningen, ni som kommit, ni som gått och ni som fortfarande finns kvar. Ni har alla bidragit till en positiv stämning i labbet, fikarummet och i korridorerna, vilket är ovärderligt. Särskilt tack till ”seniorerna” Uno Carlsson, Maria Sunnerhagen, Peter Nilsson, Nalle Jonsson, Magdalena Svensson, Kristina Borén och Martin Karlsson för all kunskap ni besitter och för att ni spridit den vidare. Speciellt tack till Nalle som med stor välvilja hjälpte mig med ultracentrifugkörnigar, även när kvällarna blev sena. Jag vill såklart också nämna självaste Hammarström-gruppen som har jag varit stolt (nästan mallig) över att tillhöra och som jag inte kunnat haft mer tur med. Ni har både varit trevlig sällskap och god hjälp under många år. En liten familj på jobbet helt enkelt, och ni består av (förutom ovan nämnda handledare).... Mina kontorskompisar Ina och Therése. Vad jag kommer att sakna er. Tack Ina för den ljusblå alla-hjärtans-dags filten jag fick när jag som mest behövde den, den har värmt mig varje dag och värmer mig fortfarande. Tack för diskussioner, råd och stöd som både har haft och inte har haft med jobbet att göra men alltid varit lika viktiga. Therése, min första och sista exjobbare, som jag lämnade för en vistelse i USA, jag önskar att jag vore så duktig som du är. Tack för input och för hjälp jag fått i mitt manusförfattande och avhandlingsarbete. Och tack för leverens av alla salta blåbär. De har gett mig oförväntad energi när jag mest behövt det. Karin, mitt bästa konferensresesällskap, vad hade Salt Lake City varit utan dig? Jag vet att du tycker att jag har överdrivit temperaturen på hotellrummen ibland men tur att du stått ut ändå... Ingen annan har heller förstått vikten av onödigt dyrt schampo. Sofie, det var bara du och jag när det började. Sedan blev det fler. Tack för att du varit med mig under hela resan. Du är imponerande och duktig och jag tror starkt på dig. Daniel, tack för att du är så hjälpsam och så snäll, för att du lyfter saker som är tunga och för att du fixar med tekniska prylar och sånt jag inte begriper mig på. För att bibehålla energi, motivation och gott humör har det även varit viktigt med luncher och fikaraster. Och vad hade dessa varit om inte ni runt runda bordet funnits... Tack alla ni som suttit där, men inte bara där.... Speciellt vill jag tacka:
Cissi, för att du provkörde en bil med mig, även fast jag inte köpte den. Tack också för att du alltid ställer upp och har en så avslappnad och skön attityd. Veronica, tack för att du hälsade på i New York, det var upplyftande och roligt. Du verkar ha en bekymmersfri ådra som gör att man blir glad av att umgås med dig. Patricia, du har garanterat bakat de godaste kakorna under åren. Tack för dem. Synd att de inte blev fler... Anngelica, du var saknad redan första dagen du var borta från jobbet. Dessutom är du den bästa hyresvärdinna man kan ha, tack för att du hade bäddat sängen åt mig när jag kom hem från USA och tack för att du lade fram rena handdukar. Satish, it is nice to have you around. You contribute to the international feeling on Biokemi, I like that. Stort tack också till alla exjobbare som varit med under delar av resan, samt övriga doktorander som jag stöter på i korridorer och i fikarum. Till gamla medarbetare som jag vill nämna hör: Carin, vad jag saknade dig när du slutade och flyttade till Stockholm, men vad roligt vi har när vi ses. Tack för trevliga stunder och för ditt uppriktiga engagemang i mitt ibland röriga liv. Amanda, tack för springturer (trots att vi springer vilse ibland), promenader och givande samtal. Tack för att du alltid lyssnar, stöttar och för att du får mig att skratta. Louise, tack för att du tar med mig på konserter, tack för att du tar dig tid att träffa mig när och tack för att du är en sådan bra vän. Laila, du är min favorit-fotograf. Tack för att jag fick vara fotomodell. Tack också för trevligt resesällskap, många resmål har det blivit... Alla studiekompisar och övriga kompisar har varit viktiga för mig. Speciellt tänker jag på: Malin, du var min bästa studiekamrat som hjälpte mig att fixa tentor. Utan dig hade jag kanske inte varit här idag. Synd att vi inte ses oftare men när vi träffas vet vi att vår vänskap varar ändå. Tack för många och långa givande telefonsamtal under åren. Isabelle, tack för att du alltid förstår vad jag säger och tack för att jag får vara din vän. Tack för alla år som jag varit korridorskamrat med dig och för den fantastiska tiden i Provence som var en av de bästa i mitt liv. Tack också för att jag alltid är välkommen till dig och för att jag fick ha min 30-års-fest hos dig. Erika, min barndomsvän och äldsta vän. Vi har känt varandra sedan vi var pyttesmå. Tack för att du alltid funnits vid min sida och för att du aldrig svikit mig, för att du vet allt om mig, och litet till, men tycker om mig ändå. För att du aldrig dömer men alltid uppmuntrar. Jennie, du är den bästa ryssa man kan ha. Tack för att jag kan skratta så hysteriskt när jag är med dig. Det började i franska-gruppen (alla minns oss därifrån, jag lovar...) och vi fnittrar lika mycket än. Det är roligt. Tack också Marcus för att även du accepterar mig som en liten del av ditt liv ;-) Gummorna; Johanna, Sarah och Sofia, tack för fantastiska tjejträffar med energipåfyllnad, struntprat och glädje. Det måste bli många fler. Sarah, jag är glad över att jag har fått uppleva så mycket roligt och tokigt med dig under många år. Sofia, jag är glad över att ha fått lära känna dig och jag hoppas vi kommer att ses oftare när jag kommer till Stockholm. Johanna, tack för det fantastiska stöd du varit för mig många gånger när jag känt mig nere och för den energispruta du är när vi ses. Jag har alltid blivit gladare av att träffa dig, oavsett hur jag känt mig från början. Mari, tack för att du kom till New York och hälsade på mig, för att du alltid säger så bra saker och tack för att du alltid lyssnar. Linda, jag är glad över att du lämnat solen i Spanien och kommit hem till kalla Sverige, då kan vi ju ses
oftare i framtiden... Izabela, tack för alla goda minnen sedan lååångt tillbaka. Hanna och Maria, vad hade Flamman varit utan er... Min New York-tid var rolig och intensiv. Mycket arbete blev det men även mycket annat i den stad som aldrig sover.... Tack Sara, Michelle, Cissi, Thomas, Thomas och Per Anders. Det var ni som gjorde New York för mig. Utan er hade jag inte varit något där. Sara, utan dig hade jag inte haft så många par skor med mig hem till Sverige. Tack för excellent shoppingsällskap. Michelle, synd att vi bara var roomates i en månad men bara efter några dagar med dig kändes det som vi känt varandra i ett helt liv. Cissi och Thomas; det kändes tryggt att lära känna Östgötar i New York, och kul att lära känna just er! Merci Thomas, pour d´être fantastique och tack Per Anders för tillförsel av djup i mitt liv. Polle, min gamle kompis och Ulla, min söta gudmor, tack för att ni alltid funnits i mitt liv. Christian, tack för alla år du var tillsammans mig. Du kommer alltid att ha en speciell plats i mitt hjärta. Min syster Maria, jag är glad över att just du är min syster. Tack för energipåfyllnad jag får när jag kommer till Uppsala och för att jag alltid är välkommen dit. Min svägerska Caroline, du hade inte kunnat vara en bättre svägerska, jag är glad över att du träffade Maria, och för att du finns även på min sida när jag behöver det. Mina älskade syskonbarn Estelle och Lovisa, ni ger mig livsglädje. Mamma och pappa, tack för att ni älskar mig, för att ni tror på mig och för att ni finns.
1
Table of contents
Table of contents _____________________________________________________1
Proteins_____________________________________________________________5 Protein production- the background story ___________________________________________6 Protein folding ________________________________________________________________8 Genetic mutations _____________________________________________________________9 Protein misfolding ____________________________________________________________10
Transthyretin (TTR)__________________________________________________13 The TTR D18G mutation_______________________________________________________18
Molecular chaperones ________________________________________________21 BiP ________________________________________________________________________22 Structure and mechanism of BiP _________________________________________________23 A role for BiP during translocation _______________________________________________25 The role of molecular chaperones in misfolding diseases ______________________________25
The ER, cellular stress and cell death____________________________________27 The unfolded protein response (UPR) _____________________________________________28 Apoptosis ___________________________________________________________________31 Caspases____________________________________________________________________31
Methods ___________________________________________________________33 Cloning, mutagenesis__________________________________________________________33 SDS-PAGE and Western blotting ________________________________________________33 Circular Dichroism____________________________________________________________33 Fluorescence spectroscopy______________________________________________________34 Chemical cross-linking ________________________________________________________35 Transmission Electron Microscopy (TEM) _________________________________________35 Affinity chromatography and immunoprecipitation___________________________________36 Analytical ultracentrifugation ___________________________________________________36
Results_____________________________________________________________37 Paper I________________________________________________________________ 38
Cross-linking to probe formation of aggregates______________________________________38 Size and morphology of aggregates and protofibrils __________________________________39 Characterization of TTR conformers using molecular probes ___________________________40 Different kinetics for different probes _____________________________________________41
Paper II _______________________________________________________________ 42 Early oligomeric species of TTR kill human cells____________________________________42 Early oligomeric species of TTR induce ER stress ___________________________________44
Paper III ______________________________________________________________ 45 BiP selectively binds to destabilized variants of TTR _________________________________45 Composition of the BiP- TTR D18G complex_______________________________________46 The BiP- TTR D18G interaction _________________________________________________46 BiP plays a protective role against the toxic effects of TTR D18G _______________________47
2
Paper IV ______________________________________________________________ 49 BiP interacts with TTR D18G in the mammalian ER _________________________________49 The degradation rate of TTR D18G is slowed down in the presence of BiP ________________49 The BiP- TTR D18G complex was present in a wide distribution of molecular weights ______51 BiP can protect cells from TTR D18G cytotoxicity___________________________________52 BiP is found in TTR D18G aggregates in patient tissue _______________________________53
The purified BiP-TTRD18G complex was further analyzed to get an idea of its
molecular composition. Size exlusion chromatography using a Superdex 75
gelfiltration column and analytical ultra centrifugation revealed that the BiP-TTRD18G
complex was composed of a variety of species with molecular masses ranging from
336 kDa to 75,5 kDa. By calculating the ratio between the two proteins against the
molecular mass of complexes, it became clear that the ratio between FT2-TTRD18G and
His6-BiP increased with increasing molecular weight, showing that a mixture formed
of 1:1 complexes and complexes dominated by mutant TTR over BiP.
The BiP- TTR D18G interaction
To identify which part of TTR that BiP binds, we used acid unfolded TTR wt as a
template, which we cleaved with trypsin and analyzed with MALDI-TOF mass
spectrometry. 97% of the TTR sequence is covered with trypsin digestion and three of
the best predicted binding sites, according to the BiP score software, were separated.
His6-BiP was incubated with the TTR fragments and any captured fragment was
purified with Ni-NTA chromatography (binding His6-BiP). One fragment was bound
47
Figure 20) The binding site for BiP in the TTR molecule. The F-strand in the TTR molecule was
found to be its binding site for BiP.
to BiP, identified with MALDI-TOF. The sequence of the fragment was identified
using electron spray ionization (ESI) tandem mass spectrometry (MS/MS). The
yielded tag was searched against NCBI database and was identified as the TTR
sequence 88-103 which corresponds to the C-terminal part of the 81-103 fragment
from trypsinated TTR. Interestingly, the 88-103 sequence includes the complete
sequence of β-strand F in the folded, monomeric TTR (Figure 20). Since the F strand
in one monomer connects to another F-strand in another monomer to form a dimer,
BiP binding to F-strands would therefore compete with F-strands in monomeric TTR
and compromise formation of dimers and also tetramers. The F-strand is also involved
in packing of growing amyloid fibers [93]. Formation of fibrils might therefore be
interrupted when BiP binds to the amyloid formation interface and kept it in a soluble
form.
BiP plays a protective role against the toxic effects of TTR D18G
To investigate what would happen with TTR D18G bound to BiP when released from
BiP, we purified the complex and then added ATP to the sample. Since BiP is an ATP
dependent chaperone, it releases its substrate when treated with ATP. We followed
48
A
B
Figure 21) BiP protects from TTR D18G cytotoxicity by keeping it in a soluble form. A)
Micrographs of TTR D18G complex before (upper left) and after (upper right) addition of ATP. ATP
releases substrates from BiP, and release of TTR D18G results in aggregation. B) ThT fluoresecence of
BiP/TTR D18G (filled bars) and BiP (open bars) before and after addition of ATP or addition of the
competitive peptide 88-103 TTR. Without incubation (w/o inc), without ATP, 37˚C incubation for 18 h
(37˚C no add), with ATP, 37˚C, 18h (37˚C ATP), with 88-103 TTR peptide, 37˚C, 18h (37˚C 88-103).
the process with transmission microscopy, ThT binding and SDS-PAGE before and
after treatment with ATP. Release of TTR D18G from BiP resulted in formation of
visible, insoluble aggregates that not could be seen when it was in complex with BiP.
We also treated the BiP/TTR D18G complex with the peptide TTR 88-103 to see if it
could compete with TTR D18G for BiP binding sites. The competing peptide resulted
in a small amount of released TTR D18G which was detected with ThT fluorescence.
We received about 30% increase of ThT fluorescence compared to the sample that
was not incubated with peptide (Figure 21B). We assume that BiP plays a protective
role against the toxic effects of TTR D18G by maintaining TTR in a soluble, here
benign, oligomeric form.
49
Paper IV
In this paper, the idea was to obtain a cell biological aspect of BiP/TTR D18G binding
and to investigate if the E.coli derived complexes could be confirmed in a human
cellular system. We wanted to study complex formation between BiP and TTR D18G
in vivo and used human 293T kidney cells to overexpress the proteins. We also
wanted to investigate if BiP would influence the degradation rate of TTR D18G.
We could clearly see that the complex was formed in vivo in human cells, which
confirmed our previous results. It is also known from before that BiP has the ability to
oligomerize. We found that BiP did not prevent aggregation of TTR D18G, but rather
oligomerized with it, both in soluble and insoluble aggregates. Surprisingly,
aggregates seemed to accumulate inside the ER. We also found that the degradation of
TTR D18G was altered in presence of a high amount of BiP.
BiP interacts with TTR D18G in the mammalian ER
In paper IV, we transfected human kidney cells with TTR D18G or BiP and thereafter
analyzed the cell lysate using immunoprecipitation and western blotting (Figure 22).
Both soluble and insoluble proteins were analyzed and both BiP and TTR D18G were
present in both fractions. BiP seemed to increase the amount of soluble TTR D18G
when they were co-expressed. BiP appeared to co-fractionate with aggregated TTR
D18G, this is also in accordance of what we found in paper III.
The degradation rate of TTR D18G is slowed down in the presence of BiP
Since TTR D18G is extremely aggregation prone and appeared to accumulate in the
ER, we were interested in investigating its degradation rate in live cells. Pulse chase
(S35) analysis of transfected 293T cells with TTR D18G or TTR D18G and BiP were
performed and showed that overexpression of BiP reduced the degradation rate
(Figure 23).
50
Figure 22) Selective binding of mutant TTR. Cells expressing Flag-BiP and/or TTRwt or TTR D18G
were lysed with triton. The triton supernatants (containing the soluble protein fractions) and the triton
pellets (containing the insoluble protein fractions) were collected. Immunoprecipitation with anti-TTR
antibody shows that Flag-BiP is pulled down with TTR D18G and to a small extent with TTR wt. The
amount of soluble TTR D18G seemed to increase when BiP was overexpressed.
Figure 23) The TTR D18G degradation rate is slowed down in presence of BiP. Pulse chase
analysis results showed that the degradation of TTR D18G alone (circles) occurred faster than when
BiP was overexpressed in the cells (squares).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 2 4 6 8 10
TTR D18GBiP: TTR D18G
Tota
l fra
ctio
n
Pulse
Chase (h) 0 3 6 9 0 3 6 9
Supernatant
Pellet
BiP D18GD18G
Chase (h) 0 3 6 9 0 3 6 9
Supernatant
Pellet
BiP D18GD18G
Triton PelletTriton Supernatant
Flag-BiP
TTR
eIF2alpha
+ + + +
+ + + +
+ + + + + +
75
37
15
TTRwt
TTR D18G
Flag BiP
Triton PelletTriton Supernatant
Flag-BiP
TTR
eIF2alpha
+ + + +
+ + + +
+ + + + + +
75
37
15
Flag-BiP
TTR
eIF2alpha
+ + + +
+ + + +
+ + + + + +
+ + + +
+ + + +
+ + + + + +
75
37
15
TTRwt
TTR D18G
Flag BiP
51
The BiP- TTR D18G complex was present in a wide distribution of molecular weights
In paper III, we showed that soluble complexes of BiP and TTR D18G, purified from
E.coli bacteria, existed as a broad distribution of molecular weights. In paper IV, we
analyzed both the soluble protein fractions, and the insoluble protein fractions from
eukaryotic cells overexpressing TTR D18G and BiP. A glycerol gradient was
performed to determine the size distribution of oligomers in the soluble fractions, and
the influence of BiP on oligomer size (the insoluble fractions were treated with SDS
and DTT in order to denature them; the results were investigated using SDS-PAGE
and Western blotting with TTR antibody). We found that both BiP and TTR D18G
were abundant the soluble fractions and that for the TTR D18G fractions expressed
alone, the large oligomers dominated and also a significant amount of small oligomers
were present. For the TTR D18G protein co-expressed with BiP, the distribution of
molecular weights was evenly spread throughout the glycerol gradient. Hence, BiP
appear to shift large oligomers towards intermediate size oligomers.
Figure 24) Distribution of oligomers in cells expressing TTR D18G alone or TTR D18G and BiP.
Input
TTR D18G
Molecular weightlow high
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4TTR-D18G BiP TTR-D18G
Frac
tion
Input
TTR D18G
Molecular weightlow high
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4TTR-D18G BiP TTR-D18G
Frac
tion
52
BiP can protect cells from TTR D18G cytotoxicity
In paper II, we worked with neuroblastoma cells to investigate the cells viability after
exposure to oligomeric species of TTR. We found that early oligomers were toxic to
the cells, which died in an apoptotic like manner. In paper IV, we wanted to study the
influence of BiP on toxic oligomeric TTR species and used the used the same
principles as in paper II but exposed the cells to TTR D18G instead of TTR wt
oligomers and mixed cold TTR D18G with cell medium and challenged NBC cells.
To compare with, we used the cold BiP:TTR D18G complex and cold TTR wt. Phase
contrast pictures of human NBC showed that cells exposed to TTR D18G were dead
after 48 hours, whereas cells exposed to TTR D18G in complex with BiP were more
viable. Analysis of DNA fragmentation inside the cells nuclei which is a hallmark of
apoptosis revealed that TTR D18G induced apoptosis which was not the case for TTR
D18G in complex with BiP. From this we concluded that BiP could protect the cells
from TTR D18G cytotoxicity.
Figure 25) BiP can rescue cells from dying in apoptosis. Phase contrast pictures of human NBC
exposed to cold TTR wt (wt), TTR D18G (D18G) or TTR D18G in complex with BiP (D18G + BiP)
showed that cells treated with TTR D18G were dead after 48 hours (decreased cell size, modified
morphology and sparse population) whereas TTR D18G in complex with BiP were more viable (more
dense and normal morphology).
53
BiP is found in TTR D18G aggregates in patient tissue
Tissue sections from the cerebellum of a TTR D18G patient was analyzed using an
amyloidotropic luminescent conjugated polymer (LCP) which emits light of a specific
signature when bound to amyloid fibrils [94]. BiP antibody was used to detect the
localization of BiP in the tissue sections and TTR antibodies were used to detect
where the TTR was localized. Triple staining using LCP, anti-BiP and anti-TTR
antibodies showed that BiP co-localized with the TTR containing amyloid in the brain
(Figure 26).
Figure 26) BiP co-localizes with TTR containing amyloid in the brain. Amyloid staining (LCP),
TTR, and BiP are all co-localized, however there are patters where the individual signals dominates,
indicating that the amyloid composition is layered within the deposits (indicated with arrows, right
panel).
TTR
BiPLCP
mergeTTR
BiPLCP
merge
54
55
Conclusions From the studies in this thesis, it could be concluded that:
Fluorescence spectroscopy used intelligently (various molecular probes and time
resolves techniques) is a very powerful tool to assay formation of amyloid and
prefibrillar oligomers.
Formation of TTR oligomers during acidic conditions from the A-state occurs very
fast (within minutes) after the process has been initiated. The formation of amyloid
like fibrils occurs via oligomeric intermediates.
Oligomeric, intermediate species in the TTR aggregation pathway are toxic to
neuroblastoma cells and cause apoptosis. Mature fibrils are less toxic. Cold stored
native, tetrameric TTR is also cytotoxic suggesting an additional pathway for a labile
tetramer or monomer to be toxic.
The ER chaperone BiP selectively captures the pathogenic, misfolding prone mutant
of TTR; TTR D18G.
The binding site for BiP in TTR is the part in TTR that is involved in formation of the
tetrameric structure and is possibly an elongation site in fibrils, comprising residues
88-103. Hence, BiP maintains TTR D18G in a soluble oligomeric form which should
be a protection mechanism against oligomer toxicity.
56
BiP co-aggregates with TTR D18G. The larger the TTR containing aggregates are, the
fewer BiP are in the complex. We ascribe this collection role for BiP as a molecular
shepherd.
The degradation process of TTR D18G is slowed down in the presence of BiP.
BiP can escape the ER in complexes with TTR D18G and accumulate as extracellular
amyloid in human brain.
57
References
1. Venter, J.C., et al., The sequence of the human genome. Science, 2001. 291(5507): p. 1304-51.
2. Watson, J.D. and F.H. Crick, Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid. Nature, 1953. 171(4356): p. 737-8.
3. Mizuno, T., M.Y. Chou, and M. Inouye, A unique mechanism regulating gene expression: translational inhibition by a complementary RNA transcript (micRNA). Proc Natl Acad Sci U S A, 1984. 81(7): p. 1966-70.
4. Rocheleau, C.E., et al., Wnt signaling and an APC-related gene specify endoderm in early C. elegans embryos. Cell, 1997. 90(4): p. 707-16.
5. Fire, A., et al., Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998. 391(6669): p. 806-11.
6. Anfinsen, C.B., Principles that govern the folding of protein chains. Science, 1973. 181(96): p. 223-30.
7. Jackson, S.E. and A.R. Fersht, Folding of chymotrypsin inhibitor 2. 1. Evidence for a two-state transition. Biochemistry, 1991. 30(43): p. 10428-35.
8. Dobson, C.M., Getting out of shape. Nature, 2002. 418(6899): p. 729-30. 9. Ferri, C.P., et al., Global prevalence of dementia: a Delphi consensus study.
Lancet, 2005. 366(9503): p. 2112-7. 10. Prusiner, S.B., Molecular biology and genetics of prion diseases. Philos Trans
R Soc Lond B Biol Sci, 1994. 343(1306): p. 447-63. 11. Prusiner, S.B., The prion diseases. Brain Pathol, 1998. 8(3): p. 499-513. 12. Estebe, J.P., [Anesthesia and non-conventional transmissible agents (or prion
diseases)]. Ann Fr Anesth Reanim, 1997. 16(8): p. 955-63. 13. Horwich, A.L. and J.S. Weissman, Deadly conformations--protein misfolding
in prion disease. Cell, 1997. 89(4): p. 499-510. 14. Buxbaum, J., The genetics of the amyloidoses: interactions with immunity and
inflammation. Genes Immun, 2006. 7(6): p. 439-49. 15. Ingbar, S.H., Pre-albumin: a thyroxinebinding protein of human plasma.
Endocrinology, 1958. 63(2): p. 256-9. 16. Kanai, M., A. Raz, and D.S. Goodman, Retinol-binding protein: the transport
protein for vitamin A in human plasma. J Clin Invest, 1968. 47(9): p. 2025-44. 17. Blake, C.C., et al., Structure of prealbumin: secondary, tertiary and
quaternary interactions determined by Fourier refinement at 1.8 A. J Mol Biol, 1978. 121(3): p. 339-56.
18. Nomenclature Committee of IUB (NC-IUB) IUB-IUPAC Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). Newsletter 1981. J Biol Chem, 1981. 256(1): p. 12-4.
19. Hamilton, J.A. and M.D. Benson, Transthyretin: a review from a structural perspective. Cell Mol Life Sci, 2001. 58(10): p. 1491-521.
20. Blake, C.C., et al., Strjcture of human plasma prealbumin at 2-5 A resolution. A preliminary report on the polypeptide chain conformation, quaternary structure and thyroxine binding. J Mol Biol, 1974. 88(1): p. 1-12.
21. Smith, J.W., et al., Thyroid hormones, brain function and cognition: a brief review. Neurosci Biobehav Rev, 2002. 26(1): p. 45-60.
22. Hagen, G.A. and W.J. Elliott, Transport of thyroid hormones in serum and cerebrospinal fluid. J Clin Endocrinol Metab, 1973. 37(3): p. 415-22.
58
23. Hou, X., M.I. Aguilar, and D.H. Small, Transthyretin and familial amyloidotic polyneuropathy. Recent progress in understanding the molecular mechanism of neurodegeneration. Febs J, 2007. 274(7): p. 1637-50.
24. Monaco, H.L., M. Rizzi, and A. Coda, Structure of a Complex of Two Plasma Proteins: Transthyretin and Retinol-Binding Protein Science, 1995. 268(5213): p. 1039-1041.
25. Benson, M.D. and J.C. Kincaid, The molecular biology and clinical features of amyloid neuropathy. Muscle Nerve, 2007. 36(4): p. 411-23.
26. Sousa, M.M., et al., Deposition of transthyretin in early stages of familial amyloidotic polyneuropathy: evidence for toxicity of nonfibrillar aggregates. Am J Pathol, 2001. 159(6): p. 1993-2000.
27. Sousa, M.M., et al., Evidence for early cytotoxic aggregates in transgenic mice for human transthyretin Leu55Pro. Am J Pathol, 2002. 161(5): p. 1935-48.
28. Costa, P.P., A.S. Figueira, and F.R. Bravo, Amyloid fibril protein related to prealbumin in familial amyloidotic polyneuropathy. Proc Natl Acad Sci U S A, 1978. 75(9): p. 4499-503.
29. Andrade, C., A peculiar form of peripheral neuropathy; familiar atypical generalized amyloidosis with special involvement of the peripheral nerves. Brain, 1952. 75(3): p. 408-27.
30. Saraiva, M.J., et al., Amyloid fibril protein in familial amyloidotic polyneuropathy, Portuguese type. Definition of molecular abnormality in transthyretin (prealbumin). J Clin Invest, 1984. 74(1): p. 104-19.
31. Joao Saraiva, M., et al., Familial amyloidotic polyneuropathy: protein aggregation in the peripheral nervous system. J Mol Neurosci, 2004. 23(1-2): p. 35-40.
32. Suhr, O.B., et al., Hereditary transthyretin amyloidosis from a Scandinavian perspective. J Intern Med, 2003. 254(3): p. 225-35.
33. Thomas, P.J., B.H. Qu, and P.L. Pedersen, Defective protein folding as a basis of human disease. Trends Biochem Sci, 1995. 20(11): p. 456-9.
34. Ii, S., et al., Two-tiered DNA-based diagnosis of transthyretin amyloidosis reveals two novel point mutations. Neurology, 1991. 41(6): p. 893-8.
35. Gertz, M.A., R.A. Kyle, and S.N. Thibodeau, Familial amyloidosis: a study of 52 North American-born patients examined during a 30-year period. Mayo Clin Proc, 1992. 67(5): p. 428-40.
36. Gustavsson, A., et al., Amyloid fibril composition and transthyretin gene structure in senile systemic amyloidosis. Lab Invest, 1995. 73(5): p. 703-8.
37. Cornwell, G.G., 3rd, et al., Frequency and distribution of senile cardiovascular amyloid. A clinicopathologic correlation. Am J Med, 1983. 75(4): p. 618-23.
38. Westermark, P., et al., Fibril in senile systemic amyloidosis is derived from normal transthyretin. Proc Natl Acad Sci U S A, 1990. 87(7): p. 2843-5.
39. Pitkanen, P., P. Westermark, and G.G. Cornwell, 3rd, Senile systemic amyloidosis. Am J Pathol, 1984. 117(3): p. 391-9.
40. Cornwell, G.G., 3rd, et al., Evidence that the amyloid fibril protein in senile systemic amyloidosis is derived from normal prealbumin. Biochem Biophys Res Commun, 1988. 154(2): p. 648-53.
41. Felding, P., et al., Prealbumin in Swedish patients with senile systemic amyloidosis and familial amyloidotic polyneuropathy. Scand J Immunol, 1985. 21(2): p. 133-40.
59
42. Reixach, N., et al., Tissue damage in the amyloidoses: Transthyretin monomers and nonnative oligomers are the major cytotoxic species in tissue culture. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(9): p. 2817-22.
43. Sekijima, Y., et al., The biological and chemical basis for tissue-selective amyloid disease. Cell, 2005. 121(1): p. 73-85.
44. Foss, T.R., R.L. Wiseman, and J.W. Kelly, The pathway by which the tetrameric protein transthyretin dissociates. Biochemistry, 2005. 44(47): p. 15525-33.
45. Andersson, K., et al., Only amyloidogenic intermediates of transthyretin induce apoptosis. Biochem Biophys Res Commun, 2002. 294(2): p. 309-14.
46. Kelly, J.W., Towards an understanding of amyloidogenesis. Nat Struct Biol, 2002. 9(5): p. 323-5.
47. Bucciantini, M., et al., Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature, 2002. 416(6880): p. 507-11.
48. Selkoe, D.J., Folding proteins in fatal ways. Nature, 2003. 426(6968): p. 900-4.
49. Buxbaum, J.N., et al., Transthyretin protects Alzheimer's mice from the behavioral and biochemical effects of Abeta toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(7): p. 2681-6.
50. Garzuly, F., et al., Familial meningocerebrovascular amyloidosis, Hungarian type, with mutant transthyretin (TTR Asp18Gly). Neurology, 1996. 47(6): p. 1562-7.
51. Vidal, R., et al., Meningocerebrovascular amyloidosis associated with a novel transthyretin mis-sense mutation at codon 18 (TTRD 18G). Am J Pathol, 1996. 148(2): p. 361-6.
52. Yamamoto, K., et al., Familial amyloid polyneuropathy in Taiwan: identification of transthyretin variant (Leu55-->Pro). Muscle Nerve, 1994. 17(6): p. 637-41.
53. Hammarstrom, P., et al., D18G transthyretin is monomeric, aggregation prone, and not detectable in plasma and cerebrospinal fluid: a prescription for central nervous system amyloidosis? Biochemistry, 2003. 42(22): p. 6656-63.
54. Sekijima, Y., et al., Energetic characteristics of the new transthyretin variant A25T may explain its atypical central nervous system pathology. Lab Invest, 2003. 83(3): p. 409-17.
55. Jenne, D.E., et al., A new isoleucine substitution of Val-20 in transthyretin tetramers selectively impairs dimer-dimer contacts and causes systemic amyloidosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93(13): p. 6302-7.
56. Jiang, X., et al., An engineered transthyretin monomer that is nonamyloidogenic, unless it is partially denatured. Biochemistry, 2001. 40(38): p. 11442-52.
57. Ranlov, I., et al., A Danish kindred with familial amyloid cardiomyopathy revisited: identification of a mutant transthyretin-methionine111 variant in serum from patients and carriers. Am J Med, 1992. 93(1): p. 3-8.
58. Laskey, R.A., et al., Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature, 1978. 275(5679): p. 416-20.
59. Ellis, R.J., Do molecular chaperones have to be proteins? Biochem Biophys Res Commun, 1997. 238(3): p. 687-92.
60
60. Tissieres, A., H.K. Mitchell, and U.M. Tracy, Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: Relation to chromosome puffs. J Mol Biol, 1974. 85(3): p. 389-98.
61. Lanneau, D., et al., Heat shock proteins: essential proteins for apoptosis regulation. J Cell Mol Med, 2008.
62. Munro, S. and H.R. Pelham, An Hsp70-like protein in the ER: identity with the 78 kd glucose-regulated protein and immunoglobulin heavy chain binding protein. Cell, 1986. 46(2): p. 291-300.
63. Chevalier, M., et al., Substrate binding induces depolymerization of the C-terminal peptide binding domain of murine GRP78/BiP. J Biol Chem, 1998. 273(41): p. 26827-35.
64. Gething, M.J., Role and regulation of the ER chaperone BiP. Semin Cell Dev Biol, 1999. 10(5): p. 465-72.
65. Blond-Elguindi, S., et al., Affinity panning of a library of peptides displayed on bacteriophages reveals the binding specificity of BiP. Cell, 1993. 75(4): p. 717-28.
66. Fourie, A.M., et al., HSP70 binding sites in the tumor suppressor protein p53. J Biol Chem, 1997. 272(31): p. 19471-9.
67. Fourie, A.M., J.F. Sambrook, and M.J. Gething, Common and divergent peptide binding specificities of hsp70 molecular chaperones. J Biol Chem, 1994. 269(48): p. 30470-8.
68. Knarr, G., et al., BiP binding sequences in antibodies. J Biol Chem, 1995. 270(46): p. 27589-94.
69. Knarr, G., et al., BiP-binding sequences in HIV gp160. Implications for the binding specificity of bip. J Biol Chem, 1999. 274(42): p. 29850-7.
70. Rudiger, S., et al., Substrate specificity of the DnaK chaperone determined by screening cellulose-bound peptide libraries. Embo J, 1997. 16(7): p. 1501-7.
71. Kyte, J. and R.F. Doolittle, A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol, 1982. 157(1): p. 105-32.
72. Weitzmann, A., et al., The heat shock protein 70 molecular chaperone network in the pancreatic endoplasmic reticulum - a quantitative approach. Febs J, 2007. 274(19): p. 5175-87.
73. Greene, M.K., K. Maskos, and S.J. Landry, Role of the J-domain in the cooperation of Hsp40 with Hsp70. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(11): p. 6108-13.
74. Crowley, K.S., et al., Secretory proteins move through the endoplasmic reticulum membrane via an aqueous, gated pore. Cell, 1994. 78(3): p. 461-71.
75. Hamman, B.D., L.M. Hendershot, and A.E. Johnson, BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation. Cell, 1998. 92(6): p. 747-58.
76. Sitia, R. and I. Braakman, Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature, 2003. 426(6968): p. 891-4.
77. Roth, J., et al., Protein quality control: the who's who, the where's and therapeutic escapes. Histochem Cell Biol, 2008. 129(2): p. 163-77.
78. Romisch, K., Endoplasmic reticulum-associated degradation. Annu Rev Cell Dev Biol, 2005. 21: p. 435-56.
79. Yoshida, H., ER stress and diseases. Febs J, 2007. 274(3): p. 630-58. 80. Bernales, S., F.R. Papa, and P. Walter, Intracellular signaling by the unfolded
protein response. Annu Rev Cell Dev Biol, 2006. 22: p. 487-508.
61
81. Harding, H.P., et al., Transcriptional and translational control in the Mammalian unfolded protein response. Annu Rev Cell Dev Biol, 2002. 18: p. 575-99.
82. Ron, D. and P. Walter, Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007. 8(7): p. 519-29.
83. van Anken, E. and I. Braakman, Endoplasmic reticulum stress and the making of a professional secretory cell. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2005. 40(5): p. 269-83.
84. Shen, J., et al., ER stress regulation of ATF6 localization by dissociation of BiP/GRP78 binding and unmasking of Golgi localization signals. Dev Cell, 2002. 3(1): p. 99-111.
85. Harding, H.P., Y. Zhang, and D. Ron, Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature, 1999. 397(6716): p. 271-4.
86. Kerr, J.F., A.H. Wyllie, and A.R. Currie, Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972. 26(4): p. 239-57.
87. Nylandsted, J., et al., Selective depletion of heat shock protein 70 (Hsp70) activates a tumor-specific death program that is independent of caspases and bypasses Bcl-2. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(14): p. 7871-6.
88. Yuan, J., et al., The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Cell, 1993. 75(4): p. 641-52.
89. Thornberry, N.A. and Y. Lazebnik, Caspases: enemies within. Science, 1998. 281(5381): p. 1312-6.
90. Kothakota, S., et al., Caspase-3-generated fragment of gelsolin: effector of morphological change in apoptosis. Science, 1997. 278(5336): p. 294-8.
91. Lai, Z., W. Colon, and J.W. Kelly, The acid-mediated denaturation pathway of transthyretin yields a conformational intermediate that can self-assemble into amyloid. Biochemistry, 1996. 35(20): p. 6470-82.
92. Naiki, H., et al., Fluorometric determination of amyloid fibrils in vitro using the fluorescent dye, thioflavin T1. Anal Biochem, 1989. 177(2): p. 244-9.
93. Olofsson, A., et al., Probing solvent accessibility of transthyretin amyloid by solution NMR spectroscopy. J Biol Chem, 2004. 279(7): p. 5699-707.
94. Nilsson, K.P., et al., Conjugated polyelectrolytes--conformation-sensitive optical probes for staining and characterization of amyloid deposits. Chembiochem, 2006. 7(7): p. 1096-104.