C.I. MEDICINA DI LABORATORIO MICROBIOLOGIA CLINICA CdS MEDICINA E CHIRURGIA AA 2018-2019 Modulo 5: Meningite: diagnosi microbiologica Giovanni Di Bonaventura, PhD Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara Nuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello (tel. 0871 3554812) Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.), V livello (tel. 0871 541519) E-mail: [email protected]
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C.I. MEDICINA DI LABORATORIO
MICROBIOLOGIA CLINICACdS MEDICINA E CHIRURGIA AA 2018-2019
Modulo 5:
Meningite: diagnosi microbiologica
Giovanni Di Bonaventura, PhD
Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara
Nuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello (tel. 0871 3554812)
Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.), V livello (tel. 0871 541519)
▪ trasparente e privo di colorazione (rachicentesi traumatica)
LCR eritrocromico
LCR xantocromico
Fase analitica2. esame microscopico del LCR
CONTEGGIO CELLULARE, sul campione non centrifugato, preferibilmente sull’ultimo
prelevato, utilizzando una camera di conteggio e previa colorazione con blu di metilene o
May-Grunwald-Giemsa.
I conteggi non devono essere eseguiti su campioni con coagulo:
▪ conta totale dei leucociti
▪ conta differenziale dei leucociti: polimorfonucleati (PMN) vs mononucleati (LINF),
eseguita su conteggio totale > di 5x106 leucociti/litro.
▪ conta eritrociti eseguita su due campioni, in caso di sospetta emorragia
▪ Una pleiocitosi polinucleata indica una eziologia batterica, mentre una pleiocitosi
mononucleata (linfocitosi) indica una eziologia virale.
Fase analitica2. esame microscopico del LCR
LCR, pleiocitosi neutrofila
LCR, pleiocitosi mista neutrofila/linfocitaria
LCR, pleiocitosi linfocitaria
Fase analitica2. esame microscopico del LCR
CONTEGGIO CELLULARE
Una pleiocitosi polinucleata indica una eziologia batterica, mentre una pleiocitosi
mononucleata (linfocitosi) indica una eziologia virale.
Tuttavia, bisogna ricordare che:
▪ sia la meningite virale che tubercolare presentano, nelle fasi precoci dell’infezione,
una predominanza liquorale neutrofila
▪ una meningite batterica può inizialmente presentarsi «normale» quando il campione
viene prelevato in una fase precoce dell’infezione, in corso di terapia antibiotica
oppure da paziente immunodeficiente o neutropenico
▪ la meningite ad eziologia fungina, tubercolare o brucellare è linfocitica
▪ i pazienti neutropenici non sono generalmente in grado di produrre una risposta di
tipo neutrofila nel LCR (anergici)
▪ in pazienti con shock settico e complicanze sistemiche si hanno basse conte cellulari
Fase analitica2. esame microscopico del LCR
RICERCA MICROSCOPICA DIRETTA DI MICRORGANISMI eseguita sul pellet, ottenuto
a seguito di centrifugazione, colorato mediante:
▪ Gram:
▪ specificità: elevata (97-98.5%) per N. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae.
Morfologia patognomonica: diplococchi Gram- (N. meningitidis), diplococchi Gram+ (S.
pneumoniae), coccobacilli Gram- (H. influenzae).
▪ sensibilità: 60-80%, ma ridotta in presenza di terapia antibiotica (40-60%) e nel caso di
L. monocytogenes (23-36%) per scarsa carica batterica.1
▪ può essere l’unica evidenza laboratoristica per meningite: 4% di 875 pazienti in
uno studio danese.2
▪ importante in caso di meningite meningococcica (eseguita su materiale da
scarificazione petecchie/vescicole).
▪ Ziehl-Nielsen e auramina-rodamina (micobatteri)
▪ blu di metilene (morfologia cellulare)
▪ inchiostro di china o nigrosina (capsula di C. neoformans)
▪ arancio di acridina (batteri e miceti):
▪ fluorocromo che si intercala nella struttura dell’acido nucleico
▪ alta sensibilità ma non differenzia Gram+ vs Gram-
1. Bohr, V., et al. 1983. 875 cases of bacterial meningitis: diagnostic procedures and the impact of preadmission antibiotic therapy. Part III of a three-part series. J. Infect. 7:193–202.2. Brouwer, M.C., et al. 2006. Community-acquired Listeria monocytogenes meningitis in adults. Clin. Infect. Dis. 43:1233–1238.
Fase analitica2. esame microscopico del LCR
LCR, colorazione Gram. A) Streptococcus pneumoniae; B) Neisseria
meningitidis; C) Haemophilus influenzae; D) Escherichia coli.
A B
C D
Fase analitica2. esame microscopico del LCR
LCR. A) Colorazione inchiostro India: capsula di Cryptococcus neoformans; B) Colorazione
auramina-rodamina: Mycobacterium tuberculosis; C) Colorazione arancio di acridina:
Staphylococcus aureus; D) Colorazione blue di metilene: Neisseria meningitidis.
A B
C D
Fase analitica3. esame chimico-fisico del LCR
ESAME CHIMICO-FISICO effettuato previa centrifugazione e rimozione del surnatante,
poiché le cellule - lisandosi con il tempo – liberano il loro contenuto proteico in sospensione:
* anche su sangue, tampone faringeo, biopsia cutanea
Fase analitica: eziologia batterico-fungina1. ricerca di antigeni
▪ I microrganismi che comunemente causano meningite presentano sulla loro superficie
antigeni di natura polisaccaridica che possono essere rilevati in LCR mediante test
di agglutinazione al lattice (latex test):
– Streptococcus pneumoniae
– Haemophilus Influenzae di tipo b
– Neisseria meningitidis (gruppi A, B, C, Y/W135)
– Esherichia coli (gruppo K1)
– Streptococcus agalactiae (streptococco beta-emolitico di gruppo B)
– Cryptococcus neoformans
▪ Costosi e di controversa affidabilità (sensibilità: 59-100%; fortemente compromessa
da terapia antibiotica1), tali tests sono utilizzati SOLO in caso di: 1) conteggio
cellulare anomalo (immunodeficienza con deficit GB); 2) LCR purulento ma negativo al
Gram; 3) LCR ed emocolture negativi per oltre 48 ore (pregressa antibiotico-terapia).
▪ Per queste limitazioni, sebbene una positività al lattice possa indicare la presenza di
un agente infettivo, la negatività non può escludere una infezione.
▪ Al contrario, la ricerca dell’antigene solubile di C. neoformans (LCR), S. pneumoniae
(LCR od urine) mediante immunocromatografia è associata ad elevata sensibilità.
1. Brouwer MC, et al. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clin Microbiol Rev 2010;23:467–92.
Fase analitica: eziologia batterico-fungina1. ricerca di antigeni: latex assay
Fase analitica: eziologia batterico-fungina1. ricerca di antigeni: immunocromatografia
▪ sensibilità 95-100%1
▪ possibili false-positività per altri streptococchi2
1. Saha SK, et al. Rapid diagnosis of pneumococcal meningitis: implications for treatment and measuring disease burden. Pediatr Infect Dis J 2005;24:1093–8.2. Alonso-Tarres C, et al. False-positive pneumococcal antigen test in meningitis diagnosis. Lancet 2001;358:1273–4.
Durante la migrazione del campione gli antigeni
ricercati, se presenti nel campione, formeranno
complessi antigene-anticorpo con gli anticorpi marcati
con oro colloidale. Questi complessi verranno catturati
dagli anticorpi di cattura sulla linea del test, formando
una banda di colore viola generata dalle nanoparticelle
d'oro. La presenza di una banda di controllo interno
viola nella parte superiore della membrana indica che il
risultato è valido e che la procedura seguita è corretta.
Fase analitica: eziologia batterico-fungina2. isolamento colturale
▪ Rappresenta il gold standard per la diagnosi di meningite batterica.
▪ Si effettua sul centrifugato di LCR (concentrare la carica batterica) per la ricerca di:
– aerobi: N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae, stafilococchi (agar sangue,
agar cioccolato)
– anaerobi (in caso di meningiti post-neurochirurgiche o shunt cerebrali-related)
– altri patogeni: miceti (C. neoformans), M. tuberculosis (solo terreni liquidi)
▪ Sensibilità: 67-85% 3,4 ;
▪ non ottimale per M. tuberculosis (25%–70%) che comunque richiede maggiori
volumi di LCR (≥5 mL)
▪ riduzione della sensibilità (del 10-20%) 3,5,6 se il paziente è già in terapia
antibiotica al momento della rachicentesi
All’isolamento del microrganismo seguirà la valutazione della sua
sensibilità agli antibiotici (antibiogramma) per eventualmente
modificare la terapia (empirica) avviata in prima battuta.
3. Bohr V, et al. 1983. 875 cases of bacterial meningitis: diagnostic procedures and the impact of preadmission antibiotic therapy. Part III of a three-part series. J. Infect. 7:193–202.
4. Bryan JP, et al. 1990. Etiology and mortality of bacterial meningitis in northeastern Brazil. Rev. Infect. Dis. 12:128–135.
5. Nigrovic LE, et al. 2008. Effect of antibiotic pretreatment on cerebrospinal fluid profiles of children with bacterial meningitis. Pediatrics 122:726–730.
6. Ragunathan L, et al. 2000. Clinical features, laboratory findings and management of meningococcal meningitis in England and Wales: report of a 1997 survey. J. Infect. 40:74–79.
N. meningitidis su agar cioccolato
Fase analitica: eziologia batterico-fungina3. emocoltura
Nella maggior parte dei casi i microrganismi dopo aver attraversato la barriera mucosale si
immettono nel circolo ematico per poi penetrare la barriera emato-encefalica e
raggiungere il SNC.
Per questo, è necessario eseguire una emocoltura (su 3 sets) in parallelo alle indagini
condotte su LCR.
L’esito dell’indagine emocolturale ci consentirà di confermare la eziologia derivante
dall’indagine liquorale.
Nei casi di emocoltura negativa è raccomandata l’esecuzione di un tampone faringeo.
Qualora non fosse possible prelevare il LCR (pericolo di incuneamento cerebrale), l’indagine
emocolturale rappresenta l’unicà opportunità di poter isolare il microrganismo
causa dell’infezione.
Fase analitica: eziologia batterico-funginaricerca molecolare (amplificazione genica)
Polymerase Chain Reaction (PCR)
▪ Su LCR, ma anche su sangue, tampone faringeo,
biopsia cutanea per la ricerca diretta di batteri (N.
meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae, L.
monocytogenes, M. tuberculosis) e virus
▪ Rappresenta l’approccio diagnostico principale in caso
di eziologia virale
▪ Particolarmente utile quando l’esame colturale risulta
negativo (LCR torbido ma in corso di antibiotico-
terapia).
▪ Valore diagnostico incrementale vs Gram e colturale1,2
▪ False positività: pneumococchi commensali e non
patogeni
PCR assay. Amplificazione gene per
proteina b (419bp) di M. tuberculosis
su gel agarosio 1.5%.
Lane 1: 100bp DNA marker
Lane 2: CTRL +
Lanes 3,4,5: CSF positivi
Lane 5: CTRL -
(Sharma et al, Neurol India 2010)
1. Corless CE, et al. Simultaneous detection of N.meningitidis, H.influenzae, and S.pneumoniae in suspected cases of meningitis and septicemia using real-time PCR. J Clin Microbiol
2001;39:1553–8.
2. Tzanakaki G, et al. Simultaneous single-tube PCR assay for the detection of N. meningitidis, H. influenzae type b and S. pneumoniae. Clin Microbiol Infect 2005;11:386–90.
Brouwer et al, Clin Microbiol Rev 2010
Test Tempo Costo (euro)
Glucosio <1 h 4
Proteine <1 h 2
Conta GB <1 h 27
Gram 2 h 8
Coltura 5 gg 20
Latex test <1 h 130
Fase analitica: eziologia batterico-fungina
Sensibilità, costi e tempi di esecuzione
▪ Nei pazienti con controindicazione alla puntura lombare, la diagnosi microbiologica
viene condotta su altri campioni:
Urine: ricerca di antigeni batterici.
Markers infiammatori sierici:
▪ indicano la eziologia dell’infezione (batterica vs virale):1
▪ PCT (>0.5–2 ng/mL) e proteina C-reattiva sono suggestive, ma non
esclusive, per una eziologia batterica2
Biopsia cutanea (meningite meningococcica):
▪ campione prelevato mediante biopsia, scraping od aspirazione
▪ colorazione Gram: sensibilità 0.5%-36%3,4
▪ isolamento colturale
La accuratezza dell’esame delle lesioni cutanee non è influenzata
da una terapia antibiotica eventualmente in atto.5
Diagnosi di meningite... in assenza di LCR
1. De Cauwer, H. G., et al. 2007. Differential diagnosis between viral and bacterial meningitis in children. Eur. J. Emerg. Med. 14:343–347.
2. Dubos, F., et al. 2008. Serum procalcitonin level and other biological markers to distinguish between bacterial and aseptic meningitis in children: a European multicenter case cohort study.
Arch. Pediatr. Adolesc. Med. 162:1157–1163.
3. Levy, C., et al. 2008. Characteristics of meningococcal meningitis in children in France. Arch. Pediatr. 15(Suppl. 3):S105–S110.
4. Arend, S. M., et al. 2006. Prospective controlled study of the diagnostic value of skin biopsy in patients with presumed meningococcal disease. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 25:643–649.
5. van Deuren, M., et al. 1993. Rapid diagnosis of acute meningococcal infections by needle aspiration or biopsy of skin lesions. BMJ 306:1229–1232.
Meningite meningococcica:
rash petecchiale.
Meningiti fungine
▪ Rare e di difficile diagnosi
▪ Cryptococcus neoformans (causa più frequente), Coccidioides immitis (Messico,
America meridionale)
▪ Maggiore prevalenza nell’ospite neutropenico (AIDS; immunosoppresso) a seguito
di disseminazione ematica
▪ Quadro liquorale: pleiocitosi linfocitaria, aumento quoziente albumina
▪ Identificazione mediante colorazione della capsula (India ink): solo per C.
neoformans
▪ Isolamento colturale
▪ E’ raccomandabile l’utilizzo di volumi maggiori di liquor (almeno 4 ml) per
l’allestimento del vetrino e per la coltura
▪ Ricerca di antigeni + ricerca anticorpale nel LCR per monitorare l’efficacia della
terapia:
▪ aumentati livelli di Abs specifici + ridotta presenza di antigeni = terapia efficace
▪ Ricerca di materiale genico: PCR, non ancora standardizzata
C. neoformans su agar sangue: colonie di
piccole dimensioni con aspetto mucoide
dovuto alla produzione di una abbondante
capsula polisaccaridica
Round
capsulated
fungal organisms
Lymphocytic
infiltrate around
LCR, inchiostro di china: C. neoformans
con evidente capsula
Meningitediagnosi di laboratorio
fase PRE-ANALITICA
• RACCOLTA e TRASPORTO LCR ed altri campioni
fase ANALITICA (LCR)
1. Valutazione MACROSCOPICA
2. Valutazione MICROSCOPICA
3. Indagini CHIMICO-FISICHE
fase ANALITICA
1. Amplificazione genica*
fase ANALITICA
1. Ricerca antigeni
2. Isolamento colturale + antibiogramma
3. Emocoltura
4. Amplificazione genica*
* anche su sangue, tampone faringeo, biopsia cutanea
Meningite viraleFase analitica
Nelle meningoencefaliti virali la fase analitica prevede l’esecuzione di tests molecolari su
LCR ed eventualmente test molecolari o sierologici su sangue e altre indagini su altre
tipologie di campione per escludere false positività/negatività.
Gli agenti eziologici da ricercare sono in relazione allo stato immunitario del paziente, alla
clinica e alla stagionalità.
Paziente immunocompetente. Ricerca del genoma di: Enterovirus (i più frequenti),
HSV1/2, VZV e HHV-6 (se paziente < 3aa).
▪ In caso di sospetto per Enterovirus può essere utile la ricerca nel tampone faringeo e
nelle feci. Possibili false-positività (non sempre presente un nesso causale con
meningite; nei bambini la positività fecale può essere dovuta a ceppi vaccinici).
▪ In corso di encefalite da HSV (1-2), nei primi 1-3 giorni dalla comparsa dei sintomi
neurologici si possono ottenere nel LCR risultati falsi negativi. Quindi, in caso di LCR
negativo è indicato ripetere la rachicentesi dopo 3-7 giorni.
▪ In presenza di vescicole cutanee o mucose effettuare ricerche colturali o molecolari per
HSV e VZV su tampone cutaneo/mucoso. Un risultato positivo non è sempre eziologico.
Meningite viraleFase analitica
Paziente immunocompetente.
▪ La sieroconversione da HIV è accompagnata nel 17% dei casi da sintomi neurologici.
E’, quindi, consigliabile effettuare su sangue il test combinato.
▪ La diagnosi di encefalite acuta da EBV può essere supportata dalle indagini
sierologiche su sangue (EBV VCA IgM positive e EBV EBNA negative).
▪ In presenza di epidemia o clinica suggestiva per parotite, morbillo e rosolia effettuare
su sangue le ricerche anticorpali alle quali aggiungere, solo in casi particolari, le
ricerche di biologia molecolare su LCR.
Paziente immunocompromesso.
▪ In aggiunta alle indagini descritte per gli immunocompetenti, effettuare la ricerca nel
LCR del genoma di CMV, EBV, JC virus e, anche se il paziente è adulto, HHV-6.
▪ Una eventuale positività di EBV su liquor non denota necessariamente una infezione del
SNC poiché potrebbe essere in relazione alla presenza nel LCR di cellule mononucleate
che ospitano il virus latente. In corso di encefalite acuta da EBV o di linfoma primitivo
del SNC il carico virale nel LCR è elevato.
Meningite viraleRhabdovirus: diagnosi di laboratorio
• Campioni clinici: strisci corneali, biopsie
cerebrali, biopsie cutanee
• Ricerca di antigeni virali in IF o tramite PCR
• Rilievo microscopico di cellule neuronali
cerebrali contenenti i corpi del Negri (inclusioni
intracitoplasmatiche)
Cervello rabbico: colorazione IF (in alto);
campione negativo (in basso)Cervello rabbico, colorazione
ematossilina-eosina: indicati, i corpi del
Negri (Rhabdovirus)
Meningite da protozoi
• Le amebe (Naegleria, Acantameba) possono moltiplicarsi in acque
stagnanti nei Paesi tropicali (scarichi fognari).
• Se inalate, raggiungono le meningi attraverso il nervo olfattivo e la lamina
cribrosa etmoidea.
• Diagnosi: osservazione microscopica per evidenziare la caratteristica
motilità ameboide.
Meningite amebica: sedimento liquorale
con trofozoiti di Naegleria fowleri
▪ ASPETTO: aspetto del LCR (limpido, purulento) ed eventuale presenza di coaguli
▪ MICROSCOPIA:
▪ Conteggio cellulare
• numero di GR (x106 per litro)
• numero di PMN e linfociti (x 106/L; oppure % conta totale GB, riferito a x 106)