Module BioAnalyse Les Protéines Cécile ALBENNE [email protected]Maître de conférences en biochimie Equipe Protéines pariétales et développement (E. Jamet) Objectifs de la journée Objectifs et plan du cours Rappel des fondamentaux sur les protéines Présentation des méthodes d’étude structurale des protéines • Relations structure/fonction • Analyse protéomique Mise en application directe sous forme de TD Organisation de la journée Matinée : Relations structure / fonction 1h30 de Cours : Principes et méthodes 2h de TD : Analyse de données structurales à l’aide de logiciels adaptés Après-midi : Analyse protéomique 1h30 de Cours : Stratégies et outils 2h de TD : Analyse de données de masse à l’aide de logiciels adaptés 1 ère partie Les protéines : relations structure / fonction Plan du cours Plan I- La structure des protéines II- Bio-cristallographie et RMN III- Ingénierie enzymatique : mutagénèse dirigée et aléatoire exemple : l’amylosaccharase de Neisseria polysaccharea TD : manipulation de DS Visualizer (Accelrys)
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Module BioAnalyse Les Protéines ¾ - genotoul-bioinfosnp.toulouse.inra.fr/~gaulin/doc/0809_albenne_CM1.pdf · III- Ingénierie enzymatique : mutagénèse dirigée et aléatoire Ö
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Alignement de structures primaires : logiciels adaptés
I- Structure des protéines
Fasta Basic local alignmenthttp://www.dkfz-heidelberg.de/tbi/bioinfo/DBSearchI/FASTA/index.html
BLAST Basic Local Alignment Search toolhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
BEAUTY:BLAST Alignement Blast amélioré informant sur les domaines/familles/régions conservéeshttp://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/protein-search.html
CLUSTALW Alignement de plusieurs séquenceshttp://www.ebi.ac.uk/clustalw/
si la protéine présente très peu d’homologie avec les protéines accessibles par les banques de données
pas d’informations structurales ou fonctionnelles
une ressemblance de structure ne signifie pas une ressemblance de séquenceEx: famille Glucoside Hydrolase : même organisation structurale peut être obtenue à partir de séquences très différentes entre elles (homologie<20%)
une même fonction ne correspond pas toujours à une forte homologie de séquence (cas des β-glucosidases)
1ères structures “hémoglobine” (M. Perutz) et « myoglobine » (J. C. Kendrew ) (1958)
Technique la plus utilisée
Quantités nécessaires : dizaine(s) de mg de protéine pure en solution
Nombreux programmes de génomique structurale lancés en Europe et dans le monde
Objectif: acquérir le plus rapidement possible la structure de nouvelles protéines
Stratégie: à partir du séquençage de différents génomes, clonage du plus grand nombre possible de gènes/ expression/ purification/ cristallisation/ Diffraction des rayons X/ Structure 3D
II- Cristallographie
Démarche
A partir d’une préparation de protéine purifiée :
1- Conditionnement de l’échantillon
2- Cristallisation
3- Caractérisation des cristaux
4- Enregistrement des données de diffraction
5- Phasage
6- Construction d’un modèle initial
7- Affinement
8- Analyse de la structure 3D appel à la biologie moléculaire et la biochimie
II- Cristallographie
Cristallisation
Cristal = organisation des molécules en un réseau ordonné
Méthode: mise en présence de la solution protéique avec une solution contenant un agent précipitant (Sels, PEG, composés organiques volatils,....)
diffusion de vapeursévolution vers un équilibre
thermodynamique via une phase de sur-saturation
nucléation puis croissance des cristaux par réduction du niveau de sur-saturation pour favoriser la croissance de plus gros cristaux et obtenir une structure la plus ordonnée possible.
II- Cristallographie
Cristallographie et diffraction des rayons X : cristaux
Propriétés des cristaux :
arrangements réguliers des molécules, atomes et ions
formes et couleurs variables
généralement anisotropes (propriétés physiques variables selon la direction considérée)
arrangement visualisable par microscopie électronique mais résolution insuffisante pour déterminer la structure à l’échelle atomique
diffraction des rayons X
II- Cristallographie
Obtention des clichés de diffraction
Rayonnement synchrotron :résultant du «freinage» d’électrons de très haute énergie circulant dans un anneau de plusieurs dizaines de mètres de diamètresources extrêmement brillantes et très bien résolues en longueur d’onde par divers systèmes de filtres et de monochromateurs.
Cliché de diffraction
Résolution d’autant plus que les tâches de diffraction sont éloignées du centre
II- Cristallographie
Analyse des clichés de diffraction
Caractéristiques des faisceaux diffractés
- amplitudes et phases déterminées par la position des atomes dans la maille