Module BioAnalyse Les Protéines Cécile ALBENNE [email protected]Maître de conférences en biochimie Equipe Protéines pariétales et développement (E. Jamet) Objectifs de la journée Objectifs et plan du cours ¾ Rappel des fondamentaux sur les protéines ¾ Présentation des méthodes d’étude structurale des protéines • Relations structure/fonction • Analyse protéomique ¾ Mise en application directe sous forme de TD Organisation de la journée Matinée : Relations structure / fonction 1h30 de Cours : Principes et méthodes 2h de TD : Analyse de données structurales à l’aide de logiciels adaptés Après-midi : Analyse protéomique 1h30 de Cours : Stratégies et outils 2h de TD : Analyse de données de masse à l’aide de logiciels adaptés 2 ème partie Analyse protéomique I- Définitions et généralités II- Séparation des protéines et des peptides III III - - Identification et Identification et caractérisation caractérisation des Protéines par Spectrométrie de des Protéines par Spectrométrie de Masse (MS et Masse (MS et MS/MS) MS/MS) IV- Etude des modifications post-traductionnelles Plan du cours Plan
13
Embed
Module BioAnalyse Les Protéines ¾ - genotoul-bioinfo
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Equipe Protéines pariétales et développement (E. Jamet)
Objectifs de la journée
Objectifs et plan du cours
Rappel des fondamentaux sur les protéines
Présentation des méthodes d’étude structurale des protéines
• Relations structure/fonction
• Analyse protéomique
Mise en application directe sous forme de TD
Organisation de la journéeMatinée : Relations structure / fonction
1h30 de Cours : Principes et méthodes2h de TD : Analyse de données structurales à l’aide de logiciels adaptés
Après-midi : Analyse protéomique1h30 de Cours : Stratégies et outils2h de TD : Analyse de données de masse à l’aide de logiciels adaptés
2ème partie
Analyse protéomiqueI- Définitions et généralités
II- Séparation des protéines et des peptides
IIIIII-- Identification et Identification et caractérisationcaractérisation des Protéines par Spectrométrie de des Protéines par Spectrométrie de
Masse (MS et Masse (MS et MS/MS)MS/MS)
IV- Etude des modifications post-traductionnelles
Plan du cours
Plan
I- Définitions et généralités
Protéome
• Protéines exprimées par le génome
• Post-génome
ProtéomeProtéome :: Le protéome représente l’ensemble des protéines présentes dans une cellule donnée à un temps donné ; la protéomique en est son étude (Marc Wilkins, 1994).
-- dynamique, spécifique du type et de l’état des cellulesdynamique, spécifique du type et de l’état des cellules
-- son étude permet de préciser la fonction des protéines (liée à son étude permet de préciser la fonction des protéines (liée à leurs propriétés leurs propriétés structurales telles que les modifications poststructurales telles que les modifications post--traductionnelles ou d’identifier des protéines clés traductionnelles ou d’identifier des protéines clés impliquées dans un processus biologiqueimpliquées dans un processus biologique
Le concept un gène-une protéine n'est plus d'actualité
L’étude du génome ne suffit pas à comprendre le comportement cellulaireLe protéome sert de lien entre la séquence du génome et le comportement cellulaire
I- Définitions et généralités
La complexité du protéome
Même génome…
Différents protéomes !!!
I- Définitions et généralités
La complexité du protéome
• Préparation de l’échantillon (extraction, concentration, …)
• Séparation des protéines ou des peptides => simplification de l’échantillon
pour l’analyse par SM
• Spectrométrie de masse pour l’identification, la caractérisation et/ou la
quantification des protéines
I- Définitions et généralités
Les étapes en protéomique
A l’heure actuelle, deux méthodes sont utilisées pour séparer les protéines ou peptides en amont d’une analyse protéomique :
1- L’électrophorèse (mono- ou bi-dimensionnelle
2- La chromatographie liquide mono- ou multi-dimensionnelle
II- Séparation des protéines ou peptides
Méthodes
pI
PM
Carte à 2 dimensions dans laquelle chaque protéine est séparée selon son point isoélectrique et sa taille moléculaire apparente.
Protéines pouvant être analysées par gel 2D
4.0 10.0
10
100
II- Séparation des protéines ou peptides
Séparation des protéines par électrophorèse 2D
D’après Wildburger et al.Electrophoresis 2000, 21, 2610-16
La grande majorité des protéines peuvent être analysées par gel 2DMais pb des protéines de pI extrêmes (surtout les protéines basiques de pI > 10), hydrophobes
(peu solubles – protéines membranaires) et de hauts PMDéveloppement de stratégies de séparation par association avec la chromatographie liquide
(mono ou multi dimensionnelle)
Protéines pouvant être analysées par
gel 2D
II- Séparation des protéines ou peptides
Séparation des protéines par électrophorèse 2D
a- Electrophorèse 2D
b- Chromatographie Liquide mono ou bi-dimensionnelle
• des protéines
• des peptides après hydrolyse enzymatique d’un mélangecomplexe de protéines
II- Séparation des protéines ou peptides
Méthodes
• Pour les séparer, on va combiner plusieurs séparations sur la base de propriétés physico-chimiques différentes (multiD-LC, 2D-LC) :
Mélange de protéines Prot purifiée Peptides analyse MS et MSMS2D LC hydrolyseStratégie :
Identification / caractérisation
II- Séparation des protéines ou peptides
Séparation des protéines par chromatographie liquide 2D
II- Séparation des protéines ou peptides
Séparation des protéines par chromatographie liquide 2D
☺Les fractions éluées de la 1ère colonne sont automatiquement injectées dans la 2ème colonne puis les fractions issues de la 2ème colonne peuvent être déposées sur cible MALDI pour des analyses MS
évite la manipulation manuelle d’échantillons (pertes, contaminations…).
☺ Un détecteur (UV par ex.) permet d’avoir une idée de la quantité de protéines éluées dans chaque fraction à l’issue de la 1ère colonne puis de la 2ème
Obtention de carte bi-dimensionnelle
Protéine (ou mélange de protéines) dénaturé(es)
Digestion enzymatique (trypsine)
Peptides (qques centaines à plusieurs milliers)
Séparation chromatographique des peptides 1D (RPC) ou 2D (1- Echange d’ions 2- Phase inverse)
MS et MS/MS (Fragmentation des peptides) => listes de masses d’ions parents et fragments
Comparaison des listes de masses expérimentales avec les listes de masses générées par la digestion théorique des protéines contenues dans les bases de données (protéiques ou génomiques)
Technique très utilisée en
protéomique
II- Séparation des protéines ou peptides
Séparation des peptides par chromatographie liquide 2D
~ 20.000 protéines
II- Séparation des protéines ou peptides
Séparation des peptides par chromatographie liquide 2D : le proteome de levure
1. Les spectromètres de masse
2. Les cartographies massiques peptidiques en MS
3. L’interrogation des banques de données
4. Les fragmentations peptidiques en MS/MS
III- Identification et caractérisation des protéines
Source Analyseur DétecteurIntroduction
DirecteGC/MS
HPLC/MSCE/MS
BIA/MS
EICI
FABElectrospray (ESI)
Maldi
QuadripôleTrappe ionique
TOF (Time Of Flight)FT ICR
++
+ ++
En biologie, deux techniques d’ionisation douce sont généralement utilisées pour préserver l’intégrité des biomolécules :
- l’électrospray (ESI)- la désorption laser assistée par matrice (MALDI)
*
IonisationMise en phase gazeuse
Séparation des ions en fonction de m/z
III- Identification et caractérisation des protéines
1- Les spectromètres de masse
*III- Identification et caractérisation des protéines
1- Les spectromètres de masse : sources d’ionisation
• Présence d’une matrice • Echantillon solide (co-crystal avec la matrice) • Ions monochargés MH+
Effets de suppression☺ Dépôt automatisable
• Echantillon phase liquide• Ions multichargés M + nH+
Solubilité - Faible tolérance aux sels
☺ Couplage HPLC => analyse de mélanges complexes
☺ Fragmentation MS/MS
laser
ionsions
Approches complémentaires
Association avec un TOF :Cartographies massiques peptidiques
Identification de protéinesSensibilité : quelques fmol
Couplage HPLC ESI MSMS :Informations de séquences peptidiques
Caractérisation de MPTsSensibilité : quelques fmol….
MALDI ESI
*III- Identification et caractérisation des protéines
1- Les spectromètres de masse : sources d’ionisation
Un Nobel 2002 pour la Spectrométrie de Masseet la protéomique
John Fenn Koichi Tanaka
Electrospray Maldi
Analyseurs Résolution Gamme m/z
Quadripôle 3.000 < 4.000
Trappe ionique 5.000 < 6.000
Temps de vol (TOF) 20.000 < 500.000
Cyclotron à résonance 1.000.000 < 4.000des ions (FT-ICR)
Les analyseurs*III- Identification et caractérisation des protéines
1- Les spectromètres de masse les analyseurs
Résolution = m
Δm
III- Identification et caractérisation des protéines
2- Cartographie massique peptidique : stratégie
1 - Séparation de protéines sur gel d'électrophorèse 2D (ou 1D)
2 - Excision d'un spot protéique, décoloration
3 - Digestion enzymatique dans le gel (trypsine)
5 - Cartographie massique peptidique par MALDI TOF et interrogation des banques de données
4 - Extraction des peptides
6 - Nano électrospray MS/MS et interrogation des banques de données
microséquençage
Identification ?
Non
Oui
III- Identification et caractérisation des protéines
2- Cartographie massique peptidique : exemple (sous-unité du protéasome humain)
Stabilité protéique, crosslink intra et inter moléculairePont Disulfure -2 ++
+++
+++
+/++
Nitratration des Tyrosines +45 +/++ Oxydation / processus inflammatoire et dégénératifs
ConclusionIV- Etude des modifications post-traductionnelles
Schulenger B. et al JBC 2003; 278; 29; 27251-27255
Protéines mitochondrialesDétection Pro-Q-Diamond
Protéines mitochondrialesDétection SYPRO Ruby
Détection spécifique de MPT : ex. de phosphoprotéines
Phosphoprotéines
Protéines totales
ConclusionIV- Etude des modifications post-traductionnelles
Analyse des MPT par SM
Les modifications post-traductionnelles induisent un changement de masse qui peut-être mesuré par SM
La SM permet de :- détecter des peptides ou protéines modifiées- identifier la nature de la modification- localiser la modification sur l’axe polypeptidique
Différence de masse parfois insuffisante comme preuve (ex: 80 Da, phosphorylation ou sulfatation), besoin de vérifier par d’autres approches biochimiques (immuno-, enzymo-).
La spectrométrie de masse : un outil de choix pour l’analyse des MPTs
ConclusionIV- Etude des modifications post-traductionnelles
Analyse des MPT par SM
Nécessité de disposer de quantités importantes : beaucoup plus que pour une simple identification !
Nécessité de maximiser la couverture de séquence : difficile
Séparation préalable des protéines et surtout de leurs isoformes (pI, PM)
La spectrométrie de masse : un outil de choix pour l’analyse des MPTs
ConclusionIV- Etude des modifications post-traductionnelles
Analyse des MPT par SM : problèmes et solutionsLes peptides modifiés sont le plus souvent absents du spectre en raison de :
Phénomène de suppression de signaux (ex: phosphorylation apporte charge négative d’où faible ionisation)
Ions moléculaires portant les MPTs sont souvent instablesIons moléculaires de masses élevées (glycosylation (souvent > 800), ubiquitination (>
1000)…) donc plus difficilement ionisablesMPT n’est que partielle (ex: phosphorylation : seulement 10 à 20 % des protéines)
Solutions :Mise en évidence d’une modification post-traductionnelle
Enrichissement préalable : immunopurification (AC dirigés contre PhosphoTyr, lectinespour glycosylation) ou IMAC (phosphorylation)
Déphosphorylation (phosphatase alcaline) ou déglycosylation (enz. ou chim.) préalableAssociation d’analyseurs => détection d’ions diagnostics (Balayage des ions
précurseurs / recherche de perte de neutre)Détermination du poids moléculaire de la protéine
ConclusionIV- Etude des modifications post-traductionnelles
Analyse des MPT par SM : ex. d’enrichissement sur IMAC
Avec enrichissement
700 1060 1420 1780 2140 2500m/z0
20
40
60
80
100
Rel
ativ
e In
tens
ity (%
)
Trypsin
2211
.14
1959
.95
1751
.57
1735
.58
989.
4910
51.5
4763.
41
1655
.62
1671
.62
852.
39
80P
Peptides phosphorylés
700 1060 1420 1780 2140 25000
20
40
60
80
100
m/z
Rel
ativ
e In
tens
ity (%
)
Trypsin
842.
51 2211
.13
Trypsin
745.
4176
3.41
852.
38 1152
.61
1130
.56
1114
.56
1217
.66
1228
.70
1380
.76
1396
.76
1959
.93
1031
.53
1475
.77
Sans enrichissement
ConclusionIV- Etude des modifications post-traductionnelles
Analyse des MPT par SM : traitement à la phosphatase
Cartographie peptidique massique d’une protéine phosphorylée avant et après traitement à la phosphatase
Limites : Faible ionisation des phosphopeptides
Développemet possible : enrichissement préalable des phosphopeptides par IMAC
ConclusionIV- Etude des modifications post-traductionnelles
Analyse des MPT par SM : ex. de glycoprotéine (peroxydase végétale)