MODUL 3 Isolasi DNA Kromosom 3.1 Tujuan Memahami metode isolasi DNA kromosom dari sel prokariot berupa bakteri Gram negatifmenggunakan GeneJETrM Genomic DNA Purification Kit. 3.2 Prinsip Sel bakteri Gram negatif dipecahkan menggunakan Proteinase K dan Digestion Solution atau Lysis Solution RNA a@bggkg" dengan penambatran buaihvo glr\mno ) - trnF-FrJ drhrlongKen 2 KNase A. Lisat dicampurkan dengan 9919!, lalu dituangkan.ke $alam kolom iG[elonol 1 tel Pult{lko ii purifikasi, sehingga molekul DNA terikat pada membran silika. Kolom dicuci dengan W"tl, wffuyrA+membuang kontaminan. DNA kromosom dielusi dari -----.-leqdur dr opo ). bu11er NYa opq ?, membran silika pada kondisi kekuatan ionik yang rendah menggunakan Elution Btffer. 33 Teori DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perke,lnbangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada ryLbs, T{glgdttq dan kloroplas. Perbedaan diantara ketiganya' adatatr: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi derigan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
MODUL 3
Isolasi DNA Kromosom
3.1 Tujuan
Memahami metode isolasi DNA kromosom dari sel prokariot berupa
bakteri Gram negatifmenggunakan GeneJETrM Genomic DNA Purification Kit.
3.2 Prinsip
Sel bakteri Gram negatif dipecahkan menggunakan Proteinase K dan
Digestion Solution atau Lysis Solution RNA a@bggkg" dengan penambatran
buaihvo glr\mno ) - trnF-FrJ drhrlongKen 2
KNase A. Lisat dicampurkan dengan 9919!, lalu dituangkan.ke $alam kolom
iG[elonol 1 tel Pult{lko iipurifikasi, sehingga molekul DNA terikat pada membran silika. Kolom dicuci
dengan W"tl, wffuyrA+membuang kontaminan. DNA kromosom dielusi dari-----.-leqdur dr opo ). bu11er NYa opq ?,
membran silika pada kondisi kekuatan ionik yang rendah menggunakan Elution
Btffer.
33 Teori
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi
untuk mengatur perke,lnbangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.
DNA terdapat pada ryLbs, T{glgdttq dan kloroplas. Perbedaan diantara
ketiganya' adatatr: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat
dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk
sirkular dan tidak berasosiasi derigan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria
dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanva mewariskan sifat-sifu
dari garis ibg. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola
pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA
prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki
protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear
dan memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994:. 31!316; Raven &
Johnson 2002:94).
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan
komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan
pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin
dan pirimidin. 'Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki
struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin
(T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan
Sitosin, **1 akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin
berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu
komponen penrbangun (building block) DNA terdiri atas satu rylaJentelgr. satu
ryglrr 3:3, dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (kwis 2003: 176-
178).
Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat
herediter pada seltruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap m-ateri
genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi
kromosom. (Human Genome Project 2005: 1). DNA kromosom dari sel eukariotik
berukuran sangat panjang sehingga akan memiliki viskositas yang tinggr hila
berada pada larutan air. Karena sifat kromosom DNA yang rentan, maka selama
proses ekstraksi perlu dihindari penggunaan pipet tip berukuran sangat kecil serta
pengocokan (Wink, 20ll).
DNA dapat diisolasi dari jaringan hidup, sel, partikel virus, atau sampel
lain. DNA adalah suafu asam nukleat yang larut dalam air, terpresipitasi sebagai
makromolekul dalam campuran alkohol dan air. Isolasi DNA dibagi menjadi 2
tahap yaitu desintegrasi sel dari dinding sel, serta ekstraksi fasa air menggunakan
fenol/kloroform atau agen ekstraksi hidrofobik lainnya (Wink, 2Ol1). Isolasi
DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat
dilakukan baik dengan cara mekanis seperti ynikasi, tekanan tinggr, beku-leleh@?
maupun den$an cag@R f7n"rti pemberian lisozim. langkah berikutnya
adalah lisis sel. Batran-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah
diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang
lebih kasar perlu diperlalarkan dengan deterjen yang kuat seperti riton X-100 atau
dengan sodium dodesil sulfat (SDS).
Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan penrsakan membran
nukleus. Setelah sel mengalami lisis, rernukan-remukan sel harus dibuang.
Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang
tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform
untuk "-ra*;,'3.*tugasi
dan u,n"l"Llff r** eirzimatis dengair
proteinase.'DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih
tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan
DNA dari RNA. Molekul . DNA yang telah diisolasi tersebut kernucliarr
t0
dimumikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan
sentrifugasi kerapatan menggunakan CaClz.
Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA
senomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara
kedua macilm molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua
pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang
sangat kuat atau dikatakan mernpunyai bentuk covalently closed. circular (CCC),
sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya elan
mempunyai:Eishh-atkg'ra, yang sangat tinggr. Perbedaan tersebut menyebabkan
DNA plasmid jauh feUitr tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan
DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat
memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.
Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid,
zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa
molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit
daripada jumlah yang diserap oteh DNA kromosom per satuan panjangtya.
Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan
kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid
sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan-
Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan
dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi,
dan presipitasi. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin
digunakan, yaitu sel bakteri. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding" {an
t1
membran sel dengan larutan pelisis sel. Pada isolasi dari genom DNA ini semua
sel mempunyaii membrane plasma, lapisan lipoprotein ganda yang
membentuk penghalang mernisahkan isi sel dari lingkungan ekstraseluler. DNA
terdapat didalam suatu sel sehingga untuk mengisolasi suatu DNA, harus
dilakukan pernecahan sel secara fisik yurg diantaranya yaitu seperti
mechanical destruption, liquid homozigation, sonifikasi, freeze dan
marual grinding.
Disintegration ofbacterlal or eukaryotlc washing
celts (ethanol' salt)
,""-#Q #
o zol I wilsvcr, wqmcmwink - lir'oLiuLr SiotrchnoloEfISBN:978-l-527-326!7-2 Fit.09{3
Gambar l. Skema Purifikasi DNA dari prokariot atau
afinitas (Wink,eukariot menggunakan kolom
20tr).
tz-,6 JoM -)
{olQ Pertuub' nrcV
3.4 Bahan
1. Biakan bakteri E. coli Top 10 vans b€nmur 18'24 jam.@lupTrohrothon. 7 klonrg l<rn tlh dttvtut<''.tr