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LABORATORIO DE SALUD AMBIENTAL
PROCEDIMIENTO DE ANALISIS PARA LA NUMERACIN DE COLIFORMES
LSA P5.4-ML06
INDICE 1.
OBJETIVO..................................................................................................................
2 2. ALCANCE
..............................................................................................................
2 3. DOCUMENTOS RELACIONADOS ... .. 2
4. DEFINICIONES...... 2 5. RESUMEN .. 2
6. DESARROLLO..... 2 7. FORMULARIOS Y REGISTROS..... 4
8 REFERENCIAS... 4 9. ANEXOS ...... .. 4
FECHA DE APROBACION: 25 de agosto de 2008
FECHA DE REVISION: 25 de agosto de 2008
REVISION: 02
NOMBRE CARGO FIRMA
APROBO Blga. Soledad Osorio Alva.
Directora del Laboratorio de Salud Ambiental - DIGESA
REVISO
Blga. Edith Villanueva Huamn
Aseguramiento de calidad. Laboratorio de Salud Ambiental
DIGESA.
Blga. Aydee Valenzuela Warthon.
Jefa del rea de Microbiologa de Alimentos. Laboratorio de Salud
Ambiental DIGESA.
ELABORO Blga. Patricia Nez Ramos. Analista del rea de
Microbiologa de Alimentos. Laboratorio de Salud Ambiental
DIGESA.
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PROCEDIMIENTO DE ANALISIS PARA LA NUMERACIN DE COLIFORMES
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I OBJETIVO
Describir el mtodo de ensayo para la numeracin de Coliformes de
acuerdo con el mtodo horizontal ISO 4831:2006 tcnica del nmero ms
probable.
II ALCANCE
Este mtodo se aplica a muestras de alimentos destinados para
consumo humano.
III DOCUMENTOS RELACIONADOS
Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de alimentos
para anlisis microbiolgico. Instructivo de preparacin y
esterilizacin de medios de cultivo Procedimiento de aseguramiento
de la calidad de los resultados.
IV DEFINICIONES 4.1 Coliformes: grupo de bacterias que a
temperatura especfica (por ejemplo 30C o 37C) causan
fermentacin de la lactosa con la produccin de gas. 4.2 Deteccin
de Coliformes: determinacin de la presencia o ausencia de ests
bacterias, en una
cantidad particular de muestra de producto. 4.3 Numeracin de
Coliformes: nmero ms probable de coliformes encontrados, por
mililitro o por
gramo de muestra. V RESUMEN
Se emplea el caldo lauril sulfato triptosa como medio de
enriquecimiento selectivo, e incuba a 30 C 37 C seguido, de la
confirmacin de los tubos positivos con gas y turbidez en caldo
lactosado verde brillante bilis.
VI DESARROLLO 6.1 Medios de cultivo reactivos y/o
suplementos.
Adicionalmente a lo requerido en el Instructivo de preparacin y
dilucin de muestras de alimentos para anlisis microbiolgico, se
necesita lo siguiente:
6.1.1 Medio selectivo enriquecido: Caldo lauril sulfato triptosa
6.1.2 Medio para la confirmacin: Caldo lactosado verde brillante
bilis.
6.2 Equipos y materiales.
Adicionalmente a lo requerido en el Instructivo de preparacin y
dilucin de muestras de alimentos para anlisis microbiolgico e
Instructivo de preparacin y esterilizacin de medios de cultivo, se
necesita lo siguiente:
6.2.1 Incubadora de 30C 1 C o 37C 1 C. 6.2.2 Pipetas graduadas
terminales de vaciado total, capacidad nominal de 1 mL, 2 mL,
graduada en
divisiones de 0,1 mL y 0,5 mL, respectivamente. 6.2.3 Tubos de
prueba, de dimensiones aproximadamente 16 mm x 160 mm y 20mm x 200
mm 6.2.4 Tubos Durham, 7 x 70 mm 10 x 75 mm, para el uso en los
tubos de prueba de dimensiones de 16
mm x 160 mm. 6.2.5 pH-metro, preciso para + 1 unidad de pH a 25
C. 6.2.6 Asas de siembra de nquel-cromo o platino de 3,0 a 3,5 mm
de dimetro.
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66..33 Preparacin de la muestra, suspensin inicial y
diluciones.
6.3.1 Ver Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de
alimentos para anlisis microbiolgico.
6.4 Inoculacin e incubacin
6.4.1 Tomar 3 tubos de medio selectivo enriquecido de doble
concentracin. Usando una pipeta estril transferir a cada uno de
estos tubos 10 mL de la muestra problema si es lquida, o 10 mL de
la suspensin inicial en el caso de otros productos.
6.4.2 Luego, tomar 3 tubos de medio selectivo enriquecido de
simple concentracin. Usando una pipeta
estril nueva, transferir a cada uno de estos tubos 1 mL de la
muestra problema si es lquida, o 1 mL de la suspensin inicial en el
caso de otros productos.
6.4.3 Para cada uno de las siguientes diluciones, realizar la
inoculacin como se realiz con la primera
dilucin. Usar una pipeta estril nueva para cada dilucin. Mezclar
cuidadosamente el inculo y el medio.
6.4.4 Incubar todos los tubos a 30 C + 1 C o 37 C por 24 h + 2
h. Si no hay formacin de gas o turbidez,
continuar la incubacin otras 24 h + 2 h. 6.5 Confirmacin 6.5.1
De cada uno de los tubos incubados con medio de doble concentracin,
inocular con un asa a un
tubo de medio de confirmacin. Incubar a 30 C + 1 C o 37 C por 24
h + 2 h., si en esta etapa no se observa la formacin de gas,
continuar incubando otras 24 h + 2 h.
6.5.2 Realizar el mismo procedimiento para los tubos incubados
con medio de simple concentracin que
estn mostrando formacin de gas o turbidez a las 24 h + 2 h o a
las 48 h + 2 horas. 6.6 Interpretacin 6.6.1 Por cada dilucin,
contar el nmero total de tubos en la cual se observa la formacin de
gas (tubos
positivos) despus de las 24 h + 2 h o a las 48 h + 2 h. 6.7
Clculos y expresin de resultados: 6.7.1 Calcular el nmero ms
probable del nmero de tubos positivos de cada dilucin, ver anexo
5.
Ejemplos de la seleccin de resultados positivos para el clculo
de los valores del NMP. 6.7.2 Para el caso de muestras liquidas,
cuando la menor dilucin seleccionada corresponde a los tubos de
doble concentracin de medio (10 mL de inoculo), dividir el valor
NMP entre 10.
6.73 Cuando la lectura de la serie de tubos de todas las
diluciones, sean negativas, expresar de la siguiente forma:
Para productos lquidos: < 0,030 NMP/ mL
Para productos slidos: < 0,30 NMP/ g
6.8 Reporte 6.8.1 Los resultados obtenidos, se expresaran NMP de
coliformes / gramo o mililitro. 6.8.2 Los resultados para cada
muestra se transcriben al Registro interno de resultados que luego
se
archiva.
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6.9 Control de calidad
6.9.1 Para verificar la capacidad del laboratorio para la
numeracin de coliformes, con el mtodo y medios descritos en este
procedimiento, sembrar el medio de cultivo (caldo) con una cepa
apropiada de un Coliforme y proceder a travs de todo el protocolo
analtico usado para la muestra prueba. Un medio de control positivo
asegura que el medio de cultivo no contiene ninguna sustancia
inhibidora para los Coliformes.
6.9.2 Incluir adems un control de medio. El control es preparado
colocando un tubo con el medio de cultivo sin inocular a travs de
todo el procedimiento realizado para las muestras. Un medio de
control negativo asegura que el medio preparado no esta contaminado
con Coliformes.
VII FORMULARIOS Y REGISTROS 7.1 Registro de numeracin de
Coliformes.
VIII REFERENCIAS 8.1 ISO 4831:2006. Microbiology of food and
animal feeding stuffs Horizontal method for the detection
and enumeration of Coliforms Most probable number technique. 8.2
ISO 7218: 1996. Microbiology of food and animal feeding stuffs
General rules for microbiological
examinations. IX ANEXOS
N ANEXO TITULO
1 Diagrama de flujo del procedimiento (muestra slida)
2 Diagrama de flujo del procedimiento (muestra lquida)
3 Tabla NMP
4 Composicin y preparacin de los medios de cultivos y
reactivos.
5 Ejemplos de la seleccin de resultados positivos para el clculo
de los valores del NMP.
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ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento (muestra slida)
Incubar a 30C o 37C por 24 - 48 hs.
Leer los tubos
Positivos: Presencia de gas y turbidez
Negativos: Ausencia de gas y turbidez
Ver Tabla NMP
Considerar tubos para control (+) y (-)
Prueba Confirmativa
90 mL APS
9 mL APS
10-1 10-2 10-3
1 mL
1 mL 1 mL
Incubar a 30C o 37C por 24 48hs.
horas
Los tubos positivos con gas y turbidez, se pasan a:
....
1 mL 1 mL
1 2 X X
Incubar a 30C o 37C por 24 horas
Pasar a:
-1
10 mL
-3 -2 Considerar tubos para control (+) y (-)
Prueba Presuntiva
COLIFORMES
Caldo lactosado verde brillante bilis 10 mL por tubo
Caldo lauryl sulfato tryptosa 10 mL por tubo
10 g de muestra
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ANEXO 2: Diagrama de flujo del procedimiento (muestra
lquida)
Incubar a 30C o 37C por 24 - 48 horas
Leer los tubos
Positivos: Presencia de gas y turbidez
Negativos: Ausencia de gas y turbidez
Ver Tabla NMP
Considerar tubos para control (+) y (-)
Caldo lactosado verde brillante bilis 10 mL por tubo
Prueba Confirmativa
90 mL APS
9 mL APS
10-1 10-2 10-3
1 mL
1 mL 1 mL
Incubar a 30C o 37C por 24 - 48 hs.
Los tubos positivos con gas y turbidez, se pasan a:
....
1 mL 1 mL
10 2 X X
Incubar a 30C o 37C por 24 hs.
Pasar a:
-1
10 mL
-3 -2
....
Muestra Original (lquido)
1
1 mL
10 mL de muestra
Caldo lauryl sulfato tryptosa 10 mL por tubo
Considerar tubos para control (+) y (-)
Prueba Presuntiva
COLIFORMES
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ANEXO 3: Tabla NMP por 3 x 1 g (mL), 3 x 0,1 g (mL) y 3 x 0,01 g
(mL)
Resultados de Nmero de Tubos Positivos
NMP
Resultados de Tubos Positivos
NMP
0 0 0 110 Fuente: ISO 7218: 1996, pg. 40
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ANEXO 4: Composicin y preparacin de los medios de cultivos y
reactivos.
4.1 Medio selectivo enriquecido: Caldo lauril sulfato triptosa
Composicin a) Medio de doble
concentracin b) Medio de simple
concentracin Enzima digestiva de protena animal o de leche
40 g 20 g
Lactosa (C12H22O11.H2O) 10 g 5g Fosfato hidrgeno dipotsico
(K2HPO4)
5,5 g 2,75 g
Fosfato di hidrgeno potsico (KH2PO4)
5,5 g 2,75 g
Cloruro sdico 10 g 5 g Lauril sulfato de sodio 0,2 g 0,1 g Agua
1000 mL 1000 mL
Preparacin Disolver los diferentes componentes o del medio
completo deshidratado en el agua, si es necesario, calentar.
Ajustar el pH, si es necesario, para que luego de la esterilizacin
este sea 6,8 + 0,2 a 25C. Dispensar el medio en cantidades de 10 mL
en tubos de dimensiones de aproximadamente de 16 mm x 160 mm,
conteniendo tubos Durham en el caso de medio de simple
concentracin, y en los tubos de dimensiones de aproximadamente 20
mm x 200 mm (no contienen tubos Durham) en el caso del medio de
doble concentracin. Esterilizar en la autoclave a 121C por 15
minutos. Los tubos Durham no deben contener burbujas despus de la
esterilizacin.
4.2 Medio para la confirmacin: Caldo bilis lactosa verde
brillante Composicin Enzima digestiva de casena 10 g Lactosa
(C12H22O11.H2O) 10 g Bilis de buey desecado 20 g Verde brillante
0,0133 g Preparacin Disolver los componentes o del medio completo
deshidratado en el agua, calentar si es necesario. Ajustar el pH,
si es necesario, para que luego de la esterilizacin este sea 7,2 +
0,2 a 25C. Dispensar el medio en cantidades de 10 mL en tubos de
prueba de aproximadamente 16 mm x 160 mm conteniendo tubos Durham.
Esterilizar en una autoclave a 121C por 15 minutos. Los tubos
Durham no deben contener burbujas despus de la esterilizacin.
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ANEXO 5: Tabla: Ejemplos de la seleccin de resultados positivos
para el clculo de los valores del NMP.
Ejemplo
Nmero de tubos positivos obtenidos de tres tubos incubados para
las Resultados
siguientes cantidades inoculadas de la muestra por tubo1)
Productos lquidos 10 mL 1 mL 10-1 mL
10-2 mL 10-3 mL Serie NMP Lquidos mL
-1 Slidos g-1
Otros productos 1 g 10-1 g 10-2 g 10-3 g 10-4 g (M)
1 3 3 2 1 0 3,2,1 15 1,5 x 101 1,5 x 102
2 3 3 3 0 - 3,3,0 24 2,4 x 101 2,4 x 102
3 2 2 1 1 0 1,1,0 0,74 7,4 7,4 x 101
4 3 3 0 0 0 3,3,0 24 2,4 2,4 x 101
5 2 2 0 1 0 2,2,0 2,1 2,1 x 10-1 2,1
6 3 1 0 0 0 3,1,0 4,3 4,3 x 10-1 4,3
1) Negrita: combinacin seleccionada
Expresin de resultados Del ndice o serie obtenido, leer en la
tabla, para determinar el NMP de los microorganismos en el volumen
de la referencia, usando la siguiente ecuacin:
Cs= M F Vs Cs= M V0 d
Donde:
Cs = es el NMP de los microorganismos en el volumen de
referencia Vs;
M = es el NMP del ndice o serie, ledo de la Tabla 3 para la
dilucin bsica Vo;
F = es la reciproca del factor de dilucin correspondiente de la
dilucin, en todo caso, de la muestra tomada de la dilucin bsica
usada en la tabla (generalmente F= 10, 100, etc.);
Vs= es el volumen de referencia elegido para expresar la
concentracin del
microorganismo;
V0 = es la dilucin bsica.
d = dilucin de la primera serie.
Fuente: ISO 7218:1996, pgina 30