MIKROBIOLOGI TERAPANProduksi dan Preservasi Virus
ProduksiPada dasarnya adalah suatu proses untuk menghasilkan sesuatu baik benda/ barang atau jasa Produksi pada virus sangat bergantung dari interaksi antara virus dengan inangnya.
Interaksi virus dengan inangMerupakan hubungan kompleks yang sangat bergantung pada level ekologi, organisme, selullar dan molekular. Penting karena virus HANYA dapat bereplikasi dalam inangnya sehingga produksi virus hanya dapat dilakukan pada inang.
Infeksi virus pada inang tidak selalu menghasilkan produksi virus yang banyak karena inang hidup akan berespon aktif dengan memproduksi antibodi spesifik yang dapat menyerang invader virus tersebut
Sistem imun inangSistem imun inang yang aktif tidak hanya membatasi kehadiran agen penginfeksi, dapat membunuh agen penginfeksi yang masuk, mengingat penyerang dan dapat melindungi diri inang dari reinfeksi virus yang sama strainnya.
Peran sistem imun
Baik pada hewan vertebrata atau invertebrata, sistem imun akan berperan pada saat terjadi serangan agen penginfeksi terutama virus.
Sistem imun vertebrataLebih kompleks dari sistem imun invertebrata Ada sel darah putih, yang terdiri dari limfosit dan monosit
Sistem imun invertebrataHanya bergantung pada membran barrier pada saluran pencernaan, misal membran peritrofik serta sel fagositik primitif yang disebut HEMOSIT. Umumnya proliferasi virus pada sel epitel midgut lebih cepat daripada kapasitas fagosit hingga dalam waktu singkat semua sel somatik akan terinfeksi.
Tujuan produksi virusYaitu memperbanyak jumlah virus yang akan digunakan lagi : 1.untuk membunuh inang sasaran (contoh untuk agensia biologis). 2. Untuk mencegah terjadinya reinfeksi virus pada inang yang harus dilindungi dari serangan virus tersebut (contoh pembuatan vaksin)
Cara produksi virusAda dua metode yang umum untuk produksi virus : 1. Metode in vitro 2. Metode in vivo
Metode in vitroAdalah produksi virus yang dilakukan pada medium kultur sel atau kultur jaringan. Kultur sel/kultur jaringan dapat berasal dari sel inang utama atau sel inang pengganti yang rentan terhadap infeksi virus tersebut.
Metode produksi in vitro biasanya digunakan pada pembuatan vaksin. Pertumbuhan virus pada kultur sel atau jaringan lebih rumit daripada cara produksi virus dengan metode in vivo. Nutrisi dan lingkungan sangat berpengaruh terhadap produksi virus dengan metode ini
Cara produksi virus secara in vitroMetode sel kultur menggunakan permanen cell line. Ada dua macam permanen cell line yaitu a. primer cell line adalah kultur sel yang langsung diperbanyak dari jaringan/sel inang hidup. b. Secondary cell line adalah kultur sel primer yang terus menerus diperbanyak dalam nutrisi yang baru.
Biasanya permanent cell line dapat digunakan untuk pertumbuhan satu atau lebih agen viral. Contoh kultur sel asal serangga Trichoplusia ni, dapat diinfeksi oleh beberapa strain virus seperti AcNPV, TnNPV dan BmNPV, dengan AcNPV dan BmNPV bukan virus utama T.ni.
Sel kultur dapat dibuat dari sel jaringan hidup inang yang dibersihkan dengan desinfektans sebelum sel tersebut dipindahkan pada media nutrisi sel. Untuk merangsang pertumbuhan sel kultur, medium nutrisi sering ditambah dengan fetal bovine serum dan antibiotik.
Penggunaan sel kultur terutama untuk virus telanjang (tidak beramplop atau tidak punya badan inklusi/polihedra). Virion virus terlihat memasuki sel dengan cara fagositosis dan viropexis (umumnya lebih dari satu virion yang masuk ke dalam sel kultur).
Keberhasilan menumbuhkan sel kultur merupakan salah satu faktor yang paling berperan dalam meningkatkan produksi virus. Bila virus disubkultur berulang (passage) pada kultur sel, umumnya akan menurunkan jumlah virus yang dihasilkan dan pada virus yang berpolihedra akan terjadi penurunan jumlah virion normal. Kemampuan virulensi virus dapat menurun hingga 100X lebih rendah.
Kemampuan virulensi yang menurun akan merugikan bagi penggunaan virus sebagai agensia biologis tapi menguntungkan bila virus digunakan sebagai vaksin. Faktor lain yang dapat mempengaruhi penurunan virulensi virus adalah penggunaan kultur sel yang telah diperbanyak secara berulang.
Selain virulensi virus menurun, seringkali terjadi perubahan pada morfologi virus penginfeksi atau terjadi juga perubahan pada bentuk sel kulturnya yang menyebabkan virus tidak dapat lagi menginfeksi sel kultur tersebut.
Kelebihan produksi virus secara in vitro- bersih, tidak terkontaminasi mikroorganisme pencemar - Produksi virus dapat dilakukan dengan fermentor seperti fermentasi mikroba yang dapat mengurangi pemborosan tempat
Batch culture untuk produksi virus
Plaque pada kultur sel
Kelemahan produksi virus secara in vitro1. Mahal 2. Sterilitas ruangan harus dijaga 3. Produksi virus hanya sekitar maksimal 70% volume produksi virus pada inang 4. Produksi virus yang berkelanjutan/passage dalam sel kultur dapat menyebabkan virus kehilangan sifat virulensinya.
Metode in vivoadalah suatu cara produksi virus dalam tubuh inang utama yang hidup atau inang pengganti yang rentan terhadap infeksi virus. Produksi untuk komersial harus mengembangbiakan inang sebagai media replikasi virus. Inang harus ditempatkan pada ruang steril untuk mencegah kontaminasi oleh mikroorganisme lain.
Cara membuat inang sterilPemeliharaan ayam steril yang dimulai dari telur berembrio yang didesinfektan, anak ayam yang keluar dari telur diberi pakan steril dan ditempatkan pada ruangan steril. Perlakuan ini akan menghasilkan ayam steril yang kelak menghasilkan telur steril sebagai media perbanyakan beberapa jenis virus (terutama untuk pembuatan vaksin)
Telur tertunas
Cara produksi virus secara in vivo1. Mengumpulkan inang seumur, berat badan sama, dalam satu tempat (terutama untuk inang yang dapat dipelihara secara berkelompok) 2. Mencampurkan suspensi virus dengan konsentrasi tertentu pada pakan, terutama produksi virus yang merupakan racun oral
3. Sepanjang proses infeksi, jumlah virus tertinggi terjadi pada beberapa saat sebelum kematian inang (terutama untuk virus berpolihedra). 4. Jumlah virus yang dihasilkan akan berkorelasi dengan berat badan inang, semakin berat inang jumlah virus yang dihasilkan akan semakin banyak.
5. Virus akan maksimal diproduksi bila tingkat mortalitas inang mencapai lebih dari 95% 6. Inokulum awal infeksi tidak boleh terlalu besar karena inokulum awal yang tinggi menyebabkan inang lebih cepat terbunuh sebelum mencapai berat badan maksimal sehingga produksi virus rendah.
7.Panen virus dari inang yang masih hidup akan 6-12 kali lebih rendah daripada panen virus yang dihasilkan dari inang yang mati oleh infeksi virus.
Kelebihan produksi virus secara in vivo1. Lebih ekonomis 2. Jumlah volume virus yang dihasilkan umumnya tinggi karena replikasi virus akan berhenti saat sel terakhir inang terinfeksi. 3. Stabilitas virulensi virus terjaga
Kelemahan produksi virus secara in vivo1. Mudah terkontaminasi mikroorganisme yang tidak diinginkan 2. Bila ada virus lain ikut menginfeksi inang maka kedua jenis virus tersebut akan mempercepat kematian inang tetapi kedua virus tidak dapat terdeteksi atau salah satu virus dapat terdeteksi dengan volume sangat sedikit. Pada virus berpolihedra, terjadi penurunan jumlah polihedra, virion dan perubahan pada morfologi polihedra.
3. Bila inang kanibal (terutama pada larva serangga), memerlukan biaya pemeliharaan dan ruang yang cukup luas karena larva harus dipelihara secara individual.
Tempat pemeliharaan larva
Pemeliharaan serangga
Keberhasilan produksi virusBerhasil bila titer atau konsentrasi virus dalam cairan inang meningkat/tinggi, hal ini terjadi pada virus telanjang/naked virus. Berhasil bila jumlah virus yang dihasilkan lebih banyak daripada jumlah virus yang diinfeksikan pada inang, hal ini terjadi pada virus beramplop/polihedra.
Penyimpanan atau preservasi virusKarena virus merupakan agen hidup, fase penyimpanan berperan penting agar virus tetap efektif menginfeksi. Waktu panen virus, lingkungan penyimpanan berperan dalam menghambat pertumbuhan kontaminan dan mempertahankan virulensi virus.
Formulasi virus agar dapat disimpan lama dapat berbentuk cairan suspensi, diikat dengan emulsifier di cairan, tepung basah, debu dan granul. Penyimpanan virus dalam bentuk tepung basah debu dan granul hanya dapat dilakukan pada virus yang secara alamiah memiliki polihedra.
Formulasi pembawa tersebut harus bersifat nonkorosif, mudah terdistribusi dan tidak menyumbat peralatan aplikatornya. Masalah penggunaan tepung basah dan debu sebagai pembawa adalah kualitas virus mudah menurun
Formulasi virus harus dijauhkan dari sinar matahari yang dapat menyebabkan virus kehilangan kemampuan menginfeksi. Formulasi virus yang tercampur agen sintetik lain misal insektisida dapat menurunkan infektifitas virus seperti virus yang terpapar sinar matahari.
Infektivitas virus dapat berkurang bila pH berubah, misal adanya klorin dalam air suspensi virus. Agensia virus yang diisolasi dari lapangan biasanya lebih aman, karena menyebabkan epizootik alamiah pada populasi inang.
