16Isolasi dan Inokulasi MikroorganismeBAB IPENDAHULUANA. Teori
UmumMikrobiologi adalah sebuah cabang dari ilmu biologi yang
mempelajari mikroorganisme atau jasad renik. Objek kajiannya adalah
semua makhluk (hidup) yang tidak dapat dilihat jelas dengan mata
tanpa menggunakan alat bantu seperti mikroskop, khususnya bakteri,
fungi, alga mikroskopik, protozoa dan archaea. Virus sering juga
dimasukkan walaupun sebenarnya tidak sepenuhnya dapat dianggap
sebagai makhluk hidup.Mikroorganisme atau mikroba adalah organisme
yang berukuran sangat kecil sehingga untuk mengamatinya diperlukan
alat bantuan. Mikroorganisme disebut juga organisme mikroskopik.
Mikroorganisme seringkali bersel tunggal (uniseluler) maupun bersel
banyak (multiseluler). Namun, beberapa protista bersel tunggal
masih terlihat oleh mata telanjang dan ada beberapa spesies
multisel tidak terlihat mata telanjang. Virus juga termasuk ke
dalam mikroorganisme meskipun tidak bersifat seluler.Isolasi adalah
suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari
lingkungannya, sehingga akan diperoleh kultur murni atau biakan
murni. Kultur murni adalah kultur yang sel-sel mikrobianya berasal
dari pembelahan dari satu sel tunggal. Isolasi dapat dilakukan
dengan dua metode yaitu metode cawan tuang dan metode cawan gores.
Ada berbagai cara untuk mengisolasi bakteri dalam biakan murni
yaitu, cara pengenceran, cara penuangan, cara penggesekan atau
penggoresan, cara penyebaran, cara pengucilan 1 sel, dan cara
inokulasi pada hewan. Penanaman bakteri atau biasa disebut juga
inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang
lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat
tinggi. Inokulasi dilakukan dalam kondisi aseptik, yakni kondisi
dimana semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium dan
pengerjaan, dijaga agar tetap steril. Hal ini untuk menghindari
terjadinya kontaminasi. Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih
dan keadannya harus steril agar tidak terjadi kesalahan dalam
pengamatan atau percobaaan. Inokulasi dapat dilakukan dalam sebuah
kotak kaca yang biasa disebut sebagai laminar air flow ataupun
dalam ruangan yang terjaga kesterilannya.
B. Maksud dan Tujuan Percobaan1. Maksud PercobaanMaksud
percobaan ini adalah untuk mengidentifikasi mikrrorganisme/bakteri
tertentu melalui proses isolasi dan inokulasi.2. Tujuan
PercobaanTujuan percobaan ini adalah agar mahasiswa/mahasiswi
(praktikan) dapat mengetahui cara untuk mengidentifikasi
mikrorganisme/bakteri tertentu melalui proses isolasi dan
inokulasi.
C. Prinsip PercobaanPrinsip dari percobaan ini yaitu
identifikasi bakteri menggunakan sampel air got dengan mengisolasi
dan menginokulasi sampel tersebut dengan metode tuang dan
sebar.
BAB IITINJAUAN PUSTAKAA. Landasan TeoriPopulasi mikroorganisme
yang ada di alam sekitar kita ini ssangatlah besar dan cukup
kompleks. Beratus spesies mikroba menguasai setiap bagian tubuh
kita. Mereka terdapat dalam jumlah yang cukup basar. Sebagai
contoh, sekali kita bersin dapat mnebarkan beribu- ribu
mikroorganisme. Satu gram tinja dapat mengandung jutaan bakteri.
Alam di sekitar kita, baik itu tanah, air, maupunudara juga dihuni
oleh kumpulan mikroorganisme.Penelitian yang layak mengenai
mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk
memisahkan populasi campuran yang rumit ini, atau yang biasanya
dikenal dengan istilah biakan campuran, menjadi spsies yang
berbeda- beda yang bikenal dengan istilah biakan murni. Biakan
murni in teerdiri dari satu populasi sel yang semuanya berasal dari
satu sel induk (Pelczar, 1986).Mikroorganisme dapat diperoleh dari
lingkungan air, tanah, udara, suubstrat yang berupa bahan pangan,
tanaman dan hewan. Jenis mikroorganismenya dapat berupa bakteri,
khamir, kapng dan sebagainya. Populasi dari mikroba yang ada di
linkungan ini sangatlah beraneka ragam sehinga dalam mengisolasi
diperlukan beberapa tahap penanaman sehingga berhasil diperoleh
koloni yang tunggal. Koloni yang tunggal ini kemudian yang akan
diperbanyak untuk suatu tujuan penelitian misalnya untuk
menngisolasi DNA mikroba yang dapat mendeteksi mikroba yang telah
resisten terhadap suatu antibiotik atau untuk mengetahui mikroba
yang dipakai untuk bioremediasi holokarbon (Fardiaz,
1992).Inokulasi (penanaman bakteri) merupakan pekerjaan memindahkan
bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru minta banyak
ketelitian. Untuk itu terlebih dahulu harus diusahakan agar semua
alat-alat yang ada sangkut-paut dengan medium dan pekerjaan
inokulasi itu benar-benar steril, ini untuk menghindari kontaminasi
yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak kita inginkan
(Dwidjaseputro, 1998).Untuk meumbuhkan suatu biakan bakteri dalam
media steril sejumlah sel-sel (inokulum) dipindahkan (diinokulasi)
kedalam media dengan perlakuan khusus untuk mempertahankan
kemurnian dari biakan. Pada waktu inokulasi, jarum yang digunakan
untuk memindahkan mikroba harus dipijarkan diatas api segera
sebelum dan sesudah melakukan pemindahan. Pemanasan ini
menghancurkan setiap bentuk kehidupan yang ada pada permukaan jarum
atau alat pemindah (Sutedjo, 1997). Faktor-faktor baik faktor fisik
maupun faktor fisiologi dan biokimia yang mempengaruhi pertumbuhan
suatu mikroorganisme, sehingga menyebabkan mikroorganisme dapat
tumbuh dan berkembang biak pada suatu bahan atau sediaan tertentu,
tetapi tidak pada bahan atau sediaan lainnya meliputi air, suhu,
pH, konsentrasi oksigen, kandungan zat-nutritif, adanya
komponen-komponen penghambat, adanya saingan dengan mikroorganisme
yang lainnya. Mikroorganisme memerlukan air untuk hidup dan
berkembang biak, oleh karena itu pertumbuhan mikroorganisme didalam
suatu makanan sangat dipengaruhi oleh jumlah air yang dapat
digunakan oleh mikroorganisme tersebut. Air yang digunakan untuk
pertumbuhan mikroorganisme dapat dihubungkan dengan istilah water
activity.Cara isolasi dan identifikasi bakteri adalah merupakan
suatu topic yang sangat luas dan hanya dapat dilakukan oleh
orang-orang yang telah berpengalaman. Cara-cara ini adalah suatu
tantangan yang menarik bagi para mikrobiologiwan, karena
mikrorganisme atau bakteri tersebut terdapat dalam berbagai sumber
yang terdiri dari ribuan spesies, dan terdapat dalam berbagai
habitat. Namun dalam beberapa hal identifikasi terhadap bakteri
dapat dibuat dari pengamatan preparat yang diwarnai seseorang dan
dapat ditentukan ukuran, bentuk, dan kelompok atau group
organismenya. Namun diagnosa mikroskopik hanya merupakan dugaan.
Metoda kultur merupakan metode yang memberikan karakteristik koloni
dan sifat-sifat biokimia. Sifat-sifat karakteristik berarti sifat
morfologik atau susunan sel-sel, jumlah dan susunan flageila ada
tidaknya, spora, reaksi gram dan lain-lain. Semua sifat-sifat ini
mencerminkan kandungan genetik sel sehingga berguna dalam
identifikasi (Djide dan Sartini, 2013).Fase-fase isolasi dan
inokulasi pertumbuhan mikrooragnisme yaitu (1) Fase Permulaan. Pada
fase tersebut mikroorganisme melakukan penyesuasian diri dengan
lingkungan yang baru. Berbagai macam enzim dan zat-zat perantara
yang dibentuk pada fase ini, sehingga memungkinkan akan terjadi
pertumbuhan lebih lanjut. Sel-sel pada fase ini mulai membesar,
tetapi belum melakukan pembelahan sel. (2) Fase Pertumbuhan yang
dipercepat. Pada fase ini mikroorganisme mulai melakukan pembelahan
diri, tetapi waktu generasinya masih panjang. Pada pertumbuhan
dipercepat bersama-sama dengan fase ini permulaan tadi sering
disebut lag phase atau phase of adjustment. (3) Fase Pertumbuhan
Logaritma. Pada fase ini pertumbuhan ini kecepatan pertumbuhan
paling cepat, waktu generasinya pendek dan konstan. Selama fase ini
metabolism paling cepat dan pesat, jadi sintesa bahan sel sangat
cepat dan konstan. Mikroorganisme pada fase logaritma ini apabila
dipindahkan dalam medium yang baru yang sama komposisinya dengan
medium awalnya, maka kecepatan pertumbuhan akan tetap, artinya akan
tetap pada fase logaritma. (4) Fase Pertumbuhan mulai Terhambat.
Pada fase ini pertumbuhan mulai terhambat, hal ini disebabkan
karena adanya pengurangan nutrient dan mulai terjadi penimbunan
hasil-hasil metabolisme yang bersifat racun, juga terjadi perubahan
lingkungan seperti pH dan lain-lain. Apabila dilakukan penambahan
atau penetralan racun-racun pada keadaan ini, maka logaritma dapat
diperpanjang. (5) Fase Stasioner atau Fase Konstan. Karena adanya
penurunan kadar nutrient dan adanya zat-zat yang bersifat racun,
maka kecepatan pertumbuhan perbanyakan mikroorganisme akan
terhambat. Panjang pendek fase stasioner ini sangat bergantung pada
mikroorganisme dalam mengahapi faktor-faktor pertumbuhan serta
perubahan-perubahan yang berlangsung dalam medium. (6) Fase
Kematian yang dipercepat dan fase Logaritma. Kedua fase ini sering
disebut sebagai fase penurunan kematian. Pada fase ini kecepatan
kematian meningkat terus menerus sedangkan kecepatan pembelahan
menjadi nol. Setelah sampai ke fase kematian logaritma kecepatan
kematian mencapai maksimum (Djide dan Sartini,2013).Identifikasi
mikroorganisme dapat dilakukan hanya menguunakan prepata olesan
saja secara langsung. Misalnnya terhadap infeksi yang disebabkan
oleh bakter-bakteri antrhoax,iubekulosis dan beberapa clotridium,
dilakukan diagnose secara tentative dengan pengamatan koloni dan
sifat-sifat pertumbuhannya. Dalam beberapa hal pada identifikasi
masih dibutuhkan uji-uji lanjutan seperti halnya berbagai uji-uji
biokimia. Bahkan kadang-kadng untuk pengkuruan masih dibutuhkan uji
laiinya seperti uji serologi dan pengujian pada hewan uji. Bahkan
pada mikroorganisme baru, mungkin memerlukan analisa kimia untuk
memantapkan dalam nomenklatur dan klasifikasi (Djide dan Sartini,
2013).
B. Uraian Bahan1. Akuades ( Ditjen POM. 1979. Farmakope
Indonesia Edisi III : 96 ) Nama resmi: Aqua destillata Nama lain:
Air suling RM/ BM: H2O / 18,02 Pemerian: Cairan jernih ; tidak
berwarna ; tidak berbau ; tidak mempunyai rasa. Penyimpanan: Dalam
wadah tertutup baik. Stabilitas: Air adalah salah satu bahan kimia
yang stabil dalam bentuk Fisik (es , air , dan uap). Air harus
disimpan dalam wadah yang sesuai. Pada saat penyimpanan dan
penggunaannya harus terlindungi dari kontaminasi partikel- pertikel
ion dan bahan organik yang dapat menaikan konduktivitas dan jumlah
karbon organik. Serta harus terlindungi dari partikel partikel lain
dan mikroorganisme yang dapat tumbuh dan merusak fungsi air. OTT:
Dalam formula air dapat bereaksi dengan bahan eksipient lainya yang
mudah terhidrolisis.
2. Alkohol ( FARMAKOPE INDONESIA IV halaman 63, Martindale 30th
edition halaman 783, Handbook of Pharmaceutical excipient edisi VI
halaman 7) Nama resmi: Aethanolum Nama lain: Etanol / Alkohol Rumus
molekul: C2H6O BM: 46,07 Pemerian: Cairan mudah menguap, jernih,
tidak berwarna, bau khas dan menyebabkan rasa terbakar pada lidah.
Mudah menguap meskipun pada suhu rendah dan mendidih pada suhu 78C
dan mudah terbakar. Kelarutan: Bercampur dengan air dan praktis
bercampur dengan semua pelarut organik. Berat Jenis: 0,812 0,816
g/ml. Stabilitas: Mudah menguap walaupun pada suhu rendah. OTT:
Bahan pengoksidasi bila dicampur dengan alkali, warna akan menjadi
gelap. Konsentrasi: 60-90 %. Kegunaan: Anti mikroba, desinfektan,
pelarut, penetrasi kulit.Penyimpanan: Wadah tertutup rapat jauh
dari api.
3. Kapas ( Dirjen POM, 1979 : halaman 277 )Nama resmi: Gossypium
Depuratum.Nama Lain: Kapas murni, Kapas tak berlemak.Pemerian :
Hampir tidak berbau, praktis tidak berasa.Kelarutan : Praktis tidak
larut dalam pelarutbiasa, larut dalam larutan tembaga (II) klorida
ammonia P.Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik, terlindung dari
cahaya, tidak boleh dibungkus langsung dengan kertas lilin.Khasiat
& penggunaan: Pembalut.
4. Nutrient Agar (NA)Komposisi :Peptic digest of Animal tissue5,
00Sodium chloride5, 00Beef extract1, 50Yeast extract1, 50Agar15,
00
BAB IIIMETODE PERCOBAANA. Pengambilan SampelPengambilan sampel
dilaksanakan pada Hari
B. Alat dan Bahan1. AlatAlat yang digunakan dalam praktikum
Isolasi dan Inokulasi Mikroorganisme ini adalah :a. Batang
pengadukb. Cawan Petric. Fillerd. Hot Platee. Inkubatorf. Labu
Erlenmeyerg. Lampu Spiritush. Pipet tetesi. Rak tabung reaksij.
Tabung reaksi
2. BahanBahan yang digunakan dalam praktikum Isolasi dan
Inokulasi Mikroorganisme ini adalah :a. Air gotb. Akuadesc.
Alkohold. Kapase. Nutrient Agar (NA)
C. Cara KerjaCara kerja dalam melakukan praktikum Isolasi dan
Inokulasi Mikroorganisme ini adalah :1. Disiapkan alat dan bahan2.
Dibersihkan alat dan bahan menggunakan alkohol 70%3. Diletakkan 6
tabung reaksi kedalam rak tabung4. Diisi masing-masing tabung
reaksi dengan aquades sebanyak 9 ml5. Dimasukkan sampel air got
pada tabung reaksi pertama6. Dilakukan pengenceran bertingkat
dengan mengambil 1 ml aquades yang sudah dicampur dengan sampel dan
dimasukan pada tabung reaksi ke dua7. Diulangi sampai pada tabung
reaksi ke enam8. Disiapkan media NA (Nutrien Agar)9. Dimasukan NA
(Nutrien Agar) kedalam cawan petri10. Ditambahkan air sampel 1 ml
kedalam cawan petri11. Dihomogenkan12. Dibungkus dengan menggunakan
kertas bekas13. Diinkubasi pada incubator dengan suhu 37 0 selama
1x24 jam
BAB IVHASIL DAN PEMBAHASANA. Gambar Hasil PengamatanBerikut
tabel pengamatan yang didapatkan setelah praktikum Isolasi dan
Inokulasi Mikroorganisme.Metode Tuang
Sebelum InkubasiSetelah Inkubasi 1 x 24 jam
Metode Sebar
Sebelum InkubasiSetelah Inkubasi 1 x 24 jam
B. PembahasanIsolasi adalah merupakan cara memisahkan
mikroorganisme tertentu dari lingkungan, sehingga dapat diperoleh
biakan yang sifatnya murni, sehingga biakan tersebut disebut kultur
murni. Sedangkan inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri
dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian
yang sangat tinggi.Dalam mengisolasi suatu mikroorganisme,
dilakukan dengan cara yang aseptis untuk menghindari terjadinya
kontaminasi dengan mikroorganisme lain. Kebanyakan mikroorganisme
dapat diisolasi dan diinokulasi dalam biakan murni dengan
memindahkan suatu koloni secara gcermat, mensuspensikan kembali
dalam cairan dan menanamnya kembali pada medium yang
selektif.Pemindahan mikroorganisme ini dilakukan dengan teknik
aseptik untuk mempertahankan kemurnian biakan selama pemindahan
berulang kali. Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dalam biakan cair
ataupun padat. Dalam melakukan isolasi mikroba, terlebih dahulu
kita harus memperhatikan alat-alat yang digunakan apakah sudah
steril, agar tidak terkontaminasi oleh udara luar yang dapat
merangsang pertumbuhan mikroba yang tidak kita inginkan pada suatu
medium. Untuk tujuan tersebut digunakan media aseptis untuk
mencegah kontaminasi. Adapun dalam praktikum ini digunakan metode
tuang dan metode sebar. Metode tuang yaitu dilakukan dengan
menuangkan Nutrient Agar (NA) dengan sampal air secara bersamaan
dengan metode aseptik, dimana penuangan terjadi pada cawan petri
dengan mendekatkannya dengan nyala lampu spriritus agar tidak
terkontaminasi dengan bakteri ruangan ataupun bakteri-bakteri
lainnya. Sedangkan metode sebar adalah dengan dilakukan penuangan
secara bertahap. Nutrient Agar (NA) dahulu kemudian sampel pada
cawan petri dengan pula metode aseptik. Setelah proses penuangan
dilakukan penghomogenan. Kemudian dibungkus kertas bekas. Karena
yang identifikasi bakteri maka peletakan cawan peteri saat
dibungkus tidak terbalik dan setelahnya dimasukan ke inkubator
untuk diinkubasi.Dalam praktikum ini tidak sedikit dilakukan
kesalahan antaranya pada pengenceran tingkat dengan konsentrasi
lebih, pembagian dua Nutrient Agar (NA) hingga kurang bersih dan
rapinya praktikan dalam praktikum sehingga hasil praktikum yang
didapatkan kurang begitu memuaskan, salah satunya yaitu media yang
blepotan.
BAB VPENUTUPA. KesimpulanKesimpulan yang dapat diambil dari
praktikum ini yaitu : Terdapat bakteri baik yang metode sebar
maupun dengan metode tuang setelah medium di inkubasi selama 1x24
jam. Metode sebar merupakan metode dengan penuangan Nutrient Agar
dan sampel air secara bertahap pada cawan petri. Metode tuang
merupakan metode dengan penuangan Nutrient Agar dan sampel air
secara bersamaan pada cawan petri.
B. SaranSebelum melakukan praktek di laboratorium sebaiknya
praktikan mempelajari terlebih dahulu teori teknik isolasi dan
inokulasi agar tidak terjadi kesalahan pada saat praktikum
berlangsung. Serta kiranya asisten mengawasi dan membimbing
praktikan demi kelancaran praktikum tanpa ada hambatan.
DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. Gramedia Pustaka
Utama. Jakarta.Fardias, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. Gramedia
Pustaka Utama. Jakarta.Pelczar, Michael, J. 1986. Dasar-Dasar
Mikrobiologi. Universitas Indonesia. Jakarta.
LAMPIRANI. Skema KerjaDisiapkan alat dan bahanDibersihkan alat
dan bahan menggunakan alcohol 70%Diletakkan 6 tabung reaksi kedalam
rak tabungDiisi masing-masing tabung reaksi dengan aquades sebanyak
9 ml
Dimasukkan sampel air got pada tabung reaksi pertama
Dilakukan pengenceran bertingkat dengan mengambil 1 ml aquades
yang sudah dicampur dengan sampel dan dimasukan pada tabung reaksi
ke dua
Diulangi sampai pada tabung reaksi ke enam
Disiapkan media NA (Nutrien Agar)
Dimasukan NA (Nutrien Agar) kedalam cawan petri
Ditambahkan air sampel 1 ml kedalam cawan petri
Dihomogenkan
Dibungkus dengan menggunakan kertas bekas
Diinkubasi pada inkubator dengan suhu 37 0 selama 1x24 jam
Ismar Wulan Rina Andriani, S. Farm., Apt.O1A114017