INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA Micro-evolución genómica de Helicobacter pylori TESIS Que para obtener el grado de: MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA Presenta EDGAR EDUARDO LARA RAMÍREZ Reynosa, Tamaulipas, México, Febrero de 2010
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
Micro-evolución genómica de Helicobacter pylori
TESIS
Que para obtener el grado de:
MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
Presenta EDGAR EDUARDO LARA RAMÍREZ
Reynosa, Tamaulipas, México, Febrero de 2010
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Politécnico Nacional, líder en educación tecnológica vanguardista en México
por brindarme las herramientas necesarias en mí desarrollo académico.
Al Centro de Biotecnológica Genómica por facilitarme sus instalaciones durante la
Maestría.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por otorgarme la beca para realizar mis
estudios de Maestría.
Al Programa Institucional de Formación de Investigadores del Instituto Politécnico
Nacional por la otorgarme la beca.
Al Espacio Común de Educación Superior por otorgarme la beca de movilidad Santander.
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
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ÍNDICE
CONTENIDO PÁGINA
ABREVIATURAS .............................................................................................................................. iii
RELACIÓN DE CUADROS Y FIGURAS ................................................................................................. v
RESUMEN ...................................................................................................................................... vi
ABSTRACT .................................................................................................................................... viii
Cuadro 5. Matriz de permutación que indica el orden génico de los genomas de H. pylori y el orden
génico ancestral sugerido por MGR.............................................................................................. 38
Cuadro 6. Eventos y señales de recombinación identificados en los genes de virulencia y genes de
mantenimiento provenientes de diversas cepas de H. pylori. ......................................................... 40
Figura 1. Alineamiento de siete genomas de aislados de H. pylori………………………26
Figura 2. Alineamiento de las islas de patogenicidad de H. pylori………………………29
Figura 3. Diagrama de Venn representando el genoma núcleo del genero Helicobacter..31
Figura 4. Árbol filogenómico de Helicobacter pylori basado en la historia de las
inversiones…………………………………………………………………………………39
Figura 5. Resultado de la salida originada por el programa RAT para el gen cagA……...42
Figura 6. Resultado de la salida originada por el programa RAT para el gen vacA……...43
Figura 7. Árbol filogenético construido a partir de secuencias completas del gen cagA…46
Figura 8. Árbol filogenético construido a partir de secuencias completas del gen vacA ...47
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RESUMEN
La bacteria Helicobacter pylori (H. pylori), que coloniza de forma persistente el
estómago humano, exhibe altos niveles de diversidad genética, por lo que es un modelo
para estudiar el papel de la plasticidad genómica en un organismo procariote. H. pylori
tiene un genoma dinámico que le permite adaptarse al ambiente de su hospedero.
La comparación genómica permite determinar los reordenamientos y las relaciones
evolutivas entre los diferentes genomas de H. pylori. En este estudio, las secuencias
concatenadas del cromosoma principal de siete cepas de H. pylori (26695, J99, HPAG1,
G27, P12, shi470, B38) y secuencias de la isla de patogenicidad se alinearon con el
programa MAUVE con el objetivo de examinar el orden génico, la extensión de las
regiones de ADN en común, el genoma de núcleo y el grado de relación entre ellos.
Igualmente, se realizó un análisis del genoma ancestral, basado en la historia de las
inversiones con el programa MGR, un análisis de los patrones de recombinación entre
especies y un análisis filogénetico de los genes cagA y vacA.
Los resultados obtenidos indican que H. pylori evoluciona a consecuencia de la
presión de selección positiva y negativa, lo que le permite adaptarse al huésped humano en
la fase de infección inicial y durante el proceso de establecimiento que produce los
síntomas clínicos de la enfermedad. Además, los mecanismos de recombinación intra-
genómicos e inter-genómicos son utilizados por H. pylori de manera selectiva e inteligente.
El análisis filogenético refuerza que H. pylori puede ser utilizado como un modelo genético
útil y esto pudiera ser extrapolado en el estudio de co-evolución con el humano. La alta
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flexibilidad micro-evolutiva de H. pylori juega un papel central en la adaptación de éste a
su hospedero.
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
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Genomic micro-evolution of Helicobacter pylori
ABSTRACT
The highly diverse bacterium Helicobacter pylori (H. pylori), which persistently
colonizes the human stomach, provides a model to study the genome evolution. H. pylori
has a very plastic genome which presumably enhances its adaptation to host niches. The
genome comparison approach can determine the genomic rearrangements and evolutionary
relationships among different genomes of H. pylori strains. In this study, the concatenated
chromosomal sequences from seven strains of H. pylori (26695, J99, HPAG1, G27, P12,
shi470, B38) and sequences from Cag Pathogenicity Island were aligned using MAUVE to
examine the gen order, extent of shared DNA regions, core genome, and the degree of
relatedness among them.
In parallel, the ancestral genome, based on history inversions using the program
MGR, was reconstructed. In addition, we analyzed the patterns of interspecific
recombination and examined the phylogeny of the cagA and vacA genes. The results
obtained suggest that H. pylori evolves from positive and negative selection forces allowing
its adaptation to the human host during the initial phase of infection, and throughout the
natural course of the disease. The mechanism of intragenomic and intergenomic
recombination is utilized for H. pylori from a selective and an intelligent mode.
Moreover, the phylogenomic and phylogenetic analysis indicated that H. pylori
maybe utilized like a useful genetic marker to study the human evolution. In summary, the
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high micro-evolutionary flexibility of H. pylori plays a central role in the adaptation to the
human host.
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
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1. INTRODUCCIÓN
La bacteria H. pylori es un organismo micro-aerofílico que tiene la extraordinaria
capacidad de infectar el estómago humano y persistir en él incluso hasta pasadas varias
décadas evadiendo la respuesta inmune e inflamatoria de su hospedero.
A nivel mundial, más del 50% de la población humana es portadora de este
microorganismo. El reconocimiento de la infección por H. pylori como causa de morbilidad
gastroduodenal ha tenido probablemente un mayor impacto en el sector salud en
comparación con otras enfermedades emergentes como el VIH. Se ha investigado a la
especie H. pylori debido a su asociación como agente causal de la enfermedad ulcerosa
péptica y como factor de riesgo para el desarrollo de cáncer gástrico siendo considerado
como ente carcinógeno por la Organización Mundial de la Salud y por la Agencia para la
Investigación Contra el Cáncer (Kersulyte et al., 2000).
Helicobacter pylori es un organismo panmítico que exhibe altos niveles de
diversidad genética en los aislados de pacientes con distinto estado clínico. Esta diversidad
genética es debida a la alta frecuencia de mutación y a la recombinación genética que
experimenta dicha bacteria (Suerbaum et al., 1998). La alta diversidad genética en las
diferentes cepas de H. pylori sugiere que dicha bacteria adapta su genoma a nivel micro-
evolutivo de acuerdo a su nuevo ambiente (Suerbaum y Josenhans, 2007).
En el presente trabajo, mediante el uso de métodos computacionales y conceptos de
genómica comparativa, se obtuvo información que permite la comparación de los genomas
de H. pylori, las islas de patogenicidad y de secuencias de genes en particular. El análisis
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integral de esta información permitió entender los mecanismos evolutivos mediante los
cuales la especie H. pylori se adapta a un medio tan hostil como el estómago humano. Así
mismo, se realizó un análisis del genoma ancestral a partir del orden génico del presunto
ancestro más antiguo. Finalmente, se realizó una discusión acerca del papel que tiene la
flexibilidad evolutiva del genoma sobre la patogénesis y adaptación de la bacteria a su
hospedero natural, el ser humano.
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2. ANTECEDENTES
2.1. Helicobacter pylori, bacteria patógena del humano
En el año de 1893, en la ciudad de Turín, Italia, el Dr. Bizzorezo observó
espiroquetas Gram-negativas, no identificadas, en muestras histológicas de las células
parietales y de glándulas gástricas de caninos. Actualmente, se le adjudica el
descubrimiento de H. pylori al Dr. Bizzorezo (Marshall, 2001). Sin embargo, hasta inicios
de los años 80 se descubrió la asociación entre las enfermedades gastroduodenales y H.
pylori, resultado del experimento realizado por el Dr. Marshall quien ingirió cultivo líquido
de la bacteria lo cual le produjo una gastritis aguda (Marshall et al., 1985). La descripción
original de la bacteria fue como Campilobacter pyloridis, posteriormente se realizó una re-
descripción a Campilobacter pylori y, finalmente se propuso como H. pylori (Goodwing et
al., 1989).
Actualmente existen dieciocho especies validadas que forman parte del género
Helicobacter (H. hepaticus, H. acinonychis, H. cinaedi H. pametensis, H. muridarum, H.
bizzozeronii, H. felis, H. heilmanni tipo 1, H. heilmanni tipo 2, H. mustelae, H.
nemestrinae, H. salomonis, H. pullorum, H. bilis, H. trogontum, H. canis, H. suncus y H.
pylori) y dos cepas candidato (H. bovis y H. suis) (Solnick y Vandamme, 2001).
2.2. Dinámica de la infección, transmisión y prevalencia de H. pylori
El organismo H. pylori habita en el tracto gastrointestinal del humano, es una
bacteria Gram-negativa, micro-aerofílica, en forma de S, poseé un flagelo polar recubierto
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que le permite su movilidad y es esencial para la colonización bacteriana. Por lo general, es
considerada una bacteria extra-celular.
La infección se adquiere de manera normal a temprana edad, persistiendo durante
toda la vida del paciente a pesar del tratamiento farmacológico. El mecanismo de
transmisión es vía fecal-oral ú oral-oral (Kivi et al., 2003; Björkholm et al., 2004). Con el
uso de modelos matemáticos se ha predicho que el mejoramiento sanitario que se estableció
en los asentamientos humanos hacia la segunda mitad del siglo pasado fue un factor
importante en la disminución de la transmisión de H. pylori de humano-humano.
La prevalencia de H. pylori en las poblaciones humanas difiere en las regiones del
mundo, dependiendo en gran media del estándar de calidad vida de la población en una
determinada región. Por ejemplo, en países en vías de desarrollo, el 80% de la población
puede estar infectada con la bacteria; por otro lado, en países industrializados, la
prevalencia varía en un rango de entre 20 y 50 %.
2.3. Fisiopatología de H. pylori y enfermedades asociadas
La infección por H. pylori se asocia, por lo general, a una gastritis crónica activa,
pero sólo del 10% al 15 % de los individuos infectados manifiesta una úlcera péptica
evidente (Bamford et al., 1998). El resultado final, concreto, de la infección por H. pylori
está determinado por una compleja interrelación entre el hospedador y la bacteria.
Factores de la bacteria: H. pylori es capaz de establecerse en el sistema gástrico ya
que poseé la enzima ureasa, permitiéndole sobrevivir en un ambiente de pH ácido. La
enzima ureasa genera amonio (NH3) e induce lesiones en las células gástricas. La bacteria
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también genera los factores quimiotácticos para los neutrófilos y monocitos que
contribuyen a la lesión celular. H. pylori produce proteasas y fosfolipasas que rompen el
complejo lípido-glucoproteico del gel mucoso, que es la primera línea de defensa del
estómago (Atherton y Blaser, 2004).
Factores del hospedador: la respuesta inflamatoria que ocasiona H. pylori incluye
reclutamiento de neutrófilos, linfocitos (T y B), macrófagos y plasmocitos. El patógeno
origina daño local al unirse a las moléculas del complejo mayor de histo-compatibilidad
clase II, expresadas en las células del epitelio gástrico ocasionando su apoptosis. Además,
las bacterias que expresan el gen virulento cagA introducen la proteína al interior de las
células ocasionando lesiones más graves al activar las vías celulares que producen citocinas
(IL6) (Atherton y Blaser, 2004).
El tipo y distribución de las gastritis se relaciona con el cuadro patológico gástrico.
La presencia de gastritis predominantemente antral se vincula con la formación de úlcera
duodenal; y la gastritis que afecta predominantemente al cuerpo del estómago y predispone
a úlcera gástrica, atrofia a las células gástricas y, finalmente, lleva a la producción de un
carcinoma gástrico (Chen et al., 1994; Atherton y Blaser, 2004).
2.4. Genes de virulencia asociados a la patogénesis de H. pylori
Los genes asociados a virulencia se refieren a los productos génicos que le permite a
un microorganismo establecerse dentro del huésped de una especie determinada
aumentando su potencial patogénico. Los factores de virulencia son: las toxinas
bacterianas, las proteínas y los hidratos de carbono de la superficie celular bacteriana que
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protegen a la bacteria y las enzimas hidrolíticas que pueden contribuir a la patogénesis de la
bacteria. H. pylori, contiene 127 genes asociados a patogénesis (http://mvirdb.llnl.gov/),
pero dos genes son los más relevantes (cagA y vacA) por su importancia en los procesos
patológicos relacionados a H. pylori (Yamazaki et al., 2005).
Isla de patogenicidad: La isla de patogenicidad cag PAI es una región altamente
plástica del genoma de H. pylori y juega un papel importante en la patogénesis de la
bacteria (Censini et al., 1996). Esta región tiene una longitud de 35 a 40 kb la cual contiene
de 27 a 33 genes (Azuma et al., 2004). La mayoría de los genes que contiene esta isla están
involucrados en el ensamblaje del sistema de secreción tipo IV que transportan a la proteína
CagA dentro de las células gástricas epiteliales e induce la producción de interleucina 8,
producida también por las células gástricas epiteliales. Sin embargo, los cambios inducidos
por estas proteínas durante la colonización y la manera en que éstos afectan el desarrollo de
las enfermedades gástricas aún no están bien determinados (Suerbaum y Josenhans, 2007).
Gen cagA. El gen cagA es uno de los genes más estudiados a detalle en cuanto a su
variación alélica y sus implicaciones funcionales, este se encuentra formando parte de la
isla de patogenicidad. Estudios epidemiológicos han mostrado que la colonización del
estómago con cepas positivas al gen cagA se asocian con el incremento del riesgo para el
desarrollo de úlcera péptica y cáncer gástrico (Hatakeyama, 2003).
El gen cagA es el encargado de codificar la proteína CagA, responsable principal de
las patologías asociadas a H. pylori. La proteína CagA contiene los motivos de
fosforilación de tirosina (EPIYA), que son fosforilados por tirosinas cinasas dentro de la
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célula gástrica, iniciando los eventos que llevan al daño del tejido gástrico (Mimuro et al.,
2002)
Gen vacA: La mayoría de las cepas de H. pylori producen la citotoxina vacuolizante
VacA, la cual exhibe múltiples efectos en las células epiteliales e inhibe la proliferación de
las células T. El gen vacA muestra una alta variación alélica. Las cepas de H. pylori llevan
múltiples alelos recombinantes con diferente actividad tóxica y, por lo tanto, tienen afinidad
variable por los receptores celulares gástricos (Pagliaccia et al., 1998).
Las variaciones alélicas del gen vacA son conocidas como región señal 1(s1), región
señal 2 (s2), región media 1(m1) y región media (m2). Estas regiones se dividen en
subtipos solo en el caso de las regiones s1 y m1. Para la región s1 existen los subtipos s1a,
s1b, y s1c; para la región m1 los subtipos m1a y m1b (Ito et al., 1997). La presencia de
estas regiones se relaciona con la producción de la citotoxina vacA. En general los tipos
s1/m1 y s1/m2 se relacionan con alta y moderada producción de citotoxina, mientras que el
tipo s2/m2 se relaciona con baja producción de citotoxina (Atherton et al., 1995).
2.5. Genomas secuenciados de H. pylori
Actualmente existen siete genomas secuenciados de H. pylori pertenecientes a
diferentes cepas (Entrez Genome, Enero 2010) (cuadro 1). La primera secuenciación del
genoma completo de H. pylori fue llevada a cabo por el Instituto para la Investigación
Genómica (The Institute for Genomic Research TIGR) en el año de 1997, utilizando la cepa
26695, la cual fue originalmente aislada de pacientes que padecían gastritis (Tomb et al.,
1997). Posteriormente, la cepa J99 aislada de un paciente con úlcera duodenal fue
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secuenciada en 1999 por la compañía farmacéutica AstraZeneca (Alm et al., 1999). La cepa
HPAG1 fue aislada de un paciente con gastritis atrófica crónica (Oh et al., 2006). La cepa
Shi470, proviene de un aislado del antro gástrico de un paciente de raza amerindia del Perú
(Kesulyte et al., 2009). La cepa P12, proviene de un paciente con úlcera duodenal. La cepa
G27, fue aislada de un paciente en Tocascana, Italia (Baltrus et al., 2009). Finalmente, la
cepa B38 originaria de Francia aislada de un paciente con MALT (linfoma del tejido
linfoide asociado a mucosas) (aun no publicado). El cromosoma principal de las diferentes
cepas es variable en tamaño y todos los genomas tienen un promedio de 39 % en el
contenido de GC.
Cuadro 1. Genomas de H. pylori completamente secuenciados, utilizados para el análisis
de los arreglos genómicos.
Organismo Síntoma clínico de la
enfermedad Origen No. de acceso
H. p. 26695 Gastritis Reino Unido NC_000915 H. p. J99 Ulcera duodenal E.U.A NC_000921 H. p. HPAG1 Gastritis Atrófica Suiza NC_008086 H. p. P12 Aislado clínico Alemania NC_011498 H. p. G27 Investigación Italia NC_011333 H. p. Shi470 Aislado clínico Perú NC_010698 H. p. B38 MALT Francia NC_012973
2.6. Comparación genómica de H. pylori
Los cambios en un consorcio de genes de una población a través del tiempo, lo cual
resulta en pequeñas variaciones genómicas del organismo de una misma especie, se ha
denominado micro-evolución. Se ha propuesto que la micro-evolución de la bacteria H.
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pylori dentro de cada hospedero individual contribuye al mantenimiento de la interacción
patógeno-hospedero promoviendo su persistencia (Suerbaum y Josenhans, 2007).
La co-evolución de H. pylori y su hospedero humano ha progresado durante
aproximadamente 10,000 años. Estudios poblacionales revelaron una relación entre cepas
amerindias y este-asiáticas. Estas poblaciones humanas tiene una separación evolutiva
estimada en 11,000 años (Ghose et al., 2002, Yamaoka et al., 2002, Falush et al., 2003).
La comparación de los primeros genomas secuenciados (26695 y J99) permitió
observar la diversidad genómica existente en cepas de la misma especie y, por ende, la
evolución de las mismas. La comparación de los dos genomas completamente secuenciados
indica una diferencia en tamaño del genoma y en cantidad de marcos de lectura abiertos
(ORFs). Para la cepa 26695, la talla es de 1.67 Mb con 1,590 ORFs, mientras que para la
cepa J99 la talla es de 1.64 Mb y 1,496 ORFs (Alm et al., 1999; Kang y Blaser 2006). Un
total de 10 inversiones y transposiciones, que van de 1 a 83 kb de longitud, son necesarias
para el alineamiento de los genomas de estas cepas. Los genes ortólogos que comparten
estas dos cepas únicamente, son 92.6 % idénticos a nivel de nucleótido, y sólo dos de 1,406
genes compartidos tiene secuencias idénticas. Aproximadamente, el 7 % de las regiones
codificantes de la cepa 26695 están ausentes en la cepa J99. La mayoría de las regiones
codificantes en los genomas estudiados son H. pylori específicas, sin homólogos
identificables (Alm et al., 1999; Kang y Blaser 2006).
El genoma de H. pylori 26695 contiene numerosas secuencias repetitivas de ADN,
que van desde simples repeticiones homo-poliméricas o regiones de di-nucleótidos
repetidos, a largas regiones de nucleótidos idénticos apartados por cientos de bases. Estas
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secuencias repetitivas de diferentes longitudes permiten las “deleciones” o rearreglos intra-
genómicos. Dichos elementos tienen una distribución no aleatoria dentro del genoma, lo
que implica una fuerte presión de selección por parte de H. pylori (Aras et al., 2003; Kang
y Blaser 2006; Suerbaum y Josenhans, 2007).
Las secuencias de inserción (IS) son elementos genéticos móviles cortos de ADN
que promueven rearreglos genéticos dentro de un genoma. Múltiples copias de secuencias
de inserción aparentemente específicas de H. pylori se encuentran distribuidas dentro de un
genoma en particular (Azuma et al., 2004; Kang y Blaser 2006). La cepas de H. pylori
también difieren en el contenido de plásmidos (Hofreuter et al., 2002; Hofler et al., 2004;
Kang y Blaser, 2006).
2.7. Diversidad y evolución genómica en H. pylori
Los procesos de adaptación que toman lugar en el contexto del ambiente del
hospedero son responsables de la diversificación bacteriana. La bacteria H. pylori tiene la
capacidad de adaptarse y persistir en el estómago humano, donde es el organismo
predominante. Este hecho llevó a la hipótesis de que H. pylori tiene una alta diversidad
genómica, la cual fue evidenciada por técnicas moleculares, tales como RAPD, MLST y
PFGE (Suerbaum y Josenhans, 2007).
Existen varias formas mediante las cuales se produce la diversidad genómica, pero
la recombinación homóloga es el paso esencial para la evolución microbiana, siendo la
plasticidad genómica lo que permite definir la presión de selección. Las presiones de
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selección operan en un microorganismo que ostenta capacidades específicas para la
diversificación por procesos de mutación y recombinación (Suerbaum y Josenhans, 2007).
La especie H. pylori tiene una alta tasa de recombinación genética, lo que le permite
un elevado nivel de intercambio genético (Suerbaum et al., 1998). El intercambio genético
es posible debido a sistemas especializados (Secreción reversa tipo IV) que existen para la
toma de ADN extracelular, la cual facilita la competencia de la bacteria, siendo ésta última
dependiente de la fase de crecimiento (Baltrus y Guillemin, 2006).
Además de la recombinación genética, H. pylori también tiene una elevada tasa de
mutaciones. Los análisis del genoma revelan que H. pylori carece de genes homólogos que
contribuyen en la reparación del ADN (mutS1/mutL/mutH) y varias enzimas involucradas
en la escisión y reparación de bases (Kang y Blaser, 2006; Suerbaum y Josenhans, 2007).
Los sistemas de restricción-modificación típicamente se componen de dos enzimas:
una endonucleasa de restricción, que rompe secuencias de ADN específicas y una
metiltransferasa, la cual protege al ADN hospedero de roturas en el mismo. Las diferentes
cepas de H. pylori tienen múltiples sistemas de restricción-modificación que protegen al
genoma hospedero de invasión de ADN extraño, más comúnmente bacteriófagos; estos
sistemas contribuyen a la diversidad de la bacteria.
2.8. Los mecanismos de recombinación dirigen la micro-evolución de los genomas
El análisis de los genomas de diferentes organismos ha permitido investigar si
algunas regiones del genoma bacteriano han sido importadas de diferentes fuentes durante
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su evolución a través de mecanismos de transferencia horizontal, es decir un factor de
recombinación. La mayoría de los genes bacterianos involucrados en la simbiosis están
localizados en compartimentos genómicos específicos, tales como replicones
independientes (plásmidos) o islas en el cromosoma (Flores et al., 2005). La identificación
de eventos de recombinación natural de cepas bacterianas es importante para el
entendimiento de su evolución.
La recombinación es el proceso donde dos moléculas separadas de ADN o ARN
intercambian regiones de sus secuencias. El intercambio, ocurre a menudo en regiones
homólogas de los genomas y ocurren en cadenas únicas o dobles de las moléculas de ADN
o ARN. Así, la recombinación es el mecanismo principal que dirige los cambios evolutivos
(Etherington et al., 2004). A través de la comparación de secuencias de ADN, de especies
estrechamente emparentadas, se pueden detectar eventos de recombinación. La
comparación de secuencias de ADN de especies muy emparentadas se ha referido como
genómica micro-evolutiva (Jordan et al., 2002). Existen cinco métodos reconocidos para
detectar la recombinación en las secuencias de ADN: 1) los métodos de similitud que se
basan en la tendencia que tienen los nucleótidos a ser más compartidos que otros sitios, 2)
los métodos que estiman las distancias genéticas entre secuencias, 3) los métodos
filogenéticos que identifican incongruencias en las topologías de los árboles creados a partir
de diferentes partes de las secuencia o del genoma, 4) los métodos de compatibilidad que
prueban la incongruencia filogenética y que no requiere de filogenia de secuencias
conocidas y 5) el método de distribución de sustituciones que examina las secuencias
buscando un agrupamiento significante de sustituciones (Posada et al., 2002).
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Sin embargo, la detección de la recombinación dentro de las secuencias tiene varios
pre-requisitos. En particular: 1) la región recombinante debe ser lo suficientemente larga
para permitir análisis filogenéticos relevantes; 2) la región debe ser lo bastante divergente
con el pariente más y menos cercano para permitir identificación inequívoca y, 3) el patrón
de recombinación debe mantenerse durante recombinaciones evolutivas posteriores (Tolou
et al., 2001).
Un estudio reciente en donde se comparan fragmentos largos de las secuencias
genómicas en diferentes replicones de la bacteria Sinorhizobium spp. demostró que la
recombinación de ADN entre cepas muy relacionadas es el mayor evento en la micro-
evolución de su genoma (Guo et al., 2007).
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3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La comparación de genomas intra-especie permite identificar las características
micro-evolutivas. Para genomas simbióticos, la recombinación de ADN intra-especies es el
mayor evento en micro-evolución. La bacteria H. pylori es un patógeno particular del
humano con un genoma reducido. Los estudios realizados en esta bacteria han mostrado
que tienen una tasa de recombinación y de mutaciones puntuales muy elevadas. Sin
embargo, aún subyacen las siguientes interrogantes: ¿los genes de virulencia y genes de
mantenimiento tienen las mismas características evolutivas? ¿Qué contribuye en mayor
medida a la evolución de H. pylori, la recombinación o las mutaciones puntuales? para
responder a estas cuestiones es necesario indagar a profundidad.
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
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4. JUSTIFICACIÓN
La bacteria H. pylori es un habitante natural del estómago humano. La capacidad de
sobrevivir en el ambiente hostil del estómago y persistir en él, puede ser explicada
mediante el estudio de los mecanismos de micro-evolución del genoma de la bacteria.
Existen estudios anteriores que comparan tres genomas de H. pylori. Sin embargo,
actualmente, están disponibles nuevas secuencias de genes de la bacteria y genomas de
variantes en la base de datos pública del Centro Nacional para la Información
Biotecnológica (NCBI). Este proyecto de tesis esta basado en conceptos de genómica
comparativa y tiene como objetivo realizar análisis de los genomas para entender el papel
de los mecanismos micro-evolutivos en la adaptación y patogénesis de la bacteria H. pylori.
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5. HIPÓTESIS
La adaptación de H. pylori a un hábitat en particular está asociado a la micro-evolución de
su genoma.
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6. OBJETIVOS
6.1. Objetivo general
Analizar los genomas de diferentes cepas de H. pylori e inferir sus mecanismos de micro-
evolución adaptativa
6.2. Objetivos específicos
1.- Comparar la organización génica de los genomas de H. pylori.
2.- Comparar la estructura genómica de las islas de patogenicidad de cepas de H. pylori.
3.- Analizar los patrones de recombinación intra-especie en genes asociados a patogénesis y
genes de mantenimiento de H. pylori.
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
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7. MATERIALES Y MÉTODOS
7.1. Características generales de las secuencias genómicas analizadas
La información acerca de las características generales de los siete genomas
analizados (cuadro 1) fue obtenida de la pagina electrónica http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI), excepto por el número de
pseudogenes que fue corroborado manualmente.
7.2. Comparación de la estructura genómica de H. pylori
Los genomas Hp26695, HpJ99, HpHPAG1, HpG27, HpP12, HpShi470, HpB38
(Cuadro 1) fueron obtenidos de la página electrónica http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ del
NCBI. Para analizar estas secuencias, se utilizó el algoritmo progresivo del software
MAUVE 2.3.1 (Darling et al., 2004). Este método utiliza alineamientos por pares o
múltiples de secuencias genómicas conservadas de genomas completos con requerimientos
computacionales mínimos sin afectar la calidad del alineamiento. Los alineamientos locales
se llevaron a cabo con el objeto de identificar uniones múltiples máximas (multi-MUMs),
los cuales se utilizaron a continuación para construir un árbol filogenético guía.
Posteriormente, una parte de los multi-MUMs se usaron como anclas, los cuales a su vez se
dividieron en bloques colineales locales (LCB). Entonces, cada LCB formó una región
homologa de ADN de multi-MUMs que carece de rearreglos en la secuencia y la cual es
compartida por dos o más genomas. El alineamiento de los siete genomas fue construido
usando los parámetros estándar en MAUVE. El mismo método se utilizó para analizar la
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
19
estructura genómica de las islas de patogénesis de H. pylori. Los orígenes de replicación se
identificaron con la herramienta en línea Ori-Finder (buscador de orígenes de replicación)
(http://tubic.tju.edu.cn/Ori-Finder/).
7.3. Genoma núcleo (“Core genome”)
El algoritmo MAUVE tiene la habilidad de identificar los ortólogos posicionales
mediante alineamientos múltiples de las secuencias codificantes contenidas en los genomas
y exportar una lista con las características anotadas. Los parámetros utilizados fueron los
sugeridos en MAUVE consistentes en: porcentaje de identidad 60-100 % y una cobertura
de 70-100 %. El número de secuencias codificantes ortólogas compartidas por los
diferentes genomas de H. pylori incluyendo los genomas de H. hepaticus y H. acinonychis
fue extraído manualmente de la lista generada por MAUVE.
7.4. Análisis de las secuencias repetidas
El programa MUMer 3.0 (Delcher et al., 1999) se utilizó para identificar las
secuencias repetidas exactas de ADN dentro de los genomas de H. pylori. Este método
también incluye regiones paralogas duplicadas. Se empleó el corte mínimo permitido por
MUMer de 20 nucleótidos de longitud que perfectamente se unen dentro de la secuencia de
ADN del genoma en estudio. La salida originada por MUMmer indica las coordenadas de
cada par de secuencias idénticas y su longitud exacta. Del conjunto de programas EMBOSS
se utilizó el programa Etándem (Rice et al., 2000). Dicho programa fue aplicado para
analizar la distribución de las repeticiones en tándem, que al igual que MUMer indica las
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
20
coordenadas de cada repetición pero difiere de él al tomar porcentajes de identidad más
bajos que los exactos. Sólo se tomaron en cuenta repeticiones en tándem con 80 % de
identidad.
7.5. Análisis evolutivos basados en los genomas completos
Se utilizó el software MAUVE para crear una matriz de permutación que indica el
orden y orientación de los bloques de cada genoma por medio de integrales. A
continuación, esta matriz fue analizada en un computador local con el programa MGR
(Multiple Genome Rearregment) (Bourque y Pevzner, 2002). El algoritmo MGR crea un
árbol filogenómico que describe el escenario de rearreglos más plausible para múltiples
especies e infiere el posible orden de los potenciales ancestros más antiguos.
7.6. Análisis de la recombinación intra-especies
Para caracterizar la naturaleza de las secuencias codificantes de H. pylori se
utilizaron las secuencias completas de diez genes de mantenimiento (dnaA, dnaJ, dnaK,
ftsA, ftsH, ftsZ, glnA, groEL, recN, rpoD), de diez genes de virulencia de la isla de
patogenicidad (cag3, cag5, cag7, cag8, cag9, cag14, cag19, cag23, cag25, cagA,) y el gen
vacA, para analizar los eventos de recombinación intra-especie.
Las secuencias nucleotídicas de dichos genes, fueron alineadas con el programa
MUSCLE 3.0 (Edgar, 2004) utilizando parámetros estándar. En seguida, utilizando los
alineamientos generados con MUSCLE 3.0, se procedió a realizar un análisis sistemático
buscando la presencia de patrones de recombinación usando los programas RDP
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
21
(Recombination Detection Program) (Martin y Rybicki, 2000) y RAT (Recombination
Analysis Tool) (Etherington et al., 2004).
En el caso de los genes cagA y vacA, donde existe una gran cantidad secuencias
codificantes (96 y 93, respectivamente) (Apéndice 4), disponibles en las bases de datos
públicas, se realizó un multi-alinemiento del número total de secuencias y se extrajeron
previa inspección, las secuencias más divergentes para analizar los patrones de
recombinación. Así mismo, en el presente trabajo, el número total de secuencias de los
genes vacA y cagA fueron analizadas con el programa RAT que permite un análisis masivo
y rápido de secuencias mostrando de manera gráfica las zonas recombinantes. El programa
RAT calcula las distancias genéticas basándose en el índice de fijación. El índice de
fijación varía entre 0 y 1. El valor 0 indica que las secuencias son genéticamente idénticas,
mientras que los valores 1 indican diferencias genéticas en la secuencia. Una vez que el
programa realiza estos cálculos, proporciona una salida gráfica que indica las distancias
genéticas y las regiones recombinantes mediante entrecruzamientos de líneas, indicando la
posición del evento en el alineamiento de secuencias.
7.7. Análisis filogenético de los genes cagA y vacA
Las secuencias completas de los genes cagA y vacA fueron obtenidas en formato
FASTA del sitio electrónico NCBI. Posteriormente, se realizó el alineamiento múltiple con
el programa MUSCLE 3.0. A partir del alineamiento, se construyó el árbol filogenético
utilizando la interfaz gráfica de SEAVIEW&PHYLO_WIN (Galtier et al., 1996) con el
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
22
análisis Neighbor-Joining, bajo los parámetros de distancia de Jukes-Cantor y Bootstrap
con 10,000 repeticiones.
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
23
8. RESULTADOS
8.1. Características generales de las secuencias genómicas analizadas
La talla genómica de los diferentes genomas de H. pylori es relativamente variable.
Esta varía desde 1,576,578 nt a 1,673,813 nt (Cuadro 2) con una diferencia de 97.2 kb entre
el genoma de mayor tamaño que corresponde a H. pylori P12 y el genoma de menor
tamaño de H. pylori B38. El contenido génico por genoma es igualmente variable
(encontrándose en un rango de 1,535-1,648 genes) con una diferencia de 113 genes entre el
genoma de mayor contenido génico H. pylori Shi470 y el de menor contenido H. pylori
J99. Sin embargo, el número de proteínas que codifican los genes por genoma dentro de las
diferentes cepas de H. pylori es más variable que el contenido génico, encontrándose un
rango de 1382-1576, una diferencia de 194 proteínas codificantes entre el genoma que más
codifica (H. pylori 26695) y el que menos codifica (H. pylori B38). El contenido de G+C es
de un promedio de 38.4 % para los siete genomas; el porcentaje de codificación oscila en
un promedio de 88.4 % para todos los genomas. El contenido de RNAs es similar en todos
los genomas. La cepa H. pylori B38 presenta un mayor número de genes inactivos con 144
pseudogenes, lo que refleja la diferencia más grande entre proteínas codificantes y no
codificantes. Después de H. pylori B38 continúa la cepa H. pylori Shi470 con 37
pseudogenes, seguido por H. pylori G27 con 34 pseudogenes, luego H. pylori P12 con 14
pseudogenes, y finalmente, H. pylori 26695 y H. pylori J99 con 10 y 4 pseudogenes,
respectivamente. La cepa de H. pylori HPAG1 es la única que mantiene intactas la totalidad
de sus secuencias.
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
24
Cuadro 2. Características generales de los genomas completamente secuenciados de la
especie H. pylori
Genomas de
H. pylori Talla
genómica % de GC
% de codificacion
No. de genes
No. de proteínas
codificantes
RNAs. No. de Pseudogenes
26695 1,667,867
nt 38 90 1627 1573 43 10
J99 1,643,831 nt
39 90 1535 1489 42 4
HPAG1 1,596,366 nt
39 91 1578 1536 42
P12 1,673,813 nt
38 89 1624 1568 42 14
G27 1,652,982 nt
38 86 1570 1493 43 34
Shi470 1,608,548 nt
38 88 1648 1569 42 37
B38 1,576,758 nt
39 85 1571 1382 45 144
8.2. Comparación de la organización génica de H. pylori
Para analizar los rearreglos que sufre el genoma de H. pylori se realizó un
alineamiento global de secuencias de ADN concatenadas de los siete genomas de H. pylori,
utilizando el software MAUVE versión 2.3.1.
La comparación de los diferentes genomas con el software MAUVE permitió
identificar y alinear 35 bloques colineales locales (LCB) que comparten los siete genomas
de H. pylori, donde aproximadamente, el 90 % del genoma está contenido en los bloques y
el resto pertenece a regiones de linaje especificas, localizadas entre los huecos que separan
los bloques colineales. Utilizando la secuencia de H. pylori 26695 como referencia en el
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
25
alineamiento múltiple, MAUVE computó el orden y orientación de los segmentos
homólogos en cada genoma.
Cada uno de los siete genomas secuenciados poseé su propia estructura genómica
(Figura 1). En comparación con H. pylori 26695, cada uno de los taxones en estudio
presenta un orden génico variable. No obstante, los genomas con sintenia relativamente
similar se presentan en las cepas HpJ99, HpHPAG1, HpG27, Hp P12, excepto por la
inversión de 87 kb en Hp HPAG1 que se ubica en las coordenadas 1432271-1519807. Esta
porción se extiende desde la secuencia codificante HPAG1_1383 (timidilato sintetaza,
thyX) a la proteína hipotética HPAG1_1461.
Otro rearreglo destacable, observado únicamente en H. pylori 26695 en
comparación con el resto de los genomas, es la inversión y translocación de dos segmentos
de 81 kb en las coordenadas 367133, 448585 y de 84 kb que se extiende desde la posición
1072258 a la posición 1156222. Este arreglo parece ser exclusivo de este genoma. Los
segmentos mencionados se extienden desde el gen HP0357 (alcohol deshidrogenasa) al gen
HPrrnA5S (5s ribosomal RNA) en el caso del segmento inicial y del gen tRNA-Pro-1
(HPt26) a una proteína hipotética (HP1093). Un dato a mencionar de estos rearreglos es su
relación con la llamada zona de plasticidad de H. pylori.
En contraste, los genomas de los taxones Shi470 y B38 presentan la estructura
genómica más diferente en comparación con el resto de los genomas y es más parecida
entre ellos. La característica distintiva de estos dos genomas es la inversión y translocación
de un gran segmento de sus secuencias abarcando un total de 407 kb (466552, 873914) en
Hp Shi470 y 390 kb (470089, 851109) en Hp B38. Estos segmentos comprenden desde la
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
26
proteína hipotética de los canales de potasio (HP0490) hasta la proteína hipotética
(HP0879).
A parte de estos rearreglos, también se observaron inversiones alrededor del origen
de replicación, por lo que los diferentes genomas de H. pylori analizados preservan esta
característica evolutiva común en la mayoría de las bacterias procariotas (Eisen et al.,
2000).
Figura 1. Alineamiento de siete genomas de cepas de H. pylori. El alineamiento de genomas completos
usando MAUVE indica 35 bloques colineales conservados en los siete taxones. Cada cromosoma ha sido
colocado horizontalmente y los bloques homólogos en cada genoma se muestran como regiones con colores
idénticos. Las regiones que están invertidas con respecto a Hp J99 están colocadas debajo de la línea central,
y los principales rearreglos están unidos por líneas negras, indicando el orden invertido con respecto al otro,
que advierten tres principales estructuras. El origen de replicación y los genes limitantes en los rearreglos
están marcados por líneas verticales negras.
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
27
8.3. Zonas de plasticidad
En el análisis de comparación de genomas, MAUVE identificó las zonas de
plasticidad como linaje-específicas y estas zonas están localizadas entre los huecos que
separan los bloques y en áreas de poca similitud (zonas blancas dentro de los bloques)
(figura 1). Estas áreas, por lo tanto, representan secuencias particulares del genoma.
La zona de plasticidad en H. pylori 26695 está identificada en el alineamiento como
secuencia linaje-específico encontrándose dividida en dos partes. Dicha zona está asociada
a dos inversiones que presenta la secuencia, tal como se reportó en el primero de los
estudios sobre comparación de genomas (Kersulyte et al., 2009). La zona está ubicada entre
el gen ftsZ (HP0979) y los genes ribosomales 5 s y 20 s.
El genoma de la cepa P12 es el único que presenta una duplicación de dos zonas de
plasticidad, dispersas en el genoma. Esta zona está limitada por un pseudo-gen implicado
en los sistemas de restricción-modificación (HPP12_0436), abarcando las siguientes
coordenadas 450800, 451990 y por una proteína hipotética (HPP12_0474) ubicada en las
posiciones 494743, 496638. La siguiente ubicación de 1391788, 1394775 se encuentra
limitada por un pseudo-gen (HPP12_1319), involucrado en los sistemas de restricción-
modificación y por el gen nadC (HPP12_1354) en las coordenadas 1425436,1426257. La
inserción de las zonas de plasticidad en este genoma condujo a la inactivación de las
secuencias codificantes al caer en un marco abierto de lectura. Un dato interesante, es la
ausencia de la zona plástica en los genomas de HPAG1 y B38, ambos relacionados con
procesos neoplásicos y alteraciones fisiopatológicas similares.
La isla de patogenicidad es considerada también como una zona plástica. En el
multi-alinemiento de los genomas, las islas presentan coordenadas similares en los genomas
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
28
de 26695, J99, HPAG1, P12, G27, excepto en Hp Shi470, que cambia a una posición río
abajo debido a la gran inversión que sufre el genoma. Al igual que la carencia de la zona de
plasticidad la isla esta ausente en B38.
8.4. Estructura de las islas de Patogenicidad
Siguiendo el método de comparación de genomas, se analizó la estructura de las
islas de patogenicidad incorporando secuencias de islas completas pertenecientes a cepas
originarias de varias partes del mundo (Apéndice 1). La comparación de dichas estructuras
indica un orden génico altamente conservado (Figura 2).
Entre los hallazgos de este análisis, destaca la inversión única del gen cagQ14
(HP0535) en OK112, F32, F80, 2017,2018, 3K, 26695, J99, HPAG1, G27 y P12. La cepa
italiana G27 presenta tres copias de las características IS605 lo que divide la isla en dos
secciones, por lo que presenta una estructura que es similar a las cepas suizas Du23, Du52,
Ca52 y Ca73 y la cepa australiana NCTC 11638. Estos elementos están localizados entre
los genes HPG27_492 (cagS) y HPG27_493 (cag Q). Las secuencias de inserción (IS) no
afectan la funcionalidad de los genes relacionados. Hp Shi470 es la única cepa que presenta
una duplicación del gen cagA y la adquisición de cinco nuevos genes hipotéticos
(HPSH_04250, HPSH_04245, HPSH_04235, HPSH _4230 y HPSH_04220).
El gen cag7 es el menos conservado de todos los genes pertenecientes a la isla
debido a inserciones y “deleciones” originadas por la presencia de numerosas secuencias
repetidas. Esta conformación ha llevado a la inactivación de este gen como en el caso de las
cepas G27, 908, 2017 y 2018. En la inspección realizada con el visor de MAUVE se
Micro
observó que mayoría de las cepas estudiadas carece del gen Cag2 o si está presente se
encuentra inactivo.
Figura 2. Alineamiento de las islas de patogenicidad de
usando MAUVE indica 3 bloques colinea
horizontalmente y los bloques homólogos en cada secuencia genómica se muestran como regiones con
colores idénticos. Las regiones coloreadas que están invertidas con respecto a la secuencia de refe
aparecen debajo de la línea central. Los recuadros debajo de los bloques son los genes que conforman la isla y
se interpretan de igual manera que los bloques. Los principales rearreglos están unidos por líneas negras
indicando el orden invertido con
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
mayoría de las cepas estudiadas carece del gen Cag2 o si está presente se
. Alineamiento de las islas de patogenicidad de H. pylori. El alineamiento
indica 3 bloques colineales conservados en los taxones. Cada secuencia ha sido colocada
horizontalmente y los bloques homólogos en cada secuencia genómica se muestran como regiones con
colores idénticos. Las regiones coloreadas que están invertidas con respecto a la secuencia de refe
debajo de la línea central. Los recuadros debajo de los bloques son los genes que conforman la isla y
se interpretan de igual manera que los bloques. Los principales rearreglos están unidos por líneas negras
indicando el orden invertido con respecto al otro.
29
mayoría de las cepas estudiadas carece del gen Cag2 o si está presente se
. El alineamiento de islas completas
conservados en los taxones. Cada secuencia ha sido colocada
horizontalmente y los bloques homólogos en cada secuencia genómica se muestran como regiones con
colores idénticos. Las regiones coloreadas que están invertidas con respecto a la secuencia de referencia
debajo de la línea central. Los recuadros debajo de los bloques son los genes que conforman la isla y
se interpretan de igual manera que los bloques. Los principales rearreglos están unidos por líneas negras
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
30
8.5. Genoma núcleo (“Core genome”)
El genoma núcleo se refiere a las secuencias codificantes ortólogas totales
compartidas por dos o más genomas. Los siete genomas analizados comparten secuencias
codificantes. El genoma núcleo de la especie H. pylori, basado en los siete genomas, fue
estimado en 1166 secuencias codificantes indicando una alta variabilidad génica. En
contraste, el genoma núcleo del género Helicobacter fue mucho menor y se estimó en 382
secuencias codificantes indicando una mayor variabilidad génica para el genoma núcleo del
género. El genoma de H. acinonychis comparte un mayor número de secuencias homólogas
con H. pylori. Por otro lado, los genomas mencionados comparten menor número con H.
hepaticus. En el caso de H. acinonychis, sólo comparte los genes correspondientes al
genoma núcleo y H. pylori comparte cuatro más con la especie H. hepaticus. Por lo tanto,
solo quedaron 74 secuencias codificantes exclusivas del genoma núcleo de H. pylori que
posiblemente son esenciales para la adaptación al hospedero. Sin embargo, también se tomó
en cuenta una secuencia codificante que comparte con H. hepaticus relacionadas con la
producción de molibdeno.
De las 75 secuencias codificantes (Apéndice 2), 31 secuencias están clasificadas
como proteínas hipotéticas; de las proteínas con función conocida destacan las proteínas de
membrana externa, miembros de la familias Hop que son porinas y adhesinas, genes
involucrados en la formación del co-factor molibdeno de las metalo-enzimas, que
participan en el metabolismo del nitrógeno, sulfuro y sustratos que contienen carbono. Otro
grupo de genes se relaciona con la utilización de hierro y otros metales. Diecinueve de las
secuencias codificantes encontradas mediante la búsqueda de genes exclusivos del genoma
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
31
núcleo de la especie H. pylori se han comprobado que son esenciales para la adaptación al
hospedero.
La mayor parte de las diecinueve secuencias codificantes corresponden a genes
involucrados en la formación del co-factor molibdeno de las metalo-enzimas, este grupo
esta formado por los genes HP0798, HP1341, HP0172, HP0768, HP0798, HP0799,
HP0800, HP0474, y HP0475, grupo al que le siguen cuatro proteínas de membrana externa
HP025, HP0477, HP0252, HP1453, dos proteínas asociadas con la replicación,
recombinación y defensa del organismo HP1371 y HP0050, dos proteínas con funciones
generales HP0211 y HP0357, una proteína de unión a metales rica en Histidina HP1427, y
finalmente dos proteínas hipotéticas HP1028 y HP1502.
Figura 3. Diagrama de Venn representando el genoma núcleo del género Helicobacter.
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
32
8.6. Prevalencia de las secuencias repetidas
Las duplicaciones génicas juegan un papel central en la evolución de nuevas
funciones biológicas y generan biodiversidad. La comparación de las duplicaciones exactas
intra-genómicas se muestran en el cuadro 3. El número de repeticiones por genoma es
ampliamente variable con una diferencia de 765 repeticiones entre el genoma con el mayor
número de repeticiones H. pylori HPAG1 y el de menor número H. pylori B38. Sin
embargo, en cuanto al contenido en pares de bases, el genoma de H. pylori Shi470 revela
70 kb de secuencias repetidas exactas lo que representa un 4.3 % de su genoma siendo el
genoma con mayor número en pares de bases de secuencias repetidas, sólo seguido por el
genoma HpHPAG1. La mayoría de las secuencias de ADN en los siete genomas fueron
menores a 200 kb, como se muestra en el cuadro 3. El genoma de Shi470 presenta más
frecuencia de secuencias repetidas de mayor rango en longitud de tamaño (200- >1000 kb),
lo que refleja un contenido mayor en pb del genoma. HpB38 muestra mayor número de
repeticiones en el rango de 1,000 kb con un total de 12 repeticiones y, por lo tanto, un
número mayor de genes repetidos.
Cuadro 3. Distribución de las repeticiones exactas intra-genómicas en H. pylori
Cepas de H. pylori
No. de duplicaciones y longitud de nucleótidos No. total de
Flagellar and global gene regulation in Helicobacter pylori modulated by changes in
DNA supercoiling International Journal of Medical microbiology 297(2): 65-81.
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
79
13. GLOSARIO
Apoptosis. Es una forma de muerte celular, que está regulada genéticamente.
Bacteria Gram-negativa. Aquellas bacterias que no se tiñen de azul oscuro o violeta por la
tinción de Gram.
Bacteriófago. Virus que infecta a las bacterias y que pueden modificar al genoma
hospedero codificando nuevas funciones o modificando las ya existentes.
Deleción. Tipo especial de anomalía estructural cromosómica que consiste en la pérdida de
un fragmento de ADN de un cromosoma.
Especiación peripátrida. Es una variedad del modelo de especiación alopátrida; aquí la
nueva especie se origina en un hábitat marginal de la población ancestral.
Filogenética. Clasificación científica de las especies basada únicamente en las relaciones
de proximidad evolutiva entre las distintas especies, reconstruyendo la historia de su
diversificación (filogénesis) desde el origen de la vida en la Tierra hasta la actualidad.
Fisiopatología. Estudia los mecanismos de producción de las enfermedades en relación a
los niveles molecular, subcelular, celular, tisular, orgánico y sistémico o funcional.
Genoma: Material genético total contenido en las células de un organismo en particular.
Genómica. Conjunto de ciencias y técnicas dedicadas al estudio integral del
funcionamiento, evolución y origen de un genoma.
Fosfolipasa. Es una enzima que hidroliza los enlaces éster presentes en los fosfolípidos.
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
80
Hipoclorhidria . Alteración fisiopatológica del estómago donde se encuentra disminuida de
la secreción de ácido clorhídrico.
Interleucina-8 (IL-8). Es una citocina de la familia de las quimiocinas, de naturaleza
proinflamatoria. Su síntesis se realiza en fibroblastos, célula endotelial, monocito y
macrófagos.
Linfocito . Es un tipo de leucocito (glóbulo blanco) comprendido dentro de los
agranulocitos.
Microaerofilia: hace referencia a las condiciones de baja y estricta concentración de
oxígeno que requieren determinados organismos para su desarrollo, conocidos como
microaerófilos.
Monocito. Son un tipo de glóbulos blancos agranulocitos.
Monofilético. Grupo monofilético se refiere a si todos los organismos incluidos en él han
evolucionado a partir de un ancestro común.
Neoplasia. Proceso de proliferación anormal de células en un tejido u órgano que
desemboca en la formación de un tumor.
Neutrófilo. Son glóbulos blancos de tipo granulocito.
Ortólogo. Los genes ortólogos son aquellos que divergieron por un evento de especiación.
Panmítico: Perdida de la capacidad clonal en una población de bacterias.
Parálogo. Los genes parálogos son aquellos que surgen por eventos de duplicación.
Patogénesis. Describe el origen y evolución de una enfermedad con todos los factores que
están involucrados en ella.
Plásmido. Moléculas de ADN circulares o lineares que existen en las células como
elementos extra cromosómicos con la capacidad de replicarse por sí mismos.
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
81
Plasmocito. Célula plasmática que pertenece al sistema inmunitario y su papel consiste en
la secreción de grandes cantidades de anticuerpos.
Polimerasa. Enzima que cataliza la síntesis del ADN o ARN.
Proteasas. Son enzimas que rompen los enlaces peptídicos de las proteínas.
Pseudogene. Copia de un gen que carece normalmente de intrones y de otras secuencias de
ADN esenciales para la función.
Secuencia de ADN. Sucesión de letras (A, G, C, T) que representan la estructura primaria
de una molécula real o hipotética de ADN, con la capacidad de transportar información.
Secuencias de Inserción. Segmentos pequeños de ADN de aproximadamente 2.5 kb que
codifican enzimas involucradas en su transposición entre los genomas.
Secuencias en tándem. Secuencia de ADN corta, que se repite consecutivamente, cabeza
con cola en un locus cromosómico específico.
Transcripción: Primer proceso de la expresión génica mediante el cual se transfiere
información contenida en el ADN hacia las secuencia de proteínas utilizando diversos ARN
como intermediarios.
Transferencia Horizontal: Proceso en el que un organismo trasfiere material genético a
otra célula de la cual no desciende.
Transposón: Moléculas de ADN que frecuentemente cambian su localización dentro del
genoma.
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
82
14. APÉNDICE
Apéndice 1. Lista de las cepas de H. pylori utilizadas para la comparación de la estructura genómica.
Cepas Origen No. de Acceso
Hp 2017 India EF195722 Hp 2018 India EF195723 Hp 908 India EF195721 Hp Ca 52 Suiza AY330636 Hp Ca 73 Suiza AY330638 Hp Du 23:2 Suiza AY330644 Hp Du 52:2 Suiza AY330640 Hp F16 Fukui Japón AB120416 Hp F17 Fukui Japón AB120417 Hp F28 Fukui Japón AB120418 Hp F79 Fukui Japón AB120420 Hp F80 Fukui Japón AB120421 Hp Ok107 Okinawa Japón AB120423 Hp Ok109 Okinawa Japón AB120424 Hp Ok112 Okinawa Japón AB120425 Hp Ok129 Okinawa Japón AB120426 Hp 26695 Reino Unido NC_000915 Hp J99 Estados Unidos NC_000921 Hp NTCC11638 Australia AF282852 Hp P12 Alemania NC_011498 Hp HPAG1 Suiza NC_008086 Hp Shi470 Perú NC_010698 Hp G27 Italia NC_011333
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
83
Apéndice 2. Genes obtenidos a partir del genoma nucleó del género Helicobacter,
exclusivos los siete genomas de H. pylori.
(El identificador de locus esta basado en la cepa 26695 y los diecinueve genes identificados
mediante perfil transcripcional en HPAG1 se marcan en amarillo).
64. HP1403 Enzima de restricción tipo I proteina M (hsdM)
65. HP1391 Proteína hipotética
66. HP1341 Sideroporo-mediado por proteínas de transporte de hierro (tonB)
67. HP1502 Proteína hipotética
68. HP1441 peptidil-prolil cis-trans isomerasa B
69. HP1453 Proteína de membrana externa (Hop)
70. HP1427 Polipéptido de unión a metales rico en Histidina
71. HP1562
Transportador de hierro (III) ABC, proteína peri-plasmica de unión al
hierro (ceuE)
72. HP1580 Proteína hipotética
73. HP0125 Proteína 50S ribosomal L35
74. HP0800 Factor convertidor de molibdopterina
75. HP0799 Co-factor de molibdeno en la bio-síntesis de proteína A
Apéndice 3. Genes limitantes de cada uno de los 35 bloques generados por MAUVE.
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
86
Bloq
ue
Genes limitantes de cada uno de los bloques en los diferentes genomas
Hp26695 HpJ99 HpHPA
G1
HpG27 Hp12 HpShi47
0
HpB38
1 HP0001(nu
sB)-
HP0313(na
rK)
Jhp_000
1-
jhp_029
8
HPAG1
_0001-
HPAG_
0317(na
rk)
HpG27_1-
HPG27_29
4
HPP12_
0001-
HPP12_
312
HPSH_0
0005-
HPSH_0
1635
HELPY_
0001-
HELPY_
320
2 HP0318(P.
hemo)-
HP0356
(LepA)
Jhp_030
1-
Jhp_033
0
HPAG1
_0321-
HPAG1
_0351
HPG27_29
9-
HPG27_33
3
HPP12_
0315(he
me
iron)-
HPP12_
0350
HPSH_0
1645-
HPSH_0
1835
HELPY_
0321-
HELPY_
0359
3 HP0357(de
shidrogenas
a)-
HPrrnA5S
Jph_102
3-
jhp_095
HPAG1
_1035-
HPAG1
_r01
HPG27_10
38-
HPG27_rR
NA25s
HPP12_
1062-
HPP12_
r15S
HPSH_0
5635-
HPSH_r0
83545Sr
NA
HELPY_
1066-
HELPY_
5S_2
4 HP0462(hs
ds)-HP0487
(HofD)
Jhp_041
4-
jhp_043
9
HPAG1
_0437-
HPAG1
_0463
HPG27_41
9-
HPG27_44
6
HPP12_
0434-
HPP12_
0494
HPSH_0
2265-
HPSH_0
2405
HELPY_
0444-
HELPY_
0470
5 HP0490(po
tasio
canal)-
HP0610(to
xin outer)
Jhp_044
2jhp_05
56
HPAG1
_0466-
HPAG1
_0590
HPG27_45
0HPG27_5
70
HPP12_
0498-
HPP12_
0618
HPSH_0
4465-
HPSH_0
3815
HELPY_
0864-
HELPY_
0763
6 HP0611- Jhp_029 HPAG1 HPG27_57 HPP12_ HPSH_0
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
87
HP0613(A
BC
transportad
or)
9-
jhp_030
0
_0591-
HPAG1
_0594
1-
HPG27_57
3
0619-
HPP12_
0622
3810
HPSH_0
3805
7 HP0614-
HP0637
Jhp_055
7-
jhp_058
0
HPAG1
_0595-
HPAG1
_0630
HPG27_57
4-
HPG27_59
8
HPP12_
0623-
HPP12_
0649
HPSH_0
3800 –
HPSH_0
3680
HELPY_
0758-
HELPY_
0734
8 HP0638(o
mp13)
Jhp_058
1
HPAG1
_0621
HPG27_59
9
HPP12_
0650
HPSH_0
3300
HELPY_
0733
9 HP0639-
HP0680(rib
onucleotide
-
diphosphata
se)
Jhp_058
2-
jHp_062
1
HPAG1
_0622-
HPAG1
_0662
HPG27_60
0-
HPG27_62
8 -
HPP12_
0651-
HPP12_
0621
HPSH_0
3670-
HPSH_0
3465
HELPY_
0732-
HELPY_
0691
10 HP0683(gl
mU)-
HP0688
Jhp_062
4-
Jhp_062
8
HPAG1
_0667-
HPAG1
_0671
HPG27_64
1-
HPG27_64
45
HPP12_
0696-
HPP12_
0700
HPSH_0
3450-
HPSH_0
3425
HELPY_
0688-
HELPY_
0684
11 HP0690(fa
dA)-
HP0697
Jhp_063
8-
jhp_063
1
HPAG1
_0675-
HPAG1
_0682
HPG27_64
6-
HPG27_65
3
HPP12_
0701-
HPP12_
0708
HPSH_0
3405-
HPSH_0
3365
HELPY_
0683-
HELPY_
0673
12 HP0699-
HP0711
Jhp_063
9-
jhp_065
0
HPAG1
_0684-
HPAG1
_0696
HPG27_65
5-
HPG27_66
8
HPP12_
0709-
HPP12_
0722
HPSH_0
3360-
HPSH_0
3305
HELPY_
0670-
HELPY_
0655
13 HP0714(R
NA pol
sigma-54–
Jhp_06-
jhp_065
8
HPAG1
_0699-
HPAG1
HPG27_67
0-
HPG7_676
HPP12_
0723-
HPP12_
HPSH_0
3295-
HPSH_0
HELPY_
0652-
HELPY_
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
88
HP0721 _0705 0729 3265 0646
14 HP0723(L-
asparaginas
a)-
HP0724(dc
uA)
Jhp_066
1-
jhp_066
0
HPAG1
_0708-
HPAG1
_0707
(dcuA)
HPG27_67
9-
HPG27_67
8
HPP12_
0731-
HPP12_
0732
HPSH_0
3250 -
HPSH_0
3245
HELPY_
0644-
HELPY_
0643
15 HP0726(p
mo)-
HP0879
Jhp_066
3-
jhp_081
2
HPAG1
_0710-
HPAG1
_0861
HPG27_68
1-
HPG27_83
2
HPP12_
0734-
HPP12_
0878
HPSH_0
3230 –
HPSH_0
2420
HELPY_
0641 –
HELPY_
0474
16 HP0883(ru
vA)-
HP0979(fts
Z)
Jhp_081
5-
jhp_091
3
HPAG1
_0863-
HPAG1
_0960
HPG27_83
6-
HPG27_92
6
HPP12_
0880-
HPP12_
0975
HPSH_0
4655-
HPSH_0
5170
HELPY_
0868-
HELPY_
0967
17 HP0983 Jhp_091
5
HPAG1
_0963
HPG27_93
3
HPP12_
0979
HPSH_0
5200
HELPY_
0976
18 HPt26(tRN
A-Pro-
1,ppK)-
HP1093(hi
po,flgG
Jhp_041
3-
Jhp_033
2
HPAG1
_t012-
HPAG1
_0354
HPG27_tR
NA2-
HPG27_33
6
HPP12_t
12-
HPP12_
0352
HPSH_t0
8304-
HPSH_0
1850
HELPY_
tRNA27-
HELPY_
0361
19 HP1098(P.
rica en
citeina)-
HP1276
Jhp_102
4-
jhp_119
7
HPAG1
_1036-
HPAG1
_1220
HPG27_10
39-
HPG27_12
21
HPP12_
1063-
HPP12_
1242
HPSH_0
5640-
HPSH_0
6610
HELPY_
1067 -
HELPY_
1253
20 HP1277(trp
A)-HP1286
Jhp_119
8-
jhp_120
6
HPAG1
_1235-
HPAG1
_1227
HPG27_12
223-
HPG27_12
38
HPP12_
1243-
HPP12_
1252
HPSH_0
6615-
HPSH_0
6655
HELPY_
1254 -
HELPY_
1262
21 HP1287(ten
A)
Jhp_120
7
HPAG1
_1226
HPG27_12
39
HPP12_
1253
HPSH_0
6655
HELPY_
1263
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
89
22 HP1289 Jhp_120
9
HPAG1
_0663
HPG27_63
9
HPP12_
1255
HPSH_0
3460
HELPY_
1265
23 HP1290(pn
uC)-
HP1291
Jhp_121
0-
jhp_121
1
HPAG1
_1223 -
HPAG1
_1222
HPG27_12
40-
HPG27_12
41
HPP12_
1256-
HPP12_
1257
HPSH_0
6670 -
HPSH_0
6675
HELPY_
1266-
HELPY_
1267
24 HP1292
(rplQ,
50Sr)
HP1382
Jhp_121
2
(rplQ)-
Jhp_129
5
HPAG1
_1237
(riboso
mal)-
HPAG1
_1327
HPG27_12
42 (50S)-
HPG27_13
26
HPP12_
1258(50
S)-
HPP12_
1376
HPSH_0
6685(50S
)-
HPSH_0
7150
HELPY_
1269(50
S)-
HELPY_
1369
25 HP1383
(RMS)
Jhp_142
2
HPAG1
_1462
HPG27_14
55
HPP12_
1508
HPSH_0
7300
HELPY_
1506
26 HP1384-
HP1387
(ADN pol)
Jhp_144
1-
jhp_143
8
HPAG1
_1484-
HPAG1
_1481
HPG27_14
73-
HPG27_14
70
HPP12_
1524-
HPP12_
1527
HPSH_0
7985-
HPSH_0
7970
HELPY_
1538-
HELPY_
1535
27 HP1391-
HP1403
(hsdM)
Jhp_143
6-
jhp_142
3
HPAG1
_1479-
HPAG1
_1464
HPG27_14
68-
HPG27_14
56
HPP12_
1522-
HPP12_
1509
HPSH_0
7950 –
HPSH_0
7890
HELPY_
1519-
HELPY_
1507
28 HP1406(bi
oB)-
Hp1427 (P.
rica ne
Histidina)
Jhp_129
8 –
jhp_132
0
HPAG1
_1330-
HPAG1
-1352
HPG27_13
29 –
HPG27_13
48
HPP12_
1379 -
HPP12_
1399
HPSH_0
7170-
HPSH_0
7270
HELPY_
1372 –
HELPY_
1396
29 HP1428-
HP1431(ks
gA)
Jhp_132
5 – jhp-
1322
(ksgA)
HPAG1
_1353 -
HPAG1
_1356
HPG27_13
49 -
HPG27_13
52
HPP12_
1400 –
HPP12_
1403
HPSH_0
7275 –
HPSH_0
7290
HELPY_
1397-
HELPY_
1400
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
90
30 HP1434(pu
rU)-
HP1453
(homD)
Jhp_132
7-
jhp_134
6
HPAG1
_1360-
HPAG1
_1379
HPG27_13
55-
HPG27_13
74
HPP12_
1409 -
HPP12_
1430
HPSH_0
7305-
HPSH_0
7435
HELPY_
1403-
HELPY_
1423
31 HP1454-
HP1533(th
yX)
Jhp_134
7-
jhp_142
1
HPAG1
_1461-
HPAG1
_1383
HPG27_13
77 –
HPG27_
1454
HPP12_
1432 –
HPP12_
1507
HPSH_0
7445 –
HPSH_0
7875
HELPY_
1425 –
HELPY_
1504
32 HP1538
(fbcH)-
HP1555
(tsf)
Jhp_146
1 -
jhp_144
4
HPAG1
_1487 –
HPAG1
_1504
HPG27_14
76 –
HPG27_14
93
HPP12_
1546 –
HPP12_
1529
HPSH_0
81008
HPSH_0
8005
HELPY_
1541 –
HELPY_
1558
33 HP1556
(ftsI) -
HP1585
(flg)
Jhp_146
4 -
jhp_149
2
HPAG1
_1505-
HPAG1
_ 1533
HPG27_14
94 –
HPG27_15
23
HPP12_
1548 –
HPP12_
1576
HPSH_0
8110 –
HPSH_0
8250
HELPY_
1559 –
HELPY_
1589
34 HP1588 Jhp_149
4
HPAG1
_1536
HPG27_15
25
HPP12_
1580 –
HPP12_
1581
HPSH_0
8270 -
HPSH_0
8275
HELPY_
1591-
HELPY_
1592
35 HP1590 Jhp_149
3
HPAG1
_1535
HPG27_15
27
HPP12_
1579
HPSH_0
8265
HELPY_
1593
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
91
Apéndice 4. Lista de cepas y los orígenes de cada una ellas que se utilizaron para el
análisis de recombinación y filogenético de los genes vacA y cagA.
Las marcas amarilla indican las cepas que están presentes en ambos arboles.
vacA cagA
CEPA
ORIGEN CEPA ORIGEN
Hp F13 Fukui, Japón Hp F80 Fukui Japón Hp F15 Fukui, Japón Hp F79 Fukui Japón Hp F16 Fukui, Japón Hp F28 Fukui Japón Hp F17 Fukui, Japón Hp F37 Fukui Japón Hp F18 Fukui, Japón Hp F15 Fukui Japón Hp F20 Fukui, Japón Hp F36 Fukui Japón Hp F21 Fukui, Japón Hp F55 Fukui Japón Hp F28 Fukui, Japón Hp F23 Fukui Japón Hp F29 Fukui, Japón Hp F57 Fukui Japón Hp.F26 Fukui, Japón Hp F24 Fukui Japón Hp F31 Fukui, Japón Hp F17 Fukui Japón Hp F32 Fukui, Japón Hp F75 Fukui Japón Hp F33 Fukui, Japón Hp F92 Fukui Japón Hp F34 Fukui, Japón Hp F18 Fukui Japón Hp F36 Fukui, Japón Hp ATCC49503 Reino Unido Hp F37 Fukui, Japón Hp ATCC49503 Reino Unido Hp F38 Fukui, Japón Hp ATCC43526 Reino Unido Hp F42 Fukui, Japón Hp NCTC11637 Australia Hp F43 Fukui, Japón Hp OK112 Okinawa Japón Hp F44 Fukui, Japón Hp OK111 Okinawa Japón Hp F45 Fukui, Japón Hp OK314 Okinawa Japón Hp F47 Fukui, Japón Hp OK312 Okinawa Japón Hp F51 Fukui, Japón Hp OK206 Okinawa Japón Hp F52 Fukui, Japón Hp OK109 Okinawa Japón Hp F55 Fukui, Japón Hp OK311 Okinawa Japón Hp F56 Fukui, Japón Hp OK316 Okinawa Japón Hp F57 Fukui, Japón Hp OK212 Okinawa Japón Hp F61 Fukui, Japón Hp OK313 Okinawa Japón Hp F62 Fukui, Japón Hp OK305 Okinawa Japón
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
92
Hp F63 Fukui, Japón Hp OK317 Okinawa Japón Hp F64 Fukui, Japón Hp OK302 Okinawa Japón Hp F65 Fukui, Japón Hp OK101 Okinawa Japón Hp F68 Fukui, Japón Hp OK159 Okinawa Japón Hp F69 Fukui, Japón Hp OK129 Okinawa Japón Hp F70 Fukui, Japón Hp OK309 Okinawa Japón Hp F71 Fukui, Japón Hp OK158 Okinawa Japón Hp F72 Fukui, Japón Hp OK306 Okinawa Japón Hp F73 Fukui, Japón Hp OK194 Okinawa Japón Hp F78 Fukui, Japón Hp OK113 Okinawa Japón Hp F79 Fukui, Japón Hp OK204 Okinawa Japón Hp F80 Fukui, Japón Hp OK197 Okinawa Japón Hp F87 Fukui, Japón Hp OK310 Okinawa Japón Hp F92 Fukui, Japón Hp OK181 Okinawa Japón Hp F94 Okinawa, Japón Hp OK160 Okinawa Japón Hp OK101 Okinawa, Japón Hp OK155 Okinawa Japón Hp OK107 Okinawa, Japón Hp OK308 Okinawa Japón Hp OK109 Okinawa, Japón Hp OK144 Okinawa Japón Hp OK111 Okinawa, Japón Hp OK210 Okinawa Japón Hp OK118 Okinawa, Japón Hp OK187 Okinawa Japón Hp OK129 Okinawa, Japón Hp OK139 Okinawa Japón Hp OK130 Okinawa, Japón Hp OK130 Okinawa Japón Hp OK144 Okinawa, Japón Hp OK107 Okinawa Japón Hp OK155 Okinawa, Japón Hp OK168 Okinawa Japón Hp OK158 Okinawa, Japón Hp OK180 Okinawa Japón Hp OK159 Okinawa, Japón Hp OK185 Okinawa Japón Hp OK160 Okinawa, Japón Hp J241 Japón Hp OK179 Okinawa, Japón HP j248 Japón Hp OK180 Okinawa, Japón Hp J230 Japón Hp OK181 Okinawa, Japón Hp J207 Japón Hp OK185 Okinawa, Japón Hp J216 Japón Hp OK187 Okinawa, Japón Hp J16 Japón Hp OK194 Okinawa, Japón Hp J149 Japón Hp OK204 Okinawa, Japón Hp J187 Japón Hp OK205 Okinawa, Japón Hp J578 Japón Hp OK210 Okinawa, Japón Hp J566 Japón Hp AFN1156 Kenia Hp J198 Japón Hp AFN4124 Kenia Hp J194 Japón Hp AFN4847 Kenia Hp CAPMN111 China Hp AFN4769 Kenia Hp CAPMN93 China
Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori
93
Hp AFNG114
Kenia
Hp CAPMN62
China
Hp CHN5114a China Hp MEL-HP27 China Hp CHN1811a China Hp CPY3401 Japón Hp CHN3554a China Hp CPY2052 Japón Hp CHN4611a China Hp Ca73 Suiza Hp CHN3295b China Hp Ca52 Suiza Hp CHN5147c China Hp Du23:2 Suiza Hp CHN5038c China Hp OK118 Okinawa Hp CHN5060d China Hp 908 India Hp ch2 China Hp 2017 India Hp ATCC43526 Reino Unido Hp 2018 India Hp NCTC11637 Australia Hp 7Bqs Korea Hp NCTC11638 Australia Hp P310 Alemania Hp Shi470 Perú Hp SS1 China Hp J99 USA Hp 27G China Hp P12 Alemania Hp 42G China Hp G27 Italia Hp C401 F32 Fukui Japón Hp HPAG1 Suiza Hp 147a Holanda Hp 26695 Reino Unido Hp 147C Holanda Hp Tx30a USA Hp 132C China Hp 95-54J128 Japón Hp Shi470 Perú Hp 60190 USA Hp HPAG1 Suiza Hp 4647C México Hp 26695 Reino Unido Hp cpWS16 Clone Alemania Hp P12 Alemania Hp G27 Italia Hp J99 USA