Metode odredjivanja molarnih masa i velicine makromolekula ... · Termin polimerni molekul implicira višestruko ponavljanje. Ovaj pojam znači da se polimerni molekul sastoji od

Fizičkohemijske metode za određivanje molarnih masa i veličine makromolekula

Prof. dr Gordana Ćirić-Marjanović

Fakultet za fizičku hemiju

e-mail: [email protected]

NAUKA O POLIMERIMA obuhvata hemiju, fizičku hemiju i fiziku polimera; obezbeđuje fundamentalna znanja potrebna za industrijsku primenu polimera (plastike, elastomeri, adhezivi, prevlake..). Takođe, ona je jedna od centralnih nauka za molekularnu biologiju, biohemiju i biofiziku.

MAKROMOLEKUL: makros = veliki (grčki); molecula = mala masa (latinski)Makromolekul je molekul sastavljen od velikog broja atoma, stoga ima veliku relativnu molekulsku masu (Mr)koja može da iznosi kod sintetičkih makromolekula od nekoliko stotina do nekoliko miliona, a kod nekihbioloških makromolekula Mr je u rangu milijardi.

POLIMER: polis= mnogo; meros = deo (grčki)

IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) tretira pojmove makromolekul i polimer kao sinonime.

Termin polimerni molekul implicira višestruko ponavljanje. Ovaj pojam znači da se polimerni molekul sastoji od mnogo delova (tzv. mer-ova) koji predstavljaju jedinice izvedene iz molekula niskih relativnih molekulskih masa i da se ovi mer-ovi višestruko ponavljaju u polimernom molekulu. Primer je polistiren.

Termin makromolekul ne implicira ništa o strukturi, ali govori o tome da je molekul veliki. Na primer, molekuli enzima su makromolekuli sastavljeni od stotine ili hiljada jedinica koje su α-amino kiseline-NH-CHR-CO- sa do 20 različitih supstituenata R. Same α-amino kiseline su u enzimu poređane po ne-

ponavljajućem redosledu, npr. –ala-gly-lys-leu-...

NAUKA O POLIMERIMA obuhvata hemiju, fizičku hemiju i fiziku polimera; obezbeđuje fundamentalna znanja potrebna za industrijsku primenu polimera (plastike, elastomeri, adhezivi, prevlake..). Takođe, ona je jedna od centralnih nauka za molekularnu biologiju, biohemiju i biofiziku.

MAKROMOLEKUL: makros = veliki (grčki); molecula = mala masa (latinski)Makromolekul je molekul sastavljen od velikog broja atoma, stoga ima veliku relativnu molekulsku masu (Mr)koja može da iznosi kod sintetičkih makromolekula od nekoliko stotina do nekoliko miliona, a kod nekihbioloških makromolekula Mr je u rangu milijardi.

POLIMER: polis= mnogo; meros = deo (grčki)

IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) tretira pojmove makromolekul i polimer kao sinonime.

Termin polimerni molekul implicira višestruko ponavljanje. Ovaj pojam znači da se polimerni molekul sastoji od mnogo delova (tzv. mer-ova) koji predstavljaju jedinice izvedene iz molekula niskih relativnih molekulskih masa i da se ovi mer-ovi višestruko ponavljaju u polimernom molekulu. Primer je polistiren.

Termin makromolekul ne implicira ništa o strukturi, ali govori o tome da je molekul veliki. Na primer, molekuli enzima su makromolekuli sastavljeni od stotine ili hiljada jedinica koje su α-amino kiseline-NH-CHR-CO- sa do 20 različitih supstituenata R. Same α-amino kiseline su u enzimu poređane po ne-

ponavljajućem redosledu, npr. –ala-gly-lys-leu-...

H2C CH

stiren-monomer

CH2 CH CH2

polistiren

CH CH2 CHCH2 CH

n

polistiren

A A A A A A A A A

Oligomeri su molekuli srednjih relativnih molekulskih masa, sa malim brojem ponavljajućih monomernih strukturnih jedinica, najčešće 2 do 20.Na osnovu broja strukturnih ponavljajućih jedinica polimeri se dele na homopolimere i kopolimere(heteropolimere).Homopolimer je sastavljen od samo jedne vrste monomera (mer-a), a kopolimer je polimerni molekul saviše vrsta mer-ova (tj. kopolimeri nastaju reakcijom više različitih monomera)

Oligomeri su molekuli srednjih relativnih molekulskih masa, sa malim brojem ponavljajućih monomernih strukturnih jedinica, najčešće 2 do 20.Na osnovu broja strukturnih ponavljajućih jedinica polimeri se dele na homopolimere i kopolimere(heteropolimere).Homopolimer je sastavljen od samo jedne vrste monomera (mer-a), a kopolimer je polimerni molekul saviše vrsta mer-ova (tj. kopolimeri nastaju reakcijom više različitih monomera)

A = Monomerna jedinica(ponavljajuća jedinica; mer)Homopolimer

Samo raskidanjem kovalentne veze između monomernih jedinica (merova) može doći do razlaganja makromolekula.MONOMER (G: monos = jedan; meros = deo)Samo raskidanjem kovalentne veze između monomernih jedinica (merova) može doći do razlaganja makromolekula.MONOMER (G: monos = jedan; meros = deo)

linearan razgranat umrežen lestvičast cikličan

POLIMERI u svakodnevnom životu

MONOMER(I) POLIMER PRIMENA i identifikacioni kodEtilen (eten) Polietilen

Propilen (propen) Polipropilen

LDPE HDPE

Polimeri u svakodnevnom životu

MONOMER(I) POLIMER PRIMENA i identifikacioni kod

Etilen glikol

Tereftalna kiselina

Poli(etilen tereftalat)

Stiren Polistiren

PET

Polimeri u svakodnevnom životu

MONOMER(I) POLIMER PRIMENA

Za najlon-6,10:

Sebacoil hlorid

Heksametilendiamin

Najlon

Najlon-6,10

Električni izolatori (najlon 6,10)

Polimeri u svakodnevnom životuMONOMER(I) POLIMER PRIMENA

Izopren

Izobuten i izopren

Stiren i butadien

Butadien

Gume Poliizopren

Butil guma

Stiren-butadien guma (SBR)

Polibutadien

Makromolekuli u našem organizmuDeoksiribonukleinska kiselina (DNA)

Svaki makromolekul DNK se sastoji od dva lanca, povezana vodoničnim vezama u dvostruki heliks.

Ćelija je osnovna jedinica života, a DNA se nalazi u jedru ćelije i služi da skladišti praktično sve informacije neophodne za funkcije ćelija, pre svega skladišti informacije o strukturi proteina (enzima).

Ribonukleinska kiselina (RNA) je jednolančana, strukturno slična molekulu DNA i služi za prenos informacija koje su uskladištene u DNA do npr. mesta gde se sintetiše protein u ćeliji.

Genetska oštećenja su u stvari oštećenja na DNA.

Polimerizacija i razgradnja makromolekula se stalno dešavaju u organizmu.

Makromolekuli u našem organizmuGlikogen

Glukoza

Glikogen je razgranatipolisaharid. Jedna globula glikogena sadrzi oko 30 000 jedinica glukoze. U jezgru je protein glikogenin koji katalizuje pretvaranjeglukoze u glikogen. Glikogen se nalazi u mišićima, jetri i eritrocitima.

eritrociti

Kada je potrebna dodatna energija za rad misića glikogen se razlaže na manje molekule glukoze koji dalje učestvuju u procesima koji daju tu dodatnu energiju.

Makromolekuli koje unosimo u organizam hranomPolisaharidi: skrob, celuloza

SKROB

CELULOZA

Amiloza

Amilopektin

Skrob i celuloza su homopolimeri glukoze

Ugljeni hidrati (šećeri) dele se na:-Monosaharide (glukoza)-Disaharide (maltoza)-Oligosaharide-Polisaharide

Makromolekuli koje unosimo u organizam hranomProteini: iz jaja, mesa, soje

glicin

alanin

valin

leucin

izoleucin

Proteni su polipeptidi koji sadrže veliki broj različitih aminokiselina

Albumin je glavni protein krvne plazmeljudi. On reguliše osmotski pritisak krvi. Vezuje vodu, katjone, masne kiseline, transportuje hormone, bilirubin i dr. Nalazi se u belancetu jajeta. To je globularni protein.

Albumin

Veličina makromolekula

Veličina polimernih lanaca predstavlja jednu od najvažnijih karakteristika polimera od koje zavise mnoga druga njihova svojstva (npr. mehanička i toplotna svojstva, viskoznost rastopa ili rastvora polimera i dr.). Tako na primer, tvrdoća polimera raste sa njegovom molarnom masom. Zbog veličine molekula polimeri su neisparljivi.

Veličina polimernih lanaca predstavlja jednu od najvažnijih karakteristika polimera od koje zavise mnoga druga njihova svojstva (npr. mehanička i toplotna svojstva, viskoznost rastopa ili rastvora polimera i dr.). Tako na primer, tvrdoća polimera raste sa njegovom molarnom masom. Zbog veličine molekula polimeri su neisparljivi.

Molarna masa (M) predstavlja masu jednog mola supstancije (makromolekula) i izražava se u kg/mol..Kao mera veličine makromolekula koristi se i relativna molekulska masa (Mr) koja predstavlja odnos mase makromolekula i 1/12 mase atoma ugljenika (12C). Mr jebezdimenziona veličina.

Molarna masa izražena u jedinicama g/mol brojno je jednaka relativnoj molekulskoj masi, zbog čega IUPAC preporučuje upotrebu ove jedinice (iako nije po SI sistemu).

Molarna masa (M) predstavlja masu jednog mola supstancije (makromolekula) i izražava se u kg/mol..Kao mera veličine makromolekula koristi se i relativna molekulska masa (Mr) koja predstavlja odnos mase makromolekula i 1/12 mase atoma ugljenika (12C). Mr jebezdimenziona veličina.

Molarna masa izražena u jedinicama g/mol brojno je jednaka relativnoj molekulskoj masi, zbog čega IUPAC preporučuje upotrebu ove jedinice (iako nije po SI sistemu).

Treći način da se opiše veličina makromolekula je stepen polimerizacije (X), koji predstavlja broj monomernih ostataka od kojih je izgrađen jedan homopolimerni lanac. Stepen polimerizacije je direktno proporcionalan molarnoj masi polimera. Za homopolimere, stepen polimerizacije se izračunava kao količnik molarne mase makromolekula M i molarne mase monomernog ostatka, Mo :

X = M / MoTako na primer, za polietilen sa stepenom polimerizacije X=100 molarna masa Mpredstavlja proizvod 100 i Mo =28 g/mol, odnosno M=2800 g/mol.

Treći način da se opiše veličina makromolekula je stepen polimerizacije (X), koji predstavlja broj monomernih ostataka od kojih je izgrađen jedan homopolimerni lanac. Stepen polimerizacije je direktno proporcionalan molarnoj masi polimera. Za homopolimere, stepen polimerizacije se izračunava kao količnik molarne mase makromolekula M i molarne mase monomernog ostatka, Mo :

X = M / MoTako na primer, za polietilen sa stepenom polimerizacije X=100 molarna masa Mpredstavlja proizvod 100 i Mo =28 g/mol, odnosno M=2800 g/mol.

Srednje molarne mase makromolekula

Srednja brojna molarna masa

Srednja brojna molarna masa

Srednja masena molarna masa

Srednja masena molarna masa

Indeks polidisperznosti

Srednja z-vrednost molarne mase

Srednja viskozimetrijska molarna masa

Raspodela molarnih masa polimera

Slika 1. Diferencijalna raspodela molarnih masa (dužina lanaca) polimernog uzorka.

U zavisnosti od broja pikova raspodela molekulskih masa može biti monomodalna, bimodalna, trimodalna...

U zavisnosti od broja pikova raspodela molekulskih masa može biti monomodalna, bimodalna, trimodalna...

Diferencijalna kriva raspodele može se predstaviti i kao masena raspodela molarnih masa: mi = ni Mi = f (Xi) ili ni Mi = f(Mi) ili wi = f(Mi).

Kapilarni viskozimetriViskozimetri koji se uobičajeno koriste za rastvore polimera su Ostwald-ovog, Fenski-jevog i Ubbelohde-ovog tipa. Svi su bazirani na merenju toka tečnosti kroz cev.

Ostwald-ov viskozimetar

Ostwald-ovim viskozimetrom meri se vreme t proticanja tečnosti kroz kapilarnu cev dužine l odnosno vreme za koje menisk padne od tačke A do tačke B. Viskoznost se računa prema Poazejevom zakonu:

lVptr

8

4 ∆=

πη

Pritisak pod kojim se tečnost kreće kroz cev je:

Δp = ρghgde je ρ gustina tečnosti, g gravitacionoubrzanje i h razlika nivoa tečnosti između dvakraka viskozimetra.Najčešće se vrši relativno određivanje nepoznatog koeficijenta viskoznosti η1ispitivane tečnosti u odnosu na tečnost poznatog koeficijenta viskoznosti η2 . Za dverazličite tečnosti 1 i 2 meri se vreme za koje iste zapremine tečnosti isteknu kroz istuvertikalnu kapilarnu cev (V, r, l je isto), tako da je:

22

11

2

1

tt

ρρ

ηη

=

gde je r radijus kapilare, Δp razlika pritisaka na početku i na kraju posmatranog dela cevi, V zapremina tečnosti koja protekne za vreme t kroz deo cevi dužine l.

Određivanje molarne mase polimera na osnovu viskoznosti

Unutrašnja viskoznost

Relativna viskoznost, ηr , predstavlja količnik viskoznosti rastvora i viskoznosti rastvarača:

Specifična viskoznost, ηsp je data izrazom:

o

orsp η

ηηηη

−=−= 1

Unutrašnja viskoznost, , definisana je kao:[ ]η

[ ]csp

c

ηη

0lim

→=

gde je c koncentracija polimera u g/100 ml ili u g/ml rastvora.

Jedinica za [η] je ml/g ili 100 ml/g (dl/g), u zavisnosti od jedinice koncentracije rastvora.

Unutrašnja viskoznost se naziva i granični broj viskoznosti ili Staudinger-ov indeks.

ηred = Redukovana viskoznost = ηsp/c

t-vreme isticanja

ačrast

rastvor

ačrast

rastvor

oačrast

rastvorr t

ttt

varvarvar )()(

≅===ρρ

ηη

ηη

η

Mark-Houwink-Sakurada (M-H-S) jednačinapovezuje unutrašnju viskoznost sa viskozimetrijskom srednjom molarnom masom:

gde su K i a konstante.

Mark-Houwink-Sakurada jednačina je primenljiva na mnoge polimere i široko korišćena zaodređivanje molekulskih masa. Konstante K i a su specifične za dati sistem i zavise od parapolimer- rastvarač i temperature. Eksponent a zavisi od oblika makromolekula. Teorijapredviđa:

a = 0 za sferea = 0,5−0,8 za statistička klupkaa = 2 za krute štapiće

Vrednost a je veća što su lanci krući i nižih molarnih masa (i obrnuto).

Konstante K i a određuju se za svaki sistem polimer-rastvarač-temperatura kalibracijom pomoću molekulskiuniformnih polimera (sa sa indeksom polidisperznosti ~1), iste strukture. Umesto korišćenja (frakcija) polimerasa indeksom polidisperznosti 1 kalibracija se može uraditi i sa polimerima koji imaju široke raspodele molarnihmasa ako su im poznate srednje viskozimetrijske molarne mase.

Konstante K i a određuju se za svaki sistem polimer-rastvarač-temperatura kalibracijom pomoću molekulskiuniformnih polimera (sa sa indeksom polidisperznosti ~1), iste strukture. Umesto korišćenja (frakcija) polimerasa indeksom polidisperznosti 1 kalibracija se može uraditi i sa polimerima koji imaju široke raspodele molarnihmasa ako su im poznate srednje viskozimetrijske molarne mase.

2/32

=M

RK o

θφ

M

R 32/12 )(~][ θη

Hidrodinamička zapreminamakromolekula

2R je srednja vrednost kvadrata rastojanja između krajeva polimernog lanca.

2/12/1

2/322/32

][ MKMM

R

M

Roo =

== θθθ φφη

Unutrašnja viskoznostna teta temperaturi

Na θ temperaturi postoje samo interakcije kratkog ranga između susednih ili bliskih polimernih segmenata. Polimerni molekuli skupljeni su u kompaktnu formu.

Florijeva konstanta viskoznosti (univerzalna konstanta)

Flori i Foks su sugerisali da unutrašnja viskoznost na θ temperaturi, [η]θ , može da se smatra merom odnosa efektivne hidrodinamičke zapremine polimera i njegove molekulske mase M. Oni su radijus hidrodinamičke zapremine smatrali jednakim za nasumično klupko.2/12R

R

Veličina (zapremina) nasumičnog klupka makromolekula u rastvoru izražava se preko 2/12R

Konstanta proporcionalnosti je univerzalna konstanta za neperturbovana klupka velikih molarnih masa. Flori i Foks su delimično objasnili značenje konstanti K i a u Mark-Houwink ovoj jednačini. Na θ temperaturi, K je definisano jednačinom ispod, dok je a = ½.

θφ

Flori-Foxjednačina

= 2,1 × 1021, kada je [η]θ izraženo u dl/g, a u cm2. 02Rθφ

oR2

se odnosi na neperturbovano klupko, na teta temperaturi..

U dobrom rastvaraču ili u slabom rastvaraču na temperaturi koja nije θ, prisutne su interakcije dugog ranga usledčega se polimerni molekul izdužuje. Uvodi se ekspanzioni faktor α (faktor širenja) koji opisuje ove efekte.

2/122/12oRR α=

[ ][ ] )( 3

2/3

0

2

23

ηαηηα ==

=

oR

R[ ] [ ] 3αηη o=

[η] = K M1/2 α3

2/3

2

22/3

0

2

=

=

αφφ

MR

M

RK

Kada [η] nije merena na teta temperaturi, konstanta K je data izrazom:

Za perturbovana klupka (temperature koje nisu teta):

Merenje unutrašnje viskoznosti i određivanje Mv

Ubeholde-ov viskozimetar(U-cev da bi se izbeglo dopunjavanjerastvorom do marke svaki put)

ckcsp 2][][ ηη

η+=

Huggins-ova jednačina

k je bezdimenzionalna konstanta, Huggins-ova konstanta, čija vrednost zavisi od strukturepolimera i temperature.

Primer izračunavanja Mv

Uzorak polistirena rastvoren je u butanonu (0,1 % rastvor), merenje viskoznosti vršeno je na 25 oC, dobijena su vremena isticanja rastvora i rastvarača 110s i 140 s.

Uz aproksimaciju da je korišćena koncentracija blizu c=0

K i a se nalaze iz tablica

Gel-propusna hromatografijaGel-permeation chromatography (GPC)Size exclusion chromatography (SEC)−Hromatografija razdvajanja po veličiniGel-permeation chromatography (GPC)Size exclusion chromatography (SEC)−Hromatografija razdvajanja po veličini

Ova metoda je jedna od najčešće primenjivanih metoda za određivanje molarnih masa makromolekula. SEC analize su relativno jednostavne i koriste standardnu HPLC instrumentaciju. Osnovni delovi instrumenta su HPLC pumpa, SEC kolona, detektor (diferencijalni refraktometar, spektrofotometrijski detektor i dr.) i sistem za sakupljanje i obradu podataka, odnosno računanje prosečnih molekulskih masa.

Ova metoda je jedna od najčešće primenjivanih metoda za određivanje molarnih masa makromolekula. SEC analize su relativno jednostavne i koriste standardnu HPLC instrumentaciju. Osnovni delovi instrumenta su HPLC pumpa, SEC kolona, detektor (diferencijalni refraktometar, spektrofotometrijski detektor i dr.) i sistem za sakupljanje i obradu podataka, odnosno računanje prosečnih molekulskih masa.

Slika 2. Shematski prikaz osnovnih delova GPC (SEC) instrumenta.

GPC je generalno relativna tehnika koja zahteva kalibraciju ili standardizaciju pomoću polimernoguzorka poznate molarne mase. Međutim, jedanput kalibrisana, GPC može dati raspodelu molarnihmasa i vrednosti srednjih molarnih masa i za ~ 30 min.

GPC je generalno relativna tehnika koja zahteva kalibraciju ili standardizaciju pomoću polimernoguzorka poznate molarne mase. Međutim, jedanput kalibrisana, GPC može dati raspodelu molarnihmasa i vrednosti srednjih molarnih masa i za ~ 30 min.mMnM

GPC tehnika je zasnovana na različitim brzinama propuštanja makromolekula različitih veličina(molarnih masa) kroz pore materijala kojim je napunjena kolona. Ova hromatografija funkcioniše kaomolekulsko sito. Makromolekuli se razdvajaju na osnovu njihove hidrodinamičke zapremineodnosno veličine. U GPC eksperimentu, uzorak se ubacuje (injektuje) u hromatografsku kolonu kojaje punjena poroznim materijalom. Kada rastvor uzorka prolazi kroz kolonu, veći makromolekuli,koji su suviše veliki da bi mogli da prodiru u pore materijala kolone, eluiraju prvi, praćeni manjimmolekulima koji mogu prodirati u pore materijala kolone i koji eluiraju u kasnijim vremenima.

GPC tehnika je zasnovana na različitim brzinama propuštanja makromolekula različitih veličina(molarnih masa) kroz pore materijala kojim je napunjena kolona. Ova hromatografija funkcioniše kaomolekulsko sito. Makromolekuli se razdvajaju na osnovu njihove hidrodinamičke zapremineodnosno veličine. U GPC eksperimentu, uzorak se ubacuje (injektuje) u hromatografsku kolonu kojaje punjena poroznim materijalom. Kada rastvor uzorka prolazi kroz kolonu, veći makromolekuli,koji su suviše veliki da bi mogli da prodiru u pore materijala kolone, eluiraju prvi, praćeni manjimmolekulima koji mogu prodirati u pore materijala kolone i koji eluiraju u kasnijim vremenima.

MakromolekulPorastacionarne faze

Gel-propusna hromatografija

Stacionarna faza kolone može biti organska (na bazi umreženog poroznog polimera, npr. polistirena, poli (vinil alkohola)) ili neorganska (npr. na bazi SiO2). Veličina pora je 10-400 nm a veličina čestica (loptastog oblika) stacionarne faze je 5-10 μm. Rastvarači (mobilna faza): THF, toluen, NMP, voda i dr.

Kolone za GPCKolone za GPC

Gel-propusna hromatografija

Tipično, u eksperimentu se injektuje 25−100 μL rastvora polimera čija je koncentracija niža od 1% iprimenjuje se protok od 1mL/min.

Rezultat GPC analize je hromatogram koji predstavlja zavisnost odgovora detektora (osetljivog na koncentraciju ilimolarnu masu) od vremena eluiranja. Sirovi podaci se kompjuterski obrađuju: vreme eluiranja (retenciono vreme)se transformiše u zapreminu eluiranja (retencionu zapreminu VR), a zapremina eluiranja u molarnu masu, dok se

odgovor detektora transformiše u koncentraciju odnosno maseni udeo.Dok mobilna faza teče konstantnom brzinom kroz kolonu punjenu poroznom stacionarnom fazom, rastvor polimernog uzorka se ubacuje (injektuje) u mobilnu fazu na vrhu kolone. Pod dejstvom istog gradijenta pritiska koji dovodi do toka rastvarača, makromolekuli uzorka takođe putuju kroz kolonu, od vrha naniže, sa vremenima zadržavanja koja zavise od njihove veličine. Vrlo veliki makromolekuli ne prodiru u pore stacionarne faze i putuju kroz tzv. intersticijalnu zapreminu kolone V0 izlazeći iz kolone prvi. Makromolekuli nižih molarnih masa prodiru u pore stacionarne faze i eluiraju kasnije. Kada je veličina makromolekula relativno mala u odnosu na prosečnu veličinu pora, makromolekul će slobodno difundovati u pore i izvan pora i eluiraće na totalnoj zapremini mobilne faze, Vt

Vt = V0 + Vi0gde je Vi0 ukupna zapremina pora.

Koeficijent raspodele molekula u porama različitih veličina, K, definiše se u GPC metodi kao

gde je Vi zapremina pora dostupna datoj (i-toj) vrsti makromolekula.

Retenciona zapremina polimera VR (zapremina eluiranja polimera) se sada može izraziti u formi:

VR = V0 + K Vi0

Vrednost K kod SEC metode je: 0 ≤ K ≤ 1

Najvećim molekulima odgovara K = 0 (iz gornje jednačine sledi da je VR tada jednako V0), a najmanjim molekulimaK = 1 (tada je VR jednako V0 + Vi0 ).

Rezultat GPC analize je hromatogram koji predstavlja zavisnost odgovora detektora (osetljivog na koncentraciju ilimolarnu masu) od vremena eluiranja. Sirovi podaci se kompjuterski obrađuju: vreme eluiranja (retenciono vreme)se transformiše u zapreminu eluiranja (retencionu zapreminu VR), a zapremina eluiranja u molarnu masu, dok se

odgovor detektora transformiše u koncentraciju odnosno maseni udeo.Dok mobilna faza teče konstantnom brzinom kroz kolonu punjenu poroznom stacionarnom fazom, rastvor polimernog uzorka se ubacuje (injektuje) u mobilnu fazu na vrhu kolone. Pod dejstvom istog gradijenta pritiska koji dovodi do toka rastvarača, makromolekuli uzorka takođe putuju kroz kolonu, od vrha naniže, sa vremenima zadržavanja koja zavise od njihove veličine. Vrlo veliki makromolekuli ne prodiru u pore stacionarne faze i putuju kroz tzv. intersticijalnu zapreminu kolone V0 izlazeći iz kolone prvi. Makromolekuli nižih molarnih masa prodiru u pore stacionarne faze i eluiraju kasnije. Kada je veličina makromolekula relativno mala u odnosu na prosečnu veličinu pora, makromolekul će slobodno difundovati u pore i izvan pora i eluiraće na totalnoj zapremini mobilne faze, Vt

Vt = V0 + Vi0gde je Vi0 ukupna zapremina pora.

Koeficijent raspodele molekula u porama različitih veličina, K, definiše se u GPC metodi kao

gde je Vi zapremina pora dostupna datoj (i-toj) vrsti makromolekula.

Retenciona zapremina polimera VR (zapremina eluiranja polimera) se sada može izraziti u formi:

VR = V0 + K Vi0

Vrednost K kod SEC metode je: 0 ≤ K ≤ 1

Najvećim molekulima odgovara K = 0 (iz gornje jednačine sledi da je VR tada jednako V0), a najmanjim molekulimaK = 1 (tada je VR jednako V0 + Vi0 ).

Obrada GPC podataka

Kalibracijom serijama polimernih standarda poznate molarnemase (sa uskom raspodelom M), dobija se zavisnost izmeđulogM i VR. Ova zavisnost, odnosno kalibraciona kriva,koristiti se za određivanje raspodele molarnih masa i srednjihmolarnih masa uzoraka.

Kalibracijom serijama polimernih standarda poznate molarnemase (sa uskom raspodelom M), dobija se zavisnost izmeđulogM i VR. Ova zavisnost, odnosno kalibraciona kriva,koristiti se za određivanje raspodele molarnih masa i srednjihmolarnih masa uzoraka.

Slika 4. GPC kalibracioni grafik za polistirenske standarde u THF na 25 oC.

Slika 5. GPCHromatogram

Analiza hromatograma

Kao standardi koriste se polistiren, poli(metil metakrilat), poliizopren, polibutadien, poli(etilen oksid) i dr. Molarnemase standarda su u rangu od nekoliko stotina g/mol (oligomeri) do 20.000.000 g/mol.

log M1 = C VR

Kompjuterizovano sakupljanje i obrada podataka uključuju sledeće korake: 1. konverziju vremena eluiranja uzapreminu eluiranja VR, 2. konverziju VR u molarnu masu, 3. konverziju odgovora detektora u koncentraciju polimernevrste i 4. konverziju koncentracije polimerne vrste u masenu frakciju wi.

Kompjuterizovano sakupljanje i obrada podataka uključuju sledeće korake: 1. konverziju vremena eluiranja uzapreminu eluiranja VR, 2. konverziju VR u molarnu masu, 3. konverziju odgovora detektora u koncentraciju polimernevrste i 4. konverziju koncentracije polimerne vrste u masenu frakciju wi.

“Univerzalna” kalibracijaPošto razdvajanje makromolekula kod GPC zavisi više od hidrodinamičke zapremine makromolekula nego odnjihove molarne mase, koristi se GPC kalibracija bazirana na zavisnosti hidrodinamičke zapremine [η]M odretencione zapremine VR, gde [η] predstavlja unutrašnju viskoznost. Ovakva kriva zove se “univerzalna”kalibraciona kriva:

Pošto razdvajanje makromolekula kod GPC zavisi više od hidrodinamičke zapremine makromolekula nego odnjihove molarne mase, koristi se GPC kalibracija bazirana na zavisnosti hidrodinamičke zapremine [η]M odretencione zapremine VR, gde [η] predstavlja unutrašnju viskoznost. Ovakva kriva zove se “univerzalna”kalibraciona kriva:

Slika 6. «Univerzalna» GPC kalibraciona kriva dobijena merenjima sa različitim polimernim standardima.

Ako je VR nekog ispitivanog polimerapoznata, direktno sa kalibracione krivemože se pročitati vrednost [η]M.Vrednost M se može onda odrediti ako je[η] takođe poznata (izmerena).Ova procedura je pogodna kod procenemolarnih masa novih polimera. Takođe,ona koriguje razlike koje potiču izhidrodinamičkih zapremina kada seporede M nekoliko polimera a samojedan od njih (npr. polistiren) se koristiza kalibraciju.Ne može se koristiti za visoko razgranatepolimere.

R

BA

BCVAMBA

Maa

KK

aM

+=+=

=++

++

=

1

12

1

2

1

22

log

log11log

11log

32144 34421

Modifikovani metod je predložen u pokušaju da se poboljša univerzalni kalibracioni pristup. Na datoj zapremini eluiranja, dva polimera, 1 i 2, treba da imaju iste hidrodinamičke zapremine [η] M:

[η]1 M1 = [η]2 M2 [η] = K Ma

gde je C nagib kalibracione krive log M1 = C VR , oznaka 1 odnosi se na standard (npr. polistiren), a oznaka 2 na ispitivani uzorak. Ako su K1 i a1 za standardni polimer i K2 i a2 za analizirani polimer poznati iz literature, M2 se može odrediti za ispitivani uzorak iste vrste iz GPC podataka za VR. Iz kalibracione krive (log M1 = C VR) se može odrediti nagib C.

Novije generacije GPC instrumenata poseduju detektore osetljive na molarnu masu (npr. na bazi rasejanja svetlosti) koji direktno daju apsolutnu srednju molarnu masu analiziranog polimera i u tom slučaju univerzalna kalibracija nije potrebna. Takav “light-scattering” fotometar meri direktnomolarnu masu za svaku eluiranu frakciju (SEC-MALS instrumentacija).

Novije generacije GPC instrumenata poseduju detektore osetljive na molarnu masu (npr. na bazi rasejanja svetlosti) koji direktno daju apsolutnu srednju molarnu masu analiziranog polimera i u tom slučaju univerzalna kalibracija nije potrebna. Takav “light-scattering” fotometar meri direktnomolarnu masu za svaku eluiranu frakciju (SEC-MALS instrumentacija).

Detektori kod GPC:1. Detektori osetljivi na koncentraciju, na bazi:− indeksa prelamanja (RI) ili razlike u indeksu prelamanja čistog rastvarača i eluirane vrste, tzv. diferencijalnirefraktometar (DRI); odgovor detektora srazmeran je masenoj koncentraciji eluirane polimerne frakcije− UV apsorpcije− IR apsorpcije

2. Detektori osetljivi na molarnu masu:− na bazi rasejanja svetlosti (light-scattering)- omogućavaju određivanje apsolutne molarne mase:low angle light scattering (LALS), multi angle light scattering (MALS);

− viskozimetrijski

Detektori kod GPC:1. Detektori osetljivi na koncentraciju, na bazi:− indeksa prelamanja (RI) ili razlike u indeksu prelamanja čistog rastvarača i eluirane vrste, tzv. diferencijalnirefraktometar (DRI); odgovor detektora srazmeran je masenoj koncentraciji eluirane polimerne frakcije− UV apsorpcije− IR apsorpcije

2. Detektori osetljivi na molarnu masu:− na bazi rasejanja svetlosti (light-scattering)- omogućavaju određivanje apsolutne molarne mase:low angle light scattering (LALS), multi angle light scattering (MALS);

− viskozimetrijski

Slika 3. GPC instrument (Waters):A-nosač uzorkaB-kolonaC-pumpaD-detektor (refraktivni)E-detektor (UV-Vis)

A

Kod starijih modela instrumenata GPC je opremljen samo jednim detektorom (single detector).

Ako GPC sistem ima samo jedan detektor-obično RI ili UV koji su osetljivi na koncentraciju, povoljnosvojstvo ovakve detekcije je što rezultati omogućavaju izračunavanje količine svake eluirane frakcije datog uzorka. U tom slučaju koriste se kalibracione krive da bi se Vr prevele u molarne mase. Podaci o koncentracijama omogućavaju da se dobije raspodela molarnih masa. Međutim, bitno ograničenjeovog pristupa sa kalibracionom krivom predstavlja korišćenje polimernih standarda koje podrazumeva sličnost u strukturi ili gustini ispitivanog uzorka i standarda. Ukoliko ovo nije ispunjeno u dovoljnoj meri, to dovodi do nedovoljno tačnog određivanja raspodela molarnih masa. Ako se analiziraju poznati polimeri poznatih struktura, odgovarajući standardi su generalno poznati i lako dostupni tako da kalibracioni metod doje dobre rezultate. Medjutim, u slučaju novih polimera odnosno polimera čija struktura nije potpuno poznata, tip odgovarajućeg standarda nije očigledan, tako da metod kalibracione krive može da ne bude dovoljno tačan ukoliko nisu odabrani odgovarajući standardi. Ova ograničenja GPC sa jednim detektorom prevazilaze se upotrebom višestruke detekcije.

Jednostruka detekcija

U novije vreme GPC sistemi sadrže veći broj detektora (multiple detection); najčešće su prisutna 3 detektora, na bazi rasejanja svetlosti, viskoznosti i UV apsorpcije. Ovi detektori obezbeđuju različiite ali komplementarne informacije koje sve zajedno daju detaljniju sliku o strukturi polimera.

Detektori na bazi rasejanja svetlosti imaju tu prednost što mere apsolutnu molarnu masu, bez potrebe za kalibracijom, standardima. Oni koriste lasersko zračenje koje se upućuje na makromolekule. Meri se intenzitet rasejane svetlosti i M se računa direktno iz tih snimljenih podataka pod uslovom da je poznata koncentracija rastvora (korišćenjem Zimm-ove jednačine).

Viskozimetrijski detektori omogućavaju da se dobiju različiti parametri viskoznosti, pre svega [η]. Vrednosti viskoznosti dobijaju se obično pumpanjem rastvora kroz kapilarni most i merenjem razlike pritisaka između kapilara. Metodom “univerzalne kalibracije” se zatim računa molarna masa. Prevazilaze se problemi klasične kalibracije.

UV apsorpcioni detektori mere koncentraciju. Ovi detektori se mogu koristiti jedino u slučaju kada polimer poseduje hromoforu(e). Jednostavni UV detektori mere samo na jednoj talasnoj dužini, tako da daju podatke o koncentraciji određene komponente uzorka. Fotodiodni detektor (photodiode array, PDA) može da meri apsorbanciju na svim talasnim dužinama iz UV oblasti

istovremeno. Ovo omogućava da se odrede varijacije sastava polimera kao funkcija molarne mase.polymer industry

Višestruka detekcija

Koligativna svojstva rastvora polimera-određivanje srednje brojne molarne mase Mn

Povišenje tačke ključanja

Sniženje tačke mržnjenja

Gustina rastvora

Latentna toplotaisparavanja po gramu rastvarača

Latentna toplotatopljenja po gramu rastvaračaKoncentracija rastvorene

supstancije (g/cm3)

Koligativna svojstva rastvora: sniženje napona pare, povišenje tačke ključanja, sniženje tačke mržnjenjai osmotski pritisak; zavise samo od broja molekula u rastvoru, ne od hemijskog sastava.

Za polimere sa M ~ 20.000 i većim, od ovih metoda pogodno je samo merenje osmotskog pritiska.

Određivanje srednje brojne molarne mase makromolekulamembranskom osmometrijom

Osmotski pritisak je jedna od koligativniih svojstava rastvora neelektrolita. Sva ova svojstva izražavaju se preko promene aktivnosti rastvarača a1 kada je prisutna rastvorena supstancija.

Rastvor i rastvarač razdvojeni supolupropusnom membranom, koja propuštarastvarač, ali ne i rastvorenu supstanciju.Usled razlike hemijskog potencijalarastvarača u njegovo čistoj fazi ihemijskog potencijala rastvarača urastvoru, μ1 , rastvarač spontano prelazikroz membranu u rastvor, da bi sehemijski potencijali izjednačili.

Osmotski pritisak П je u stvari pritisakkojim treba delovati na rastvor da bi sesprečio tok rastvarača u rastvor krozpolupropusnu membranu.

o1µ

Polupropusna membrana

)(ln 111 µ∆−=−=Π aRTV

Aktivnost a1 definisana je kao:

μ1 – = RT lna1 (1)o1µ

11 ln aRT=∆µ (1a)

U idealnom ratvoru, aktivnost a1 jednaka je molskoj frakciji, tj. a1 ≈ x1

x1 + x2 = 1Aktivnost rastvarača a1 može se izraziti preko molske frakcije rastvorene supstancije x2:

a1 = 1 – x2 (2)

Za idealne razblažene rastvore (n1 > n2, V1 > V2), dalje se može pisati

ln (1-x2) ≈ -x2 (3)

lna1= ln (1-x2) ≈ -x2 (3a)

Tako imamo sledeću korelaciju:

П → a1 → x2 → M2

Vrednost a1 se može odrediti na osnovu merenja osmotskog pritiska П.

Diferencijal Gibsove energije izražava se preko promene parcijalne molarne Gibsove energije sa pritiskom, temperaturom i molskom frakcijom xi:

iG

iiiii

i dxxG

dTTG

dPP

GGd )()()(

∂∂

+∂∂

+∂

∂=

iiii adRTdTSdPVGd ln+−=)( iiii ddTSdPVGd µ∆+−= (4)

U osmometriji, hemijski potencijal rastvarača u rastvoru (μ1) izjednačava se sa hemijskimpotencijalom čistog rastvarača ( ) primenom diferencijala pritiska dP.o

1µU izotermskom procesu (dT=0), u ravnoteži ( ), ova razlika pritisaka jednaka je diferencijalu osmotskog pritiska, dΠ.

01 =Gd

Jednačina (4) prelazi u

)(ln 111 µ∆Π dadRTdV −=−=

)(ln 111 µ∆−=−=Π aRTVodnosno (5)

gde je Π osmotski pritisak, a je parcijalna molarna zapremina rastvarača. 1V

Primenom izraza (3a) jednačina (5) prelazi u

21 xRTV =Π (6)

Molska frakcija x2 se prevodi u masenu koncentraiju c2 (g/100 cm3) na sledeći način:

21 xRTV =Π

1

22

11

22

1

22

1

2

21

22 )( V

MxVnMn

VMn

Vm

VVm

c ≈==≈+

=

2

2

1

2Mc

Vx

=

(6)

(7)

Izražavanjem iz (7) i uvođenjem u (6) dobija se van’t Hoff-ova jednačina:

2202lim

MRT

cc=

Π→

koja govori da je redukovani osmotski pritisak Π/c2 (J/kg) obrnuto srazmeran molarnoj masi M2rastvorka pri beskonačnom razblaženju (c2 → 0).

Osmometrijski se određuje srednja brojna molarna masa

Prednosti metode su: daje apsolutnu vrednost , nema potrebe za kalibracijom standardima, primenljiva je na polimere širokog opsega molarnih masa (~10.000−2 ×106). Najniža vrednost opsega određena je karakteristikama membrane (propustljivošću), a gornja granica opsega određena je najmanjim osmotskim pritiskom koji može da se meri.

nM

(8)

nM

1V

2202lim

MRT

cc=

Π→ (8)

Grafik Π/c u zavisnosti od c, prema ovoj jednačini, daje karakterističnu pravu liniju sa nagibom 0(slika 7, prava X). Molarna masa M2 rastvorene supstancije određuje se iz odsečka prave na y osi ekstrapolacijom na c2 =0 (odsečak je . Samo pri niskim koncentracijama u tzv. teta rastvorima (tj. na Florijevoj θ-temperaturi) Π/c2 ne zavisi od koncentracije (prava X, slika 7 ).

Slika 7. Zavisnost redukovanog osmotskogpritiska od koncentracije c, za poli(metilmetakrilat) u različitim rastvaračima na 20 oC:

-m-ksilen (X) je teta rastvarač (A2 = 0);

-u 1,4-dioksanu (D) A2>0 dok je A3=0 (dobarrastvarač);

-za hloroform (C) postoje i drugi i treći virijalnikoeficijent (dobar rastvarač)

Zajednički odsečak na c2 → 0 jednak je

RTc2

Π

A2 = 0, teta stanje

A2 > 0, A3 = 0

nM1

A2 > 0, A3 > 0

nM1

nM1

Pri većim koncentracijama i usled interakcija polimernih molekula sa rastvaračem, prisutna su značajna odstupanja od idealnosti i grafik Π/c u zavisnosti od c, koji je još uvek prava linija, daje različite nagibe, u zavisnosti od hemijskog sistema (slika 7, prava D). Van’t Hoff-ova jednačina se u tom slučaju modifikuje uvođenjem drugog virijalnog koeficijenta, A2 :

(9)

Drugi virijalni koeficijent A2 je mera odstupanja od idealnosti i zavisi od temperature i rastvarača, za dati polimer.U komplikovanom sistemu, kada su interakcije polimer-rastvarač još jače izražene, u zavisnost Π/c od c uvode se viši virijalni koeficijenti (A3, A4) i ona može da ne bude prava linija. U tom slučaju osmotski pritisak se izražava pomoću virijalne jednačine:

gde je A1 = 1/Mn prvi virijalni koeficijent, a A2 i A3 su drugi i treći virijalni koeficijent.

...)( 2321 +++=

Π cAcAARTc

(11)

Virijalni koeficijenti A2, A3, ... zavise od raspodele molarnih masa rastvorenog polimera, sistema rastvarač-rastvorena supstancija i temperature. Virijalni koeficijenti iza A3 se obično mogu zanemariti.Rastvor sa A2 = 0 zove se teta-rastvor, a za polimer se u tom slučaju kaže da je u teta stanju koje se dobija na određenoj temperaturi, teta-temperaturi za dati rastvarač (koji postaje teta-rastvarač na ovoj temperaturi).

)1( 2 cAM

RTc n

+=Π

Membranska osmometrija omogućava dobijanje informacija o interakcijama polimer-rastvarač na osnovu drugog virijalnog koeficijenta.

Membranski osmometri

Neke uobičajene membrane: celuloza acetat, celuloza hidrat, celuloza nitrat, celulozni estar, poliuretani, poliakrilonitril, poli(hlorotrifluoroetilen).

Helfritz-ovosmometar

Schultz-ovosmometar

Π= ρ1 g hΠ= ρ1 g h

Osmotski pritisak se računa na osnovu izraza:

gde je ρ1 gustina rastvarača (izražena u g/cm3 ), g gravitaciona konstanta, 0,981 m/s2, h je visina u centimetrima (razlika nivoa rastvora u jednoj cevi i rastvarača u drugoj cevi, slike desno).

Statički membranski osmometar

-Ravnoteža se postiže prirodnom difuzijom-Velika zapremina ćelije-Velika vremena za postizanje ravnoteže (~sati)

-Ravnoteža se postiže prirodnom difuzijom-Velika zapremina ćelije-Velika vremena za postizanje ravnoteže (~sati)

Slika 8. Statički osmometri

Dinamički membranski osmometar

-Kod dinamičke osmometrije meri se brzina toka rastvarača i primenjuje kontra-pritisak koji će zaustaviti njegov tok, tj. ravnoteža se postiže smanjenjem pritiska na rezervoar sa rastvorom polimera-Mala zapremina ćelije-Kratka vremena postizanja ravnoteže (10-30 min)

-Kod dinamičke osmometrije meri se brzina toka rastvarača i primenjuje kontra-pritisak koji će zaustaviti njegov tok, tj. ravnoteža se postiže smanjenjem pritiska na rezervoar sa rastvorom polimera-Mala zapremina ćelije-Kratka vremena postizanja ravnoteže (10-30 min)

Meri Mn od 10,000 do 2,000,000 g/mol

Osmomat 090 (Gonotec)

Kretanje vazdušnog mehura unutar kapilaresmeštene neposredno ispod ćelije sa rastvaračemkoristi se kao indikacija (mera) brzine toka rastvarača. Takvo kretanje se detektuje fotoćelijom koja je kuplovana sa servo-mehanizmom koji kontroliše tok rastvarača. Pritisak u delu sa rastvaračem se direktno menja promenom visine rezervoara rastvarača, a razlika pritisaka između dva odeljka, sa rastvorom i rastvaračem, je osmotski pritisak koji se može računati merenjem promene visine. Slika 9. Dinamički osmometar

Problemi/nedostaci kod membranske osmometrije su u najvećoj meri prouzrokovani samom membranom-npr. asimetrijom membrane, brzom degradacijom membrane (usled dejstva nekih rastvarača), prisustvom rastvorenog vazduha (obavezno degasiranje rastvora i rastvarača pre unošenja u ćeliju), prolaskom molekula malih molarnih masa kroz membranu (što vodi većim vrednostima M od stvarnih) - metoda nije pogodna za polimere sa velikom polidisperznošću.

a) b)

SEM fotografije membrana od a) celuloze, b) celuloza nitrata

Određivanje molarne mase i veličine makromolekulametodom rasejanja svetlosti

Metoda koja koristi rasejanje svetlosti je glavna tehnika za određivanje srednje masene molarne mase makromolekula. Tehnika je bazirana na optičkoj heterogenosti rastvora polimera a razvio je nobelovac Peter Debye na osnovama Rayleigh-eve teorije za gasove.Na osnovu Debye-eve teorije merenje intenziteta rasejane svetlostikoristiti se za određivanje molarne mase makromolekula u razblaženimrastvorima a takođe i za određivanje njihove veličine i oblika.

Metoda koja koristi rasejanje svetlosti je glavna tehnika za određivanje srednje masene molarne mase makromolekula. Tehnika je bazirana na optičkoj heterogenosti rastvora polimera a razvio je nobelovac Peter Debye na osnovama Rayleigh-eve teorije za gasove.Na osnovu Debye-eve teorije merenje intenziteta rasejane svetlostikoristiti se za određivanje molarne mase makromolekula u razblaženimrastvorima a takođe i za određivanje njihove veličine i oblika.

Rasejanje svetlosti znači odstupanje zraka od njegovog pravolinijskogputa usled nailaska na neregularnosti sredine kroz koju se prostire,prisustva čestica, hrapavosti površine.Rasejana svetlost prostire se u svim pravcima.

Rasejanje svetlosti znači odstupanje zraka od njegovog pravolinijskogputa usled nailaska na neregularnosti sredine kroz koju se prostire,prisustva čestica, hrapavosti površine.Rasejana svetlost prostire se u svim pravcima.

Ovde je od interesa Rejlijevo rasejanje − to je elastično rasejanje svetlosti molekulima odnosnočesticama koje su mnogo manje od talasne dužine upadne svetlosti.

Intenzitet Rejlijevski rasejane svetlosti zavisi od veličine i oblika čestica koje rasejavaju iobrnuto je proporcionalan λ4. To znači da se kraće talasne dužine vidljive svetlosti (plava ilubičasta) rasejavaju jače nego veće talasne dužine (prema crvenoj oblasti vidljivog dela spektra).Ovaj tip rasejanja je razlog za plavu boju neba u toku dana i narandžaste tonove neba u toku izlaskai zalaska sunca (svetlost se rasejava na molekulima vazduha, kapljicama vode i česticama prašine).Fenomen rasejanja svetlosti prouzrokovan je fluktuacijama u indeksu prelamanja sredine(koje su posledica fluktuacija gustine) na molekulskom ili supramolekulskom nivou.

r -rastojanje od dipola do posmatrača, θ - ugao između ose dipola i pravca posmatranja

θθ

=

oIrIR

2

Rejlijev odnos

intenzitet rasejane svetlosti

intenzitet upadne svetlostiNapomena: postoje dva generalna slučaja. U prvom, kada su čestice organizovane u regularne nizove kao što je to slučajkod kristala, zračenje će biti difraktovano, tj. rasejanje se primećuje samo na određenim uglovima, dok za sve druge uglovepostoji destruktivna interferencija zraka rasejanih sa različitih tačaka u nizu (difrakcija X-zraka na kristalima). Međutim, ako čestice (molekuli, atomi) nisu organizovane u regularne nizove, rasejanje se uočava na svim uglovima. Generalno, promena intenziteta rasejane svetlosti sa uglom daće informaciju o veličini struktura.

Upadna svetlost može se izraziti pomoću jednačine

−=

λνπ xtEE o 2cos

gde je E jačina električnog polja, Eo amplituda upadnog talasa, ν frekvencija svetlosti u rastvoru, t vreme.

λν c

=

1871. Rayleigh je pokazao da kada upadna svetlost padne na molekul u gasu, raspodela elektrona u molekulu se remeti i kao rezultat nastaje polarizacija molekula, koji sada deluje kao indukovani oscilujući dipol p. Ovaj dipol osciluje u fazi sa upadnim poljem. Prema Maxwell-ovoj teoriji, ovaj oscilujući dipol postaje sekundarni izvor zračenja amplitude Es. Indukovani dipol je povezan sa električnim poljem relacijom:

−==

λνπαα xtEEp o 2cos

Drugi izvod oscilujućeg dipola u odnosu na vreme, d2p/dt2, opisuje električnu jačinu rasejane svetlosti:

( )222

242cos νπ

λνπα

−=

xtEdt

pdo (1)

Ako je upadna svetlost ravanski polarizovana, rasejana svetlost se može izraziti u formi:

2

22 )sin()/(

cr

dtpdEs

θ

= (2)

Unošenjem izraza (1) za d2p/dt2 u jednačinu (2), dobija se

−=

λνπθανπ xt

rcEE o

s 2cossin42

22(3)

gde je α polarizabilnost molekula

gde je θ ugao između p i r

Pošto je merljiva veličina kod svetlosnog talasa intenzitet (I), konvertuje se E u I. Intenzitet svetlosti je količina energije koja pada na jedinicu površine po jedinici vremena:

2EcI oε= (4) E (=) N/Cεo = 8,85418 x 10–12 C2 N-1 m-2.I (=) J m-2 s-1

Ovde je usrednjeno polje u periodu vibracije od t = 0 do t = 1/ν.

Odnos intenziteta rasejane svetlosti I i intenziteta upadne svetlosti Io je

2

2222

2

2

)]/(2cos[)}/(2cos]/)sin4{[(

λνπλνπθανπ

xtExtrcE

EE

II

o

os

o −

−==

(5)

Nakon skraćivanja dobija se Rejlijeva jednačina za ravanski polarizovanu upadnu svetlost, za gasove:

Ukoliko je upadni snop nepolarizovan, jednačina (5) se modifikuje u:

2)cos1(16 2

24

24 θλ

απ +

r=

oII

(6)

E

24

224

0

sin16rI

Iλ

θαπ=

Upadni zrak

Orijentacija oscilujućeg dipola p i vektora r položaja posmatrača za vertikalno polarizovani upadni zrak(p je u pravcu z ose).U ovom slučaju uvek je sinθ=1,nema ugaone zavisnostiRejlijevog odnosa.

Ugaona zavisnost Rejlijevog odnosa postoji za horizontalno polarizovano ili nepolarizovano upadno zračenje

Debajeva fluktuaciona teorija prilagođava Rejli-jevu teoriju (koja je primenljiva nagasove) na tečne sisteme (rastvore).U tečnom rastvoru postoji fluktuacija koncentracije u elementu zapremine. Fluktuacija koncentracije rezultuje fluktuacijom polarizabilnosti . Otuda, da bi se Rejlijeva jednačina rasejanja primenila na rastvore, potrebno je modifikovati parametar α.Za gasove važi p = α E, dok je za rastvore Ep 2α∆=

c∆ 2α∆

Fluktuacija polarizabilnosti povezana je sa fluktuacijom koncentracije izrazom:

22

2

22

4c

dcdnno ∆

=∆

πα

gde je no indeks prelamanja rastvarača na talasnoj dužini λ, n je indeks prelamanja rastvora polimera,c je koncentracija rastvora polimera, a dn/dc je porast indeksa prelamanja sa koncentracijom i određuje se iz nagiba zavisnosti n od c za dati par rastvarač-polimer. Fluktuacija koncentracije je

VNMccA

=∆ 2 c-masena koncentracija rastvora, g/mlM-molarna masa, g/mol

(7)

(8)

Jednačina rasejanja za rastvore je

24

224

0

)(sin16

r

V

II

λ

θαπ ∆= V-zapremina rastvora

(9)

Unošenjem (9) i (10) u (8) i preuređivanjem dobija se jednačina rasejanja za ravanski-polarizovanu upadnu svetlost za rastvore:

(10)

A

o

o NcMdcdnn

IrI

4

22222 )(sin)/(4λ

θπ=

(11)

Ako upadna svetlost nije polarizovana, jednačina (11) se modifikuje do oblika

)cos1()(sin)/(2 24

22222θ

λθπ

+=Ao N

cMdcdnnIrI

(12)

Ako upadna svetlost nije polarizovana i ugao θ = 90o, jednačina je:

Ao NcMdcdnn

IrI

4

2222 )/(2λ

π= (13)

Uvođenjem konstante K koja je jednakaAN

dcdnnK 4

222 )/(2λ

π=

jednačina (13) postaje

cMKIrIRo

==2

θ

odnosnoMR

cK 1=

θ

(14)

Ako ponašanje rastvora nije idealno, jednačina rasejanja svetlosti ima sledeću formu:

...321 232 +++= cAcA

MRcK

θ(15)

Molarna masa može se dobiti kao recipročna vrednost odsečka na ordinati grafika Kc/Rθ = f(c). Nagib prave Kc/Rθ = f(c) predstavlja dvostruku vrednost drugog virijalnog koeficijenta A2.

Jednačina (15) je izvedena pod pretpostavkom da su rasejavajuće čestice male u poređenju sa λ. Ako ovo ne važi, kao što je slučaj kod makromolekula, javlja se dis-simetrija rasejanja. Različiti delovi makromolekula izloženi su upadnoj svetlosti različite amplitude i faze. Rasejana svetlost je sačinjena od talasa koji dolaze sa različitih delova čestice i interferiraju jedan sa drugim, tzv. unutrašnja interferencija (postoji više tačaka rasejavanja na istom makromolekulu). Generalno rešenje koje opisuje raspodelu rasejane svetlosti za velike čestice (dimenzija ~ λ/20) je složeno:

Jednačina (15) je izvedena pod pretpostavkom da su rasejavajuće čestice male u poređenju sa λ. Ako ovo ne važi, kao što je slučaj kod makromolekula, javlja se dis-simetrija rasejanja. Različiti delovi makromolekula izloženi su upadnoj svetlosti različite amplitude i faze. Rasejana svetlost je sačinjena od talasa koji dolaze sa različitih delova čestice i interferiraju jedan sa drugim, tzv. unutrašnja interferencija (postoji više tačaka rasejavanja na istom makromolekulu). Generalno rešenje koje opisuje raspodelu rasejane svetlosti za velike čestice (dimenzija ~ λ/20) je složeno:

...32)(

1 232 +++= cAcA

PMRcK

w θθ

(16)

Funkcija rasejanja P(θ) (“particle scattering factor”) zavisi od oblika čestica (sfere, statist. klupka, štapići, diskovi...) i povezana je sa radijusom žiracije izrazom:

...)2(sin)3()16(1)(

1 212220

2 ++= − Lθλπθ

snP

(17)

P(θ) =1 za polimerenižih molarnih masa

Slika 10.. Prikaz omotača rasejane svetlosti (“light scattering envelope”). U slučaju malih rasejavajućih čestica (a) rasejavajući omotač ima 4 jednaka kvadranta. U slučaju velikih rasejavajućih čestica, čija se dimenzija približava λ/20 (b) javlja se dissimetrija rasejanjausled interferencije, rasejavajući omotač više nije simetričan i za taj slučaj važi jednačina (16).

Količnik rasejavanja na uglu 45 o sa rasejavanjem na 135 o naziva se faktor dissimetrije (Z). Kada se nacrta grafik Z u funkciji koncentracije polimera i uradi ekstrapolacija do c=0, odsečak na ordinati predstavlja redukovani faktor dissimetrije, Zo, koji je povezan sa funkcijom rasejanja P(θ) .

Radijus žiracije se pored rastojanja kraj-do-kraja lanca koristi za opis veličine makromolekula (nasumičnog klupka). On predstavlja koren srednjeg kvadrata rastojanja elemenata lanca od njegovog centra gravitacije. Definiše se izrazom:

2/12S

gde mi predstavlja masu i-tog elementa lanca (atom, atomska grupa, jedinica...), a ri njegovo rastojanje od centra mase (C):

Radijus žiracije

∑∑

=

ii

iii

m

rm

S

2

2

Kod linearnih lanaca je povezan sa relacijom:2/12S 2/12R

Zimm-ov metod određivanja wMU eksperimentu rasejanja svetlosti, analizira se serija polimernih rastvora različitih koncentracija, i intenzitet rasejane svetlosti se meri kao funkcija ugla θ. Za svaku koncentraciju rastvora crta se grafik zavisnosti Kc/Rθ(leva strana jednačine 15) od sin2θ/2 + kc, gde je k proizvoljna konstanta (slika 2).

Kc/Rθ u funkciji od sin2θ/2 + kc daje rektilinearne grafike kao na slici 2, tzv. Zimm-ov dijagram, koji omogućava ekstrapolaciju na c = 0 i θ = 0, gde je P(θ)=1.Za svaku koncentraciju, podaci Kc/Rθ se ekstrapolišu do ugla θ =0. Slično, za svaki ugao merenja vrši se ekstrapolacija do koncentracije c =0. Odsečak na y osi daje recipročnu vrednost od . wM

Slika 11. Zimm-ov dijagram, dobijen variranjem koncentracije polimera c i ugla merenja θ. Odsečak na ordinati je recipročna vrednost . Radijus žiracije , koji je mera veličine makromolekula,može se dobiti iz nagiba 1, a drugi virijalni koeficijent iz nagiba 2 (A2 je jednak polovini nagiba ekstrapolisanih podataka za ugao θ=0).

wM

Nagib 1= (16π2 )/3λ2

Nagib 2 = 2A2

2S

2/12S

Slika 12. Multi-angle light scattering (MALS) - instrument za merenje apsolutne srednje masene molarne mase Mm , veličine i konformacije (oblika) makromolekula u rastvoru.

18 uglova120 mW LaserOpseg molarnih masa: 103 do > 109 g/molOpseg veličina makromolekula (R): 10 nm do > 500 nm

MALS meri intenzitete rasejane svetlosti na svakom od uglova detekcije. MALS prevazilazi probleme koji se javljaju kod LALS detektora (low angle light scattering detector) kao npr. taj da je šum veći oko 10 puta na uglu od 11° (ili manjem) nego na uglu od 90° i omogućava tačnije merenje rasejane svetlosti. Količina rasejane svetlosti se zatim korelira sa molarnom masom.MALS takođe određuje veličinu makromolekula izraženu kao "radius of gyration„ (radijus žiracije).

Savremeni fotometri kojima se meri intenzitet rasejane svetlosti i određuje Mm koriste kao izvor zračenja laser koji daje monohromatsku svetlost velikog intenziteta.