TEMA :Metoda cromatografiei gaz-lichide i aplicarea ei n analiza
chimico-toxicologic Material informativ
Efectele cromatografice au fost cunoscute din cele mai vechi
timpuri. nc pe timpul lui Aristotel oamenii dedurizau apa de mare,
filtrnd-o prin anumite pmnturi.
Metoda cromatografic, ca metod tiinific de separare i analiz a
substanelor, a fost elaborat de savantul rus M.S.vet, n anul 1903.
Cu ajutorul acestor metode vet a stabilit, c pigmentul verde al
plantelor clorofila, care se consider omogen, este ntr-adevr
alctuit din cteva substane. Trecnd extractul frunzei verzi printr-o
coloan umplut cu praf de cret i splndu-l cu solveni organici vet a
obinut cteva zone colorate, fapt care mrturisea incontestabil
despre prezena n extract a ctorva substane. Ulterior acest fapt a
fost confirmat i de ali cercettori. Aceast metod a fost numit
cromatografie (grec chromatos - culoare) dei nsui autorul a
demonstrat posibilitatea separrii i a substanelor incolore.
n 1941 Martin i Synge bazndu-se pe fenomenul deja cunoscut ei
ncearc separarea aminoacizilor, folosind o coloan umplut cu
silicagel saturat cu ap, iar faz mobil folosesc cloroform amestecat
cu adausuri din ce n ce mai mari de alcool n-butilic. Astfel apare
cromatografia de separare pe coloan.
n 1944 Gordon i Martin pun bazele cromatografiei pe hrtie.
Tehnica de lucru simpl face, ca cromatografia pe hrtie s se
dezvolte i s se aplice la separarea amestecurilor de substane
organice i ulterior la cele anorganice.
Datorit rapiditii aceast metod ofer informaii printr-un efort
minim.
Cromatografia de gaze s-a dezvoltat datorit perfectrii
detectorilor, folosirii diferitelor faze staionare i mobile
noi.
Clasificarea metodelor cromatografice
Metodele cromatografice de separare fac parte din metodele de
separare, bazate pe echilibrul ntre faze. n aceste metode este
valorificat diferena ntre proprietile de separare a componenilor
amestecului ntre dou faze de contact i nemescibile. Clasificarea
general a metodei cromatografice este n funcie de natura fazelor
(I), procesele, care au loc la separare (II) i modul de efectuare
(III)(fig.1). Metodele de separare i analiz cromatografic nu sunt
specifice. n procesul de analiz cromatografic se ia n consideraie
natura fazelor, ce urmeaz a fi folosite, prezena compuilor care
interfer cu compuii analizai. n alte cazuri este necesar izolarea
unor compui necunoscui n vederea caracterizrii lor ulterioare, sau
analiza complet a unui amestec complex, necunoscut, prin separarea
componenilor, urmat de analiz de structur i determinrii
cantitative.
Tehnicile de separare au fost create n funcie de proprietile
amestecurilor n limite extrem de mari), volatilitate i alte
proprieti.
Complexitatea tehnicilor de separare este corelat cu proprietile
componenilor de separat. n cazul izomerilor optici separarea lor
poate fi realizat cu tehnici speciale. n alte cazuri proprietile
sunt att de diferite nct separarea poate fi realizat printr-o
tehnic simpl (distilare).
Dup ce componenii din amestec au fost separai se poate alege
metoda adecvat de determinare. Clasificarea metodelor
cromatografice
Fig. 1. Schema clasificrii metodelor cromatografice
Dinamica proceselor cromatografice
Determinarea parametrilor de retenie
Separarea cromatografic se bazeaz pe distribuia diferit a
componenilor unui amestec ntre dou faze nemescibile, dintre care
una este staionar i poate fi lichid, solid sau n forma de gel, iar
alt este mobil i poate fi n stare gazoas sau lichid. Distribuia
componenilor amestecului de analizat ntre cele dou faze se
realizeaz, n general, prin diverse procese fizice (sorbie-desorbie,
excluziune steric), fizico-chimice (repartiie,
dizolvare-eliminare), chimice (schimb ionic, precipitare,
complexare, oxido-reducere etc.). Cantitativ repartiia componenilor
amestecului analizat, ntre cele dou faze e determinat de raportul
dintre cantitatea de component n faza staionar i mobil i se numete
constant de distribuie a componentului n sistemul dat:
CS
K =
(1)
Cmunde: K constanta de distribuie:
CS i Cm concentraia (sau cantitatea) total a tuturor formelor
unui component analizat, prezent la echilibru n faza staionar i
mobil respectiv.
n funcie de procesul predominant la separare, cnd componentul
analizat e prezent numai ntr-o anumit form n ambele faze deosebim
constant de repartiie constanta de adsorbie etc. n acest caz
procesele secundare sunt neglijabile. Aceste constante se noteaz i
se calculeaz analogic constantei de distribuie, iar CS i Cm
reprezint concentraia (sau cantitatea) de component ntr-o anumit
form n ambele faze.
K depinde de natura fazelor, t0 , pH, fora ionic a soluiei (dac
faza mobil este lichid) etc.
Substana este introdus pe coloan cu faza mobil. Ea se transport
(se reine) n faza staionar total sau parial, fie prin adsorbie,
repartiie, excluziune, reacie chimic etc. Tot odat substana reinut
deja n faza staionar contacteaz ncontinuu cu noi porii de faz mobil
i total sau parial se transfer din nou n faza mobil. Faza mobil
deplaseaz ncontinuu substanele analizate pe un sector nou unde iari
din nou se realizeaz acelai act elementar de echilibru.
Fie c urmeaz s separm, pe o coloan cromatografic, un amestec din
doi componeni A i B. Cantitatea de substan n faza mobil i staionar
va fi corespunztor: [A]m, [B]m i [A]S, [B]S. Din momentul
introducerii amestecului pe coloan, la interfaa dintre cele dou
faze nemescibile n conformitate cu legea echilibrului chimic, se
stabilesc echilibre dinamice pentru fiecare component. Pentru
fiecare component A i B vom avea coeficientul de distribuie KA i
KB, respectiv (fig.2).
Fig.2. Coloana cromatografic. Schema de formare a zonei de
component n metoda de eluie i repartiyarea sub stanei n zona de
component
Cu ct componentul se reine mai mult ntr-o faz cu att i
concentraia lui va fi mai mare n aceast faz i mai mic n cealalt
faz, i invers. De exemplu, dac componentul A se reine mai mult n
faza staionar dect componentul B, atunci, coeficientul respectiv de
distribuie vor ndeplini relaia: KA > KB.
Orice separare cromatografic se caracterizeaz prin factorul de
retenie (sau retenia) R, care este raportul dintre viteza de
migrare a componentului (VZ) i viteza de migrare a fazei mobile
(eluentului) (V) n faza staionar dat:
VZ
R =
(2)
V
Valoarea numeric a lui R este subunitar (0 < R < 1). n
condiii extreme, dac VZ = 0, atunci R = 0 i substana este
totalmente reinut pe coloana dat. Dac VZ = V, atunci R = 1 i
substana este purtat de faza mobil fr a interaciona cu faza
staionar.
Retenia depinde de coeficientul de distribuie a substanei date.
Dac R reprezint fracia moleculelor componentului ce se afl n faza
mobil, atunci 1-R va reprezenta fracia moleculelor aflate n faza
staionar la echilibru. Prin urmare se poate scrie:
CS 1 R
1
K =
= R =
(3)
Cm R
K + 1
Din expresiile (2) i (3) obinem:
V
VZ =
(4)
K + 1
De aici rezult, c factorul de retenie i viteza de migrare a
substanei prin coloan sunt invers proporionale cu constanta de
distribuie a ei.
Viteza de migrare a substanei prin coloan poate fi definit ca
raportul dintre lungimea coloanei parcurs de substana dat (L) i
timpul de reinere a substanei (tR) pe coloana dat:
L
VZ =
(5)
tRLund n consideraie expresia (4) obinem:
L (K+1)
tR =
(6)
V
Deoarece lungimea coloanei i viteza fazei mobile n condiiile
date sunt mrimi constante, timpul de reinere este direct
proporional cu constanta de distribuie i fiind uor msurabil,
servete ca parametru de retenie n analiza calitativ cromatografic i
se numete timp de retenie.
Timpul de retenie poate fi definit ca timpul n care substana dat
a eluat (s-a deplasat) prin coloana de la momentul introducerii i
pn la detecia concentraiei maxime la ieirea ei din coloan.
Alt parametru de retenie utilizat n cromatografie este volumul
de retenie (reinere) total (V2), care poate fi definit ca volumul
de eluent msurat de la introducerea probei pe coloan i pn la ieirea
concentraiei maxime a componentului de pe coloan.
Volumul de retenie (VR) e proporional cu timpul de retenie
(tR):
VR = tR ( F (7)
unde F este viteza volumetric a gazului purttor.
Parametrii de retenii (tR, VR) depind de natura fazelor, de
presiunea fazei mobile, masa fazei staionare, pH, t0, parametrii
geometrici ai coloanei etc. Dar asupra acestor mrimi pot influena i
diferii factori ocazionali.
Pentru componenii A i B parametrii de retenie se vor afla n
urmtoarele relaii:
KA > KB
VA < VB
tR (A) > tR (B)
(8)
VR (A) > VR (B)
Prin urmare, componenii amestecului analizat, avnd coeficieni de
distribuie diferii se vor deplasa n procesul eluiei cu diferite
viteze i vor avea un timp de reinere diferit, n condiiile date. n
rezultat se va realiza separarea componenilor pe coloana dat.
Constanta de distribuie este factorul principal, care determin
separarea substanelor pe coloana cromatografic. Cu ct mai mare va
fi diferena dintre valorile constantelor de distribuie, cu att mai
efectiv va fi separarea cromatografic n condiiile date.
Cromatografia poate fi definit ca un proces dinamic bazat pe
realizarea multipl a actelor de echilibru la distribuia
componenilor amestecului n cele dou faze nemescibile ce vin n
contact.
n cromatografia de gaze separarea componentelor dintr-un amestec
complex se realizeaz ntre o faz mobil gazoas i o faz staionar solid
(CGS) sau lichid (CGL). Mecanismul separrii poate fi un proces de
adsorbie (CGS) sau de repartiie (CGL).
CG permite att separarea substanelor volatile (stabile la
temperatura lor de volatilizare) ct i a celor care n urma unor
reacii chimice (derivatizare) pot fi transformate n derivai
volatili i stabili.
Faza mobil este constituit dintr-un gaz inert: He, Ar, Ne, H2,
numit i gazul vector (purttor), care antreneaz substanele de
determinat.
Faza fix (staionar) este format dintr-un adsorbent (CGS) sau
dintr-un suport inert granulos (0,15-0,18 mm) impregnat cu un
lichid de impregnare - puin volatil sau lichid selectiv (CGL). Faza
fix se gsete tasat n coloan sau depus pe pereii unor coloane
capilare.
Aparatul i principiile de lucru
n figura 3 este prezentat schema de principiu a unui cromatograf
de gaze de tipul Crom-5. Componentele eseniale ale cromatografului
cu gaz purttor, care are rolul de faz mobil (1); reductor de
presiune (2); usctor purificator (3); blocul de control fin (4);
debitmetru (5); dispozitiv de injectare pentru introducerea probei
(6); dou coloane montate paralel (7); detectorul (8) i imprimanta
(11). Dispozitivul de injectare, coloanele i detectorul sunt
amplasate n cuptoare cu reglare i control automatizat al
temperaturii.
Fig. 3. Schema de principii a cromatografului de gaze
ntr-un cromatograf gazul vector care provine de la sursa de gaz
reglat la un anumit debit de reglatorul de debit traverseaz camera
de injectare a probei i antreneaz substanele volatile spre coloana
cromatografic. Volumul cuprins ntre capul de injectare i captul
coloanei trebuie s fie ct mai mic posibil. O metod mai nou const n
injectarea direct n coloan, la 1-2 cm umplutur. Din coloan curentul
de gaz este introdus n detector. Detectorul transform diferena unei
proprieti fizice dintre componentele probei i gazul purttor ntr-un
semnal electric, proporional cu concentraia componenilor din faza
gazoas i se produce un semnal, care se nregistreaz cu ajutorul unui
integrator, ordinator . nregistratorul traseaz o curb n form de
clopot. Reprezentarea grafic a semnalelor detectorului n funcie de
timp, poart denumire de cromatogram (fig.4).Picul
cromatografic.Parametrii de baz i mrimile derivate Picul este
seciunea cromatogramei semnalizat de detector la apariia
componentului n gazul purttor; n cazul separrii incomplete, n
acelai pic pot aprea mai multe componente. n gaz-cromatogram se
definete linia de baz a cromatogramei seciunea de cromatogram, care
se nregistreaz cnd din coloan iese numai gazul purttor.
Baza picului este distana BD dintre limitele sale extreme. Aria
(S) a picului reprezint suprafaa mrginit de curb i de baz. nlimea
(h) a picului este distana dintre maximul picului i baz, msurat
paralel cu axa pe care se nregistreaz semnalul detectorului. Limea
B1D1 a picului este distana dintre interseciile tangentelor duse n
punctele de inflexiune cu baza. 0,5 - reprezint lrgimea curbei la
jumtatea nlimii piculu.
Componentele probei se separ din coloan i o prsesc una dup alta
ntr-o anumit ordine, dup intervale de timp determina
Factorii care condiioneaz separarea gaz-cromatografic sunt:
1. natura izotermei de repartiie;
2. volumul i principiile de injectare n coloan a probei de
analizat;
3. natura gazului vector;
4. programarea temperaturii i a debitului de eluant;
5. natura fazelor;
6. tipul de detector.
Forma picului cromatografic depinde de tipul izotermei de
adsorbie. La temperatur constant adsorbia se mrete la creterea
presiunii gazului ori concentraiei soluiei.
Izoterma de adsorbie este dependena cantitii substanei adsorbite
de presiunea gazului purtrrttor sau concentraia soluiei la
temperatur constant. (fig.6)
Fig.6.Diferite tipuri de iz oterme
Faza mobil gazul purttor. n mod obinuit n cromatografia de gaze
drept faz mobil se folosete heliu sau azot. Aceste gaze sunt
folosite n majoritatea cazurilor, deoarece ndeplinesc urmtoarele
condiii:
faza mobil trebuie s fie inert
faza mobil trebuie s aib un pre de cost redus, deoarece se
folosesc cantiti mari.
faza mobil trebuie s permit ca detectorul s rspund ntr-un mod
adevrat.
n calitate de rezervor pentru faza mobil se folosete o butelia
pentru gaze rezistent la presiune nalt. La ea se ataaz un regulator
de presiune pentru a reduce i controla curgerea gazului prin coloan
i un debitmetru, pentru a controla debitul de gaz.
Natura gazului vector are un rol nsemnat, ea poate influena
timpii reteniei a componentelor sau, prin adsorbia acestuia pe
suprafaa fazei staionare, i modific proprietile. Alegerea
eluantului se face n funcie de sensibilitatea detectorului, de
interaciunea acestuia cu componentele de separat, cu faza
staionar.
n cromatografia cu gradient de temperatur componentele se
distribuie n coloan pe direcia gradientului n funcie de
volatilitatea lor (cele mai puin volatile la intrare, cele mai
volatile la ieire).
n cromatografia cu programare de temperatur o temperatur
constant pe toat lungimea coloanei variaz n timp dup o funcie
liniar sau neliniar.. Faza staionar solid n CGS este constituit din
adsorbeni de tipul: silicagel, crbune activ, site moleculare.
Separarea se bazeaz pe un proces de adsorbie. Eficacitatea separrii
crete prin impregnarea adsorbantului cu mici cantiti de lichid
nevolatili (siliconi) sau cu gaze care se adsorb ireversibil (CO2,
H2O, H2S). Mai recent se utilizeaz coloane mplute cu polimeri
organici cu porozitate mare, sub form de perle, de exemplu din
seria Porapak (etilvinilbenzen-divinilbenzen). Acetia servesc n
special la analiza apei, alcoolilor, gazelor cu masa molecular mic
i amestecurilor lichide.
n scop analitic se utilizeaz coloane de 1-1,5 m lungime i 3-6 mm
diametru, care pot fi confecionate din metal, sticl sau material
plastic i au form de U sau de spiral.
Dintre suporii utilizai amintim cei de tip diatomit (Chromosorb
P) Kieselgur (Chromosorb G,W, Sterchamol) polifluoretilena
(Fluoropak-80, perle de sticl). n cazul coloanelor capilare, rolul
suportului l joac pereii capilarelor, pe care se depune un strat
subire de suport solid, care ulterior va fi impregnat cu faza
lichid.
Capacitatea de separare a fazei staionare lichide, n cazul
amestecurilor depinde de raportul tensiunilor de vapori a
componenilor ct i de tria legturilor ce apar ntre moleculele
componentelor i cele ale fazei staionare. Deosebim legturi ionice,
Van der Waals, legturi de hidrogen sau cu transfer de sarcin.
Pentru separarea componentelor cu puncte de fierbere foarte
diferite, se pot utiliza combinaii de dou sau mai multe coloane n
serie sau n paralel, cu un singur, respectiv cu doi detectori (ex.
Coloana cu faz lichid nepolar Squalan i una polar Carbowax).
Detectori. n cromatografia de gaze, pentru depistarea
componentelor, care ies de pe coloan se folosesc detectorii. n
funcie de proprietatea msurat deosebim:
detectori de ionizare (detectori de ionizare n flacr, detectori
cu captur de electroni);
detectori care msoar o proprietate fizic de volum (detector de
conductibilitate termic);
detectori optici (flamfotometru, spectrofotometru);
detectori electrochimici. Clasificai n alt mod, detectorii pot
fi: universali, selectiv, specifici.
Condiiile generale pentru detectori sunt: sensibilitatea,
stabilitatea, fiabilitatea i emiterea unui semnal liniar pentru
anumit domeniu de concentraie a probei.
Detectorul de conductibilitate termic (DCT) sau catarometrul are
cel mai rspndit domeniu de utilizare (fig10). El face parte din
categoria detectorilor universali. Este un detector nedestructiv i
poate fi utilizat i n cromatografia preparativ.
Principiul de funcionare se bazeaz pe msurarea diferenei de
conductibilitate termic ntre component i eluent. n acest scop se
folosete un montaj electronic, cu dou sau patru celule de
conductibilitate termic. n figura 12 este redat schema unui montaj
cu patru celule. Dou din celule sunt splate continuu cu gaz purttor
(R1 i R4 celule de referin), celelalte dou sunt splate de amestecul
binar care iese din coloan (R2 i R3 celule de msur). Constructiv
celulele nu pot fi realizate identice. Pentru echilibrarea iniial a
punii se folosete poteniometrul 4. Filamentele detectorului sunt
confecionate dintr-un material a crui rezisten electric variaz
foarte mult n funcie de temperatur. n timpul funcionrii,
filamentele sunt nclzite de trecerea unui curent continuu
stabilizat, de la o surs de curent 1. Stabilirea curentului de
lucru se face cu un poteniometru 2 i se msoar cu miliampermetrul
3.
Temperatura detectorului, n procesul de lucru trebuie s fie mai
nalt dect temperatura coloanei. Att timp ct la ieirea din coloana
cromatografic va aprea numai gazul purttor, rezistenele celulelor
vor fi aceleai, puntea va fi echilibrat i instrumentul de msur
montat va indica 0.
n registrtorul 5 va fi trasat linia zero. Prezena unui component
n eluentul, care circul prin celula de msur modific
conductibilitatea termic a mediului gazos din aceast celul. n
rezultat se modific rezistena electric a filamentelor R2 i R3, care
provoac dezichilibrul punii. Intensitatea curentului nregistrat la
dezichilibrarea punii este proporional cu concentraia componentului
care iese din coloan.
Mrimea semnalului detectorului depinde de diferina dintre
conductibilitatea termic a componentului i eluentului.
Conductibilitatea termic a substanelor depinde de masa molecular
ei. Hidrogenul, heliul i azotul, avnd mase moleculare mici posed
conductibiliti termice ridicate. Aceste gaze sunt ideale pentru a
fi folosite ca gaze purttoare n cromatografia de gaze.
Sensibilitatea detectorului depinde de factorul geometric al
celulelor (dimensiunile, raza, lungimea filamentului) i de valoarea
curentului de alimentare a punii. Sensibilitatea crete la mrirea
curentului n punte.
Creterea curentului peste o anumit valoare poate duce la
distrugerea filamentelor i de aceea valoarea lui este limitat de
natura gazului purttor i de temperatura de lucru a
detectorului.
Linia zero este sensibil la variaiile debitului de gaz purttor i
al temperaturii Ppentru ca variaiile temperaturii s fie ct mai mici
blocul metalic al detectorului trebuie s aib o mas ct mai mare, iar
celulele s fie dispuse simetric n detectori.
Detectorul de ionizare n flacr (DIF) este un detector universal,
stabil i simplu n construcie. Principiul de funcionare a
detectorului cu ionizare n flacr de hidrogen const n msurarea
conductibilitii electrice a unei flcri de hidrogen n prezena unui
compus organicDeterminri calitative
Aprecierea calitativ a unei gaz-cromatograme care prezint un
numr de picuri se face n mod obinuit prin:
1) examinare vizual, n comparaie cu gaz-cromatograma unei probe
etalon;
2) compararea timpului (tR) sau a volumului de reinere (VR) a
probei de determinat cu a etalonului-pur, cromatografiat n condiii
identice, sau cu datele menionate n literatur pentru compusul
respectiv;
3) compararea cromatogramei amestecului de determinat cu
cromatograma aceluiai amestec, la care s-a adugat substana etalon
care se bnuiete a fi prezent n prob. Dac picul unui component apare
mrit pe a doua cromatogram, acesta este un indiciu al prezenei, n
amestec, a substanei adugate probei; n caz contrar, substana adugat
d un pic nou pe cromatograma a doua;
4) identificarea componentelor se mai poate realiza cu ajutorul
detectorilor specifici; DCE se utilizeaz pentru identificarea
compuilor cu afiniti diferite pentru electroni (alcooli, eteri,
esteri, derivai carbonici, derivai halogenai). Spectrometrul de mas
nregistreaz spectrul de mas (SM) al componentelor prezente n
fraciunea de eluant introdus n sursa de ioni a spectrometrului, cu
nregistrarea concomitent a cromatogramelor obinute prin trecerea
celeilalte fraciuni printr-un detector universal (CT);
5) identificarea prin sorbie sau reacie selectiv se realizeaz
prin intercalarea ntre injector i coloana de separare a GC a unei
coloane umplute cu adsorbant, sau absorbant specific unei anumite
clase de substane, sau a unui microreactor n care are loc
transformarea sau reinerea prin reacie chimic a unui component.
Timpul de retenie (reinere) brut (tR), exprimat n secunde sau
minute, este timpul care se scurge ntre momentul introducerii
probei n injector i timpul cnd picul atinge maximul.
Timpul relativ (tR) este timpul de retenie al unui component (i)
n raport cu al unui component etalon (e) : tRi / tRe.
Timpul de retenie corectat este dat de diferena dintre timpul de
retenie brut (tR) i timpul la care se separ eluantul sau un
component nereinut pe coloan (ideal) i al componentului respectiv:
Rx= tR /tRx. Factorul de retenie are valori cuprinse ntre 0,01-0,9,
n cazul unei separri optime, cnd valoarea se apropie de 1, nseamn c
acel component X, prsete coloana odat cu eluantul.
De aici se definete i factorul de separare, pentru doi componeni
A i B:
tR(A)
(AB) = --------- , care trebuie s aib valori 1
(11)tR(B)Eficacitatea coloanei
O importan deosebit n prezentarea teoretic a procesului
cromatografic de separare o au dou teorii. Teoria Talerului
teoretic i teoria cinetic.
Teoria talerului teoretic a fost propus de Martin i Synge.
Conform acestei teorii coloana cromatografic se mparte imaginar
ntr-un ir de segmente elementare talere i se presupune, c pe
fiecare taler se realizeaz un act elimentar de echilibru la
distribuia substanei n faza staionar i faza mobil. Fiecare porie
nou de faz mobil purttoare (gaz sau lichid) provoac o deplasare a
acestui echilibru, n urma cruia o parte de substan se deplaseaz pe
urmtorul taler, pe care la rndul su, se stabilete un nou echilibru
distributiv i are loc trecerea substanei pe urmtorul taler. n urma
acestor procese substana supus cromatografiei se distribuie pe
cteva talere. Concentraia substanei pe talere din mijloc este maxim
n comparaie cu talerele invecitate.
Talerul teoretic poate fi definit ca un segment imaginar din
coloana cromatografic n care se realizeaz un echilibru elementar
complet de distribuie a componentului dintre cele dou faze
nemiscibile, care vin n contact n procesul separrii
cromatografice.
Talerul teoretic din coloana cromatografic este analogic
talerului teoretic dintr-o coloan pentru distilare fracionat.
Deosebirea const n aceea, c componena amestecului, care ese de pe
coloana cromatografic ncontinuu se schimb dar n procesul de
extracie ori distilare se poate de obinut pe parcursul ntregului
proces una i aceeai substan.
Numrul talerelor teoretice pentru componentul dat i pentru
lungimea coloanei date difer de numrul talerelor teoretice pentru
ali componeni n aceleai condiii. Numrul talerelor teoretice este
direct proporional cu lungimea i diametrul coloanei.
Numrul de talere N este un numr adimensional i se numete
eficiena coloanei cromatografice, H i n parametrii teoretici, care
caracterizeaz eficacitatea de separare a coloanei cromatografice i
determin dispersia zonelor de component.
Cu ct coloana va avea mai multe talere teoretice pe o unitate de
lungime i cu ct nlimea echivalent unui taler teoretic va fi mai
mic, cu att mai efectiv va fi coloana pentru separare n condiiile
date. Aa dar, condiiile eficacitii de separare pe coloana
cromatografic sunt :
H s obin valori ct mai mici i N ct mai mari.
Dac vom raporta lungimea stratului de faz staionar (L) n care
s-a produs separarea amestecului de substane la nlimea talerului
teoretic, vom obine numrul de talere teoretice (N) necesare pentru
separarea amestecului dat de coloana dat (formula 12).
L
N=
H
Teoria talerelor teoretice presupune realizarea procesului
cromatografic n trepte, dar n realitate procesul decurge
incontinuu. Aceast teorie ne permite s se calculeze parametrului
cantitativi importani pentru caracterizarea procesului
cromatografic de separare. Aceti parametri i menin importana i n
teoria cinetic a cromatografiei, care ine cont de viteza de migrare
a substanei, difuzie i ali factori cinetici, care caracterizeaz
cantitatea procesului.
Analiza cantitativ n cromatografie se bazeaz pe stabilirea unei
relaiei dintre mrimea semnalului dat de detector i cantitatea de
compus prezent n prob. Semnalul detectorului este msurat prin
nlimea sau aria picului. Aria picurilor poate fi calculat conform
relaiilor).
s = h(0
s = h(0
s = h(0,5
s = 2,507 h (Aria picului poate fi msurat cu ajutorul
planimetrului, poate fi apreciat dup greutatea fiilor de hrtie
tiate dup conturul picurilor. n prezent n acest scop se folosesc
integratoare electronice i microcomputere, care nregistreaz foarte
rapid i exact orice mrime de pe cromatogram.
Metodele principale n analiza cromatografic cantitativ sunt:
a) metoda standardului intern, n prob cu o compoziie cantitaiv
necunoscut se introduce preventiv o cantitate exact de substan
cunoscut, care nu se conine n amestecul dat, nu interacioneaz
chimic cu componentele amestecului i este stabil la temperatura la
care se efectueaz analiza. Proprietile fizico-chimice ale substanei
adugate (standardului intern) trebuie s fie asemntoare proprietilor
componentelor amestecului cercetat. Partea de mas (XI) a fiecrui
component (n %) se determin din relaia:
Si ( r
Xi = ( 100
Sstunde Si i Sst sunt ariile picurilor componentului analizat i
standardului, corespunztor; r raportul masei standardului intern
ctre masa probei:
masa standardului
r =
masa amestecului de analizat fr standard
b) metoda normrii ariilor. Aceast metod presupune, c suma
tuturor ariilor picurilor corespunztoare componentelor amestecului
cercetat constituie 100 %. Partea de mas (Xi) a componentului i (in
%) se determin din urmtoarea relaie:
Si
Xi = n=i ( 100 % (41)
( Sic) metoda etalonrii absolute. Se prepar i se cerceteaz o
serie de soluii standard. Se determin experimental dependena nlimii
sau suprafeei picului de concentraia substanei i se traseaz curba
de etalonare. Apoi se determin aceeai parametri ai picurilor ai
amestecului de analizat i din curba de etalonare se determin
concentraia substanei analizate. Aceast metod simpl i exact este
principal metod de determinare a microimpuritilor. Metoda nu
necesit o separare a tuturor componenilor amestecului, dar se
limiteaz la analiza componentului studiat n amestecul concret.
. La baza determinrilor cantitative st relaia de
proporionalitate ntre aria de sub picul cromatografic i cantitatea
componentului eluat. Cheia acestor metode const n msurarea ariei i
stabilirea acestei proporionaliti.
1) Msurarea ariei se poate face pe mai multe ci:
Msurarea ariilor este nlocuit uneori cu msurarea integral a
nlimii picului (h), sau a jumtii ei (h/2) (figf. 7).
n cazul picurilor simetrice aria se msoar prin metoda produsului
dintre limea picului (determinat la nlimii picului) i nlimea lui
(perpendicular cobort din vrf pe linia de baz) (fig.7) sau din aria
triunghiului format de linia de baz cu tangentele duse n punctele
de inflexiune ale picului:
h y
A = --------
2
Aria este proporional cu masa picului decupat i cntrit, cu
condiia ca grosimea hrtiei s fie uniform.
Ariile se mai pot determina automat, utiliznd n acest scop un
integrator mecanic sau un computer.
2) Corelarea datelor obinute cu compoziia cantitativ a probei.
Dintre metodele care stabilesc relaiile pentru transformarea i
corelarea corect a ariilor cu concentraia componentelor,
amintim:
a) Metoda standardului extern: se realizeaz ntr-un mod asemntor
curbei de etalonare din spectroscopie. Cantiti cunoscute de
prob-etalon se cromatografiaz; se msoar ariile corespunztoare
picurilor i se ntocmete curba de etalonare, care are nregistrat n
ordonat valoarea ariilor (mm2) i n abscis concentraia.((g).
b) Metoda standardului intern const n introducerea unui
standard, (substan de referin) n cantitate cunoscut, n proba de
analizat. Drept standard intern se poate utiliza o substan pur,
care s se elueze cu o rezoluie bun, cu un timp de reinere apropiat
de al componentelor de determinat i care s nu interacioneze cu
acestea. Cunoscnd concentraia standardului intern n prob (Cs) i
msurnd ariile picurilor corespunztoare componentei de determinat
(Ax) i ale standardului (As) se poate calcula concentraia
necunoscut (Cx). n acest scop se ntocmete o curb de etalonare sau
se calculeaz factorul de corecie al ariilor pentru compusul de
determinat (fx).
Curba de etalonare se realizeaz prin cromatografierea a trei
soluii de concentraii exacte din componenta de determinat (C1, C2,
C3), prin dizolvarea ei n soluia standardului intern (Cs). Se
determin, n fiecare caz n parte, raportul ariilor: A1/As; A2/As;
A3/As. Se nscriu aceste valori n ordonata i concentraiile C1, C2,
C3 n abscisa unui sistem de coordonate i se traseaz curba de
etalonare.
Factorul de corecie al ariilor (fx) se poate calcula astfel:
Se face media aritmetic (Vx) a valorilor rapoartelor obinute mai
sus:
V1 + V2 + V3
A1/As = V1; A2/As = V2; A3/As = V3; ---------------- = Vx
3
Pentru fiecare concentraie (C1, C2, C3) se calculeaz raportul:
C1/Vx; C2/Vx; C3/Vx; Media aritmetic a valorilor obinute pentru
aceste trei concentraii, reprezint factorul de corecie mediu, fx,
care intervine n formula de calcul.
Cx (mg/ml) = fx Vx
c) Metoda normrii ariilor. Aceast metod se bazeaz pe faptul c
raportul existent ntre aria corespunztoare picului unui anumit
component SA i suma ariilor tuturor componentelor prezente ( S)
este egal cu procentul de component prezent n amestec. SA
A % = --------------------- 100.
SA + SB + SC + ...
Relaia de mai sus este valabil numai n cazul n care
sensibilitatea detectorului este aceeai pentru toate componentele
probei, n caz contrar se recomand ca etalonarea s se fac n
prealabil cu ajutorul unor factori de corecie.
Concentraia se calcul dup curba de etalonare ori dup
formula:
Setilnitrit
C = ------------ F R 100,
Spropilnitritn care:
C concentraia
S ariile corespunztoare a picurilor
F factorul de corecie a ariilor ori a nlimii picurilor, ce se
determin n raport cu standardul n condiiile experimentului (faza
staionar, to injectorului, to termostatului, detectorului; viteza
gazului vector)
F (factorul) se calcul dup formula:
SstF = ------ C %; 'n care: Sx Sst aria picului standardului
Sx aria picului substanei de analizat
ori
hstF = ------ C %; n carehxSst nlimea picului standardului
Sx nlimea picului substanei de analizat.
C % - concentraia substanei de analizat.
Se calcul F pentru cteva concentraii i apoi se i-a media:
masa standardului
R = -----------------------------------------------------
masa amestecului de analizat fr standard.Cromatografie (C)
Cromatografie de lichide (CL)
Cromatografie de gaze (CG)
Cromatografie gaz solid (CGS)
Cromatografie lichid solid (CLS)
Cromatografie gaz lichid (CGL)
Cromatografie lichid lichid (CLL)
Cromatografie prin excluziune steric
Cromatografie e bazat pe interaciunea cu cmpul: electroforez
Cromatografie de absorbie
Cromatografie de repartiie
Cromatografie bazat pe procese chimice: schimb ionic,
complexare, precipitare, oxido-reducere
Cromatografie capilar
Cromatografie pe strat subire
Cromatografie pe coloan
Fig.7 Forma picului n funcie de tipul
izotermei de adsorbie