TEMA 10 Cultivo y aislamiento de patógenos viables
TEMA 10
Cultivo y aislamiento depatógenos viables
Tema 10. Cultivo y aislamiento de patógenos viables
1. Medios de cultivo2. Preparación de medios de cultivo artificiales3. Condiciones para el aislamiento de patógenos
3.1. Comportamiento de los microorganismos frente al oxígeno3.1.1. Incubación de microorganismos microaerófilos y
capnófilos3.2. Comportamiento de los microorganismos frente a la temperatura3.3. Comportamiento de los microorganismos frente al pH. Tiempo de
incubación4. Medios artificiales
4.1. Ejemplos de medios de aislamiento primario4.1.1. Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA)4.1.2. Agar CLED (cistina, lactosa, deficiente en electrolitos)
4.2. Ejemplos de caldos de enriquecimiento4.2.1. Caldo selenito
4.3. Ejemplos de medios enriquecidos4.3.1. Agar sangre
4.4. Ejemplos de medios diferenciales4.4.1. Agar de MacConkey4.4.2. Agar salino manitol (SM)
Tema 10. Cultivo y aislamiento de patógenos viables
4. Medios artificiales (continuación)4.5. Ejemplos de medios selectivos
4.5.1. Agentes inhibidores4.5.2. Agar entérico de Hektoen (HE)4.5.3. Agar alcohol fenil etílico (PEA)
4.6. Medios cromogénicos5. Recuento de patógenos
5.1. Mediante la técnica de estría en placa5.2. Mediante la utilización de asa calibrada
6. Cultivo de patógenos intracelulares obligados
Regla de oro de la Microbiología
Muestra
Cultivo y aislamiento de microorganismos
Cultivo puro
Identificación
Realización pruebas susceptibilidad
Etapa limitante en la rapidez del diagnóstico microbiológico
1. Medios de cultivo
¿Qué es un medio de cultivo?
1. Medios de cultivo
• Preparación
• Esterilización– Autoclave– Tindalización– Filtración– Luz UV– Horno a 180 ºC– Óxido de etileno
• Adición de sustanciastermolábiles
• Vertido en placas de Petri (medios sólidos) o tubos (medios líquidos o medios sólidos)
2. Preparación de medios de cultivo artificiales
• Medio de cultivo
– No exigentes: nutrientes (C, N, S, P), sales, tampón.
– Exigentes: nutrientes más sustancias complejas (sangre, suero,
huevo, patata, factor X, factor V, vitaminas).
• Condiciones de incubación
– Atmósfera
– Temperatura
– Humedad
– Tiempo de incubación
– pH
– Ausencia de factores inhibidores o antagonistas del crecimiento
3. Condiciones para el aislamiento de patógenos
• Aerobios
– Anaerobios facultativos
• Anaerobios
• Microaerófilos
– Frascos con vela
– Agar semisólido
• Capnófilos
– Atmósfera de CO2
– Sistemas GasPak, Bio Bag
(bicarbonato y ácidos)
– Utilización de estufas de CO2
3.1. Comportamiento de los microorganismos frente al oxígeno
A: Aerobios obligadosB: MicroaerófilosC: Anaerobios facultativosD: Anaerobios estrictos
Crecimiento
3.1.1. Incubación de microorganismos microaerófilos y capnófilos
• Temperatura de incubación
35-37 ºC
30 ºC
• Otras temperaturas
Elevadas (42 ºC)
Bajas (4ºC) enriquecimiento en frío
Intermedias (22 ºC)
3.2. Comportamiento de los microorganismos frente a la temperatura
3.3. Comportamiento de los microorganismos frente al pH. Tiempo de incubación.
• pH
• Tiempo de incubación
• Medios de aislamiento primario (medios de crecimiento o medios nutritivos)
• Medios enriquecidos
• Caldos de enriquecimiento
• Medios diferenciales
• Medios selectivos
• Medios cromogénicos
4. Medios artificiales
• Agar nutritivo
• Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA)
• Agar triptona soja (TSA)
• Agar sangre
• Agar chocolate
• Agar CLED (urocultivo)
• Caldo con carne picada
4.1. Ejemplos de medios de aislamiento primario
Componentes
Extracto de cerebro
Extracto de corazón
Peptona
Glucosa
Tampón fosfato
NaCl
Agar
Cantidad
7,8 g/L
9,7 g/L
10 g/L
2 g/L
2,5 g/L
5 g/L
15 g/L
Propiedad
Fuente de nutrientes
Fuente de nutrientes
Fuente de proteínas
Hidrato de carbono
Regulación pH
Estabilizador osmótico
Agente solidificante
Medio rico, no selectivo, permite crecimientode la mayoría de microorganismos no exigentes.
Ausencia de agentes inhibidores.
4.1.1. Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA)
Componentes Cantidad
Digerido pancreático de gelatina 4 g/LDigerido pancreático de caseína 4 g/LExtracto de carne 3 g/LLactosa 10 g/LL-cistina 0,128 g/LAzul de Bromotimol 0,02 g/LAgar 15 g/L
La lactosa es el único carbohidrato presente. Permite diferenciar losfermentadores de lactosa de los no fermentadores gracias a la presenciadel indicador azul de bromotimol que vira a color amarillo a pH ácido.
Debido a su deficiencia en electrolitos, no permite que las colonias de Proteus invadan la placa de cultivo, lo que facilita el recuento.
La cistina facilita el crecimiento de los coliformes.
4.1.2. Agar CLED (cistina, lactosa, deficiente en electrolitos)
• Caldo selenito Salmonella
• Caldo tetrationato Salmonella y Shigella
• Caldo para Gram negativos Salmonella y Shigella
Se debe subcultivar en medios más selectivos al cabo de unas horas
4.2. Ejemplos de caldos de enriquecimiento
Componentes
Peptona
Lactosa
Selenito de sodio
Fosfato de sodio
Cantidad
5 g/L
4 g/L
4 g/L
10 g/L
Propiedad
Fuente de proteínas
Fuente de carbono
Agente inhibidor de la mayoría de enterobacterias, incluyendo muchas especies de Shigella
Tampón
Enriquecimiento de especies de Salmonella en muestras de heces, aguas fecales, etc.
Subcultivar al cabo de 8-12 horas en medio más selectivo (Agar SS o Agar sulfito de bismuto).
4.2.1. Caldo selenito
Agar base de Columbia + 5% sangre desfibrinada
Componentes Cantidad
Peptona 5 g/LTripteína 12 g/LExtracto de levadura 3 g/LExtracto de corazón (buey) 3 g/LAlmidón soluble 1 g/LCloruro sódico 5 g/LAgar 15 g/L
Medio rico y diferencial.
La sangre más comúnmente utilizada es la de oveja, al 5%, estéril y desfibrinada.
Una vez preparado el medio de cultivo, se enfría hasta 45ºC y se le añade la sangre.
4.3. Ejemplo de medios enriquecidos
4.3.1. Agar sangre
Beta hemólisisLisis completa de los glóbulos rojosHalo transparente alrededor de la colonia
Alfa hemólisis
Lisis parcial de los glóbulos rojosSe abren poros en la membranaSalida de hemoglobina al medioOxidación del grupo hemoFormación de biliverdina (color verdoso)Halo verdoso alrededor de la colonia
CARACTERÍSTICAS DE LA BETA Y ALFA HEMÓLISIS
4.3.1. Agar sangre
β
α
• Agar sangre
• Agar CLED
• Agar EMB
• Agar de MacConkey
• Agar SS
• Agar entérico de Hektoen (HE)
• Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)
• Agar salino manitol (SM)
4.4. Ejemplos de medios diferenciales
Componentes
Peptona
Polipeptona
Lactosa
Sales biliares (conc. moderada)
Cristal violeta
NaCl
Rojo neutro
Agar
Cantidad
17 g/L
3 g/L
10 g/L
1,5 g/L
0,001 g/L
5 g/L
0,03 g/L
13,5 g/L
Propiedad
Fuente de proteínas
Fuente de proteínas
Azúcar fermentable
Inhibidor de Gram positivos
Inhibidor de Gram positivos
Estabilizador osmótico
Indicador de pH
Agente solidificante
Aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos Gram negativos fermentadores y no fermentadores de la lactosa.
4.4.1. Agar de MacConkey
Colonias rojas/rosa
Fermentadores de lactosa
No patógenos (E. coli, Citrobacter)
Patógenos (Klebsiella, Enterobacter)
Colonias transparentes/blancas
No fermentan la lactosa
Patógenos (Salmonella, Shigella, Yersinia, Proteus)
Precipitación en el medio
Fermentadores fuertes de lactosa
(E. coli, Enterobacter)
4.4.1. Agar de MacConkey
Medio de Chapman
Componentes Cantidad
Extracto de levadura 2,5 g/LTriptona 10 g/LGelatina 30 g/LLactosa 2 g/LManitol 10 g/LCloruro sódico 75 g/LFosfato dipotásico 5 g/LRojo fenol 0,025 g/LAgar 15 g/L
Se pueden distinguir los estafilococos que fermentan el manitol de los que no lo fermentan gracias al rojo fenol que vira a color amarillo en medio ácido.
La mayoría de los microorganismos no crecen a una concentración de cloruro sódico del 7,5%, mientras que los estafilococos sí lo hacen.
4.4.2. Agar salino manitol (SM)
• Moderadamente selectivos
– MacConkey Enterobacterias
– EMB Enterobacterias
• Altamente selectivos
─ Agar salino manitol Staphylococcus
─ Agar SS Salmonella y Shigella
─ Agar entérico de Hektoen (HE) Salmonella y Shigella
─ Agar sulfito de bismuto Salmonella y Shigella
─ Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) Salmonella y Shigella
─ Agar alcohol fenil etílico (PEA) Gram positivos
4.5. Ejemplos de medios selectivos
• Colorantes (azul de metileno, cristal violeta, verde brillante, eosina)
• Antibióticos
• Metales (Se, Bi)
• Sales biliares
• Azida
• Alcoholes (alcohol feniletílico)
• Sales (cloruro sódico a alta concentración)
4.5.1. Agentes inhibidores
Componentes
Peptona
Extracto de levadura
Sales biliares (alta conc.)
Lactosa
Sacarosa
NaCl
Tiosulfato de sodio
Citrato férrico amónico
Azul de timol
Agar
Cantidad
12 g/L
3 g/L
9 g/L
12 g/L
12 g/L
5 g/L
5 g/L
1,5 g/L
0,04 g/L
14 g/L
Propiedad
Fuente de C y N
Fuente de N
Inhibidor de Gram positivos
Azúcar fermentable
Azúcar fermentable
Estabilizador osmótico
Fuente de azufre
Fuente de hierro
Indicador de pH
Agente solidificante
Aislamiento y diferenciación de especies de Salmonella y Shigella de otros bacilos entéricos Gram negativos en muestras fecales.
4.5.2. Agar entérico de Hektoen (HE)
Las colonias de los fermentadores de lactosa (E. coli, Klebsiella, Enterobacter) se ven de color amarillo-naranja. Las de los no fermentadores se ven incoloras.
Salmonella tiene un punto negro central por la producción de sulfhídrico (sulfuro de hierro precipitado). La mayoría de las especies de Shigella no producen sulfhídrico.
4.5.2. Agar entérico de Hektoen (HE)
Componentes
Extracto de carne
Triptosa
Feniletanol
Cloruro de sodio
Agar
Cantidad
3 g/L
10 g/L
2,5 g/L
5 g/L
15 g/L
Propiedad
Fuente de C y N
Fuente de N
Inhibidor de Gram negativos
Estabilizador osmótico
Agente solidificante
Aislamiento de microorganismos Gram positivos, especialmente estafilococos y estreptococos, a partir de diversas muestras con microbiota mixta.
La adición de alcohol fenil etílico inhibe o reduce drásticamente el crecimiento de bacterias Gram negativas porque inhibe la síntesis de ADN. Además, previene la proliferación de colonias invasivas tipo “swarming”.
El alcohol fenil etílico es un antimicrobiano, antiséptico y desinfectante que también se utiliza como esencia aromática y preservativo en farmacia y perfumería.
Las placas de este medio recién preparadas huelen a rosas.
4.5.3. Agar Alcohol Feniletílico (PEA)
4.5.3. Agar Alcohol Feniletílico (PEA)
Cuando a este medio se le adiciona sangre de oveja al 5%, se convierte en un excelente medio para el aislamiento de bacterias anaerobias presentes en muestras clínicas donde hay una microbiota abundante y heterogénea que contiene bacterias Gram negativas de crecimiento rápido tal como Proteus.
Medios altamente selectivos y diferenciales.
Incorporan sustratos incoloros que se transforman en productos con color (cromogénicos) tras actuar sobre ellos una enzima específica.
Detección de actividades enzimáticas características de determinados géneros o especies de bacterias.
β- galactosidasa
β- glucosidasa
β- glucuronidasa
ONPG ONP + galactosa
Incoloro Amarillo
β- galactosidasa
La producción de un color característico permite la identificación.
4.6. Medios cromogénicos
Ejemplos de medios cromogénicos
• Agar CPS-ID3
• Chromogenic UTI
• CHROMAgar Orientation
• URI Select 4
4.6. Medios cromogénicos
Estimación del número de microorganismos en la muestra original en función del crecimiento:
• Escaso
• Moderado
• Abundante
5. Recuento de patógenos
5.1. Mediante la técnica de estría en placa
5.2. Mediante la utilización de asa calibrada
• Crecen sólo dentro de células (clamidias, ricketsias, virus)
• No se ha encontrado un medio completamente artificial para su desarrollo
– Legionella pneumophila (Agar BCYE)
• Cultivos de tejidos en el laboratorio
6. Cultivo de patógenos intracelulares obligados
Cultivos primarios (nº cromosomas=2n)
– Células de riñón– Fibroblastos
Líneas celulares continuas (aberraciones en el nº de cromosomas, aneuploidía)
– Hep-2, HeLa, Vero (Virus, ensayos de toxicidad Clostridium difficile)– McCoy (Clamidias)– A-549, RD, MDCK (Virus)
6. Cultivo de patógenos intracelulares obligados