Laboratorio de Toxicología PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 41 DETERMINACIÓN DEL MECANISMO DE ACCIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE COMPUESTOS DE ORIGEN NATURAL OBJETIVO ACADÉMICO Que el alumno sea capaz de determinar el mecanismo de acción mediante el cual un compuesto de origen natural ejerce efecto antioxidante. PROBLEMA Determinar el mecanismo antioxidante de una sustancia química a través de la realización de las pruebas de: 1. Inhibición de la Xantina oxidasa, 2. Captura del radical superóxido, 3. Captura de peróxido de hidrógeno y 4. Captura de radical hidroxilo. REACTIVOS Xantina (Xan) Solución amortiguadora de carbonatos* Xantina oxidasa (XO) Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) Nitroazul de tetrazolio (NAT) Nitrato de cobre (II) (Cu(NO 3 ) 2 ) Sulfato de amonio y hierro (II) hexahidratado (Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 6H 2 O) Peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) Ácido hexenóico Ácido sulfúrico (H 2 SO 4 ) Naranja de xilenol (NX) Butil hidroxitolueno (BHT) Vainillina Ácido ferúlico Alopurinol *Ver APÉNDICE II MATERIAL POR EQUIPO DE 6 PERSONAS 12 Tubos Eppendorf de 1.5 mL 1 gradilla para tubos Eppendorf 1 micropipeta de 100-1000 Pl 1 espátula de cromo níquel 1 micropipeta de 10-100 Pl 1 nave de pesado 1 celda para la región visible (desechable) 2 matraces aforados de 250 mL 1 celda para la región U.V. (cuarzo) 1 pipeta 1 mL 2 matraces aforados de 10 mL 1 pipeta 10 mL 2 vasos de precipitados de 25 mL BORRADOR, COLEGIO DE PROFESORES TOXICOLOGÍA, FQ UNAM
Practica 2 y 3 del laboratorio de Toxicologia, Facultad de quimica
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A) Ensayo de inhibición de la Xantina oxidasa empleando el sistema Xantina-Xantina oxidasa
(Xan-XO)
1. Los profesores indicarána cada equipo el antioxidante a evaluar.
2. Marcar 3 tubos Eppendorf como control negativo (C-), control positivo (C+), antioxidante, y blanco para
antioxidante.
3. Para los antioxidantes ácido ferúlico, alopurinol y vainillina preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 1,
siguiendo el orden de adición indicado en la columna titulada “reactivo”.
Tabla 1. Preparación de los tubos problema y control
Tubo Reactivo
Control negativo (PL)
Control positivo (PL)
Blanco para antioxidante
(PL)
Antioxidante (PL)
a. Xantina 1.5mM 100 100 100 100 b. EDTA 0.115mM 100 100 100 100 c. Solución amortiguadora
de carbonatos 84 mM pH=10.19
900 600 800 500
d. Solución acuosa de antioxidante 650PM - - 100 100
e. XO* - 300 - 300 VOLUMEN TOTAL 1100 1100 1100 1100
f. Agitar e Incubar ** 20 min 20 min 20 min 20 min * Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C durante 20 min.
4. Para el antioxidante BHT preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 2, siguiendo el orden de adición
Tabla 2. Preparación de los tubos problema y control para BHT
Tubo Reactivo
Control negativo (PL)
Control positivo (PL)
Blanco para BHT (PL)
BHT (PL)
a. Xantina 1.5mM 100 100 100 100 b. EDTA 0.115mM 100 100 100 100 c. Solución amortiguadora de
carbonatos 84 mM pH=10.19 850 550 800 500
d. Metanol 50 50 - - e. Solución de BHT en
metanol/amortiguador de carbonatos (1:2) 650PM
- - 100 100
f. XO* - 300 - 300 VOLUMEN TOTAL 1100 1100 1100 1100
g. Agitar e Incubar ** 20 min 20 min 20 min 20 min * Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C durante 20 min.
5. Transcurrido el tiempo de incubación leer el contenido de los tubos a 295 nm con celda de cuarzo,
empleando el contenido del tubo Control negativo como blanco para medir el Control positivo. Para
mayor comprensión, leer espectrofotométricamente el contenido de los tubos en el orden numérico
que se indica en la Tabla 3.
Tabla 3. Orden de lectura para la determinación de ácido úrico
Orden de lectura Blanco Muestra a leer
1 Control negativo (-)
2 Control positivo (+)
3 Blanco para antioxidante
4 Antioxidante
6. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del control positivo representa
el 100% de producción de ácido úrico en el sistema Xan-XO de acuerdo a la siguiente fórmula.
% inhibición de la XO = 100 - [(AM) x 100/AC+] En donde: AM= absorbancia de la muestra que contiene antioxidante
7. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como
R1.
8. Lavar las puntas de pipeta y tubos Eppendorf empleados con metanol, jabón y agua destilada;
secarlos y entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el
contenedor R1
B) Ensayo de captura de radical superóxido (O2x-) empleando el sistema Xantina-Xantina
oxidasa-Nitroazul de tetrazolio (Xan-XO-NAT)
1. Marcar 3 tubos Eppendorf como control negativo (C-), control positivo (C+), y antioxidante.
2. Para los antioxidantes ácido ferúlico, alopurinol y vainillina preparar los tubos de acuerdo a la Tabla
4, siguiendo el orden de adición indicado en la columna titulada “reactivo”.
Tabla 4. Preparación de los tubos problema y control para determinación de captura de radical superóxido (O2
x-)
Tubo Reactivo
Control negativo
(PL)
Control positivo
(PL)
Antioxidante (PL)
a. Xantina 1.5Mm 100 100 100
b. EDTA 0.115Mm 100 100 100 c. Solución amortiguadora de carbonatos 84
mM pH=10.19 600 300 200
d. NAT 0.1 M 300 300 300 e. Solución acuosa de antioxidante 650PM - - 100 f. XO* - 300 300
VOLUMEN TOTAL 1100 1100 1100 g. Agitar e Incubar ** 20 min 20 min 20 min h. Cu(NO3)2 1.3 mM 200 200 200
VOLUMEN TOTAL FINAL 1300 1300 1300 * Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C. 3. Para el antioxidante BHT preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 5, siguiendo el orden de adición
indicado en la columna titulada “reactivo”. BORRADOR, C
Tabla 5. Preparación de los tubos problema y control para determinación de captura de
radical superóxido (O2x-) empleando BHT
Tubo Reactivo
Control negativo
(PL)
Control positivo
(PL)
Antioxidante BHT (PL)
a. Xantina 1.5mM 100 100 100
b. EDTA 0.115mM 100 100 100 c. Solución amortiguadora de carbonatos 84
mM pH=10.19 550 250 200
d. Metanol 50 50 - e. NAT 0.1 M 300 300 300 f. BHT en metanol/amortiguador de carbonatos
(1:2) 650PM - - 100
g. XO* - 300 300 VOLUMEN TOTAL 1100 1100 1100
h. Agitar e Incubar ** 20 min 20 min 20 min i. Cu(NO3)2 1.3 mM 200 200 200
VOLUMEN TOTAL FINAL 1300 1300 1300 * Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C. ¤Los profesores indicarán el antioxidante a evaluar 4. Transcurrido el tiempo de incubación leer el contenido de los tubos a 560 nm empleando como
blanco el contenido del tubo etiquetado como control negativo.
5. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del control positivo representa
el 100% de formazán generado en el sistema Xan-XO-NAT de acuerdo a la siguiente fórmula.
% de captura del radical superóxido= 100 - [(AM) x100/A C+] En donde: AM= absorbancia de la muestra que contiene antioxidante A C+= absorbancia del control positivo
6. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como
R1.
7. Lavar las puntas de pipeta y tubos Eppendorf empleados con metanol, jabón y agua destilada;
secarlos y entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el
C) Ensayo de Captura de peróxido de hidrógeno (H2O2) y radical hidroxilo (x-OH) empleando
el método de FOX2 modificado.
1. Enjuagar con metanol los 5 tubos Eppendorf y marcarlos como blanco, control positivo H2O2,
control positivo x-OH, Captura H2O2 y Captura x-OH.
2. Preparar los tubos de acuerdo a la siguiente tabla, siguiendo el orden de adición indicado en la
columna titulada “reactivo”.
�
Tabla 6. Preparación de los tubos problema y control
Tubo Reactivo
blanco (PL)
Control positivo
H2O2 (PL)
Control positivo x-OH (PL)
Captura H2O2 (PL)
Captura x-OH (PL)
a. FOX-MeOH 900 900 900 - - b. FOX-Antioxidante - - - 900 900 c. Ácido hexenóico - - 40 - 40 d. H2O 100 80 40 80 40 e. H2O2* - 20 20 20 20
VOLUMEN TOTAL 1000 1000 1000 1000 1000 f. Agitar e Incubar ** 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min
* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C. 3. Transcurrido el tiempo de incubación leer el contenido de los tubos a 560 nm empleando como
blanco el contenido del tubo etiquetado como blanco.
4. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del tubo marcado como control
positivo de H2O2 representa el 100% del peróxido de hidrógeno adicionado al sistema y el tubo
marcado como control positivo x-OH representa el 100% del radical hidroxilo generado en el
sistema.
% de captura de peróxido de hidrógeno (H2O2) = 100 - [(AM) x100/AC+H2O2] En donde: AM= absorbancia del tubo marcado como “Captura de H2O2” AC+H2O2 = absorbancia del tubo marcado como “control positivo H2O2”
% de captura de radical hidroxilo (x-OH) = 100 - [(AM) x100/A C+x-OH ] En donde: AM = absorbancia del tubo marcado como “Captura de x-OH”
AC+x-OH = absorbancia del tubo marcado como “control positivo x-OH” 5. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como
R2.
6. Lavar las puntas de pipeta y tubos Eppendorf empleados con metanol, jabón y agua destilada;
secarlos y entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el
*Calcular el porcentaje de inhibición de XO o Captura de O2x-, H2O2 o x-OH según sea el caso de
acuerdo a las ecuaciones presentadas en cada una de las secciones. 2. De acuerdo a los resultados de la Tabla 1 ¿Cuál es el mecanismo de acción de la muestra de
antioxidante que analizó? Justifique su respuesta.
Cadenas, E. Packer L. Handbook of Antioxidants. Marcel Dekker, Inc., New York, 2002. Klaassen, C.D., Watkins, J.B. Manual de Toxicología de Casarett & Doull: la ciencia básica de los
tóxicos. (5ª ed.) McGraw-Hill, México, 2001. Klassen, C.D. Casarett and Doull’s Toxicologia. La ciencia de los venenos. (6a ed.). Ed. Mc Graw
Hill, Interamericana 2001. Jiang, Z.Y., Hunt, J.V., Wolff, S. P. (1991). Ferrous Ion Oxidation in the Presence of Xylenol Orange
for Detection of Lipid Hydroperoxide in Low Density Lipoprotein. Analytical Biochemistry 202, 384-389.
Nourooz-Zadeh, J., Tajaddini-Sarmadi, J., and Wolff S.P. (1994). Measurement of Plasma Hydroperoxide Concentrations by the Ferrous Oxidation-Xylenol Orange Assay in Conjunction with Triphenylphosphine. Analytical Biochemistry 220, 403-409.
Martínez-Flórez, S., González-Gallego, J., Culebras, J. M., y Tuñón, M.ª J. (2002). Los flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes. Nutrición Hospitalaria. XVII, 271�278.
Owena, P.L., Johns, T. (1999). Xanthine oxidase inhibitory activity of northeastern north American plant remedies used for gout. Journal of Ethnopharmacology 64, 149�160.
Södergren, E., Nourooz-Zadeh, J., Berglund, L., Vessby, B. (1998) Re-evaluation of the ferrous oxidation in xylenol orange assay for the measurement of plasma lipid hydroperoxides. J. Biochem. Biophys. Methods 37 137-146.
Tsutomu, K., Susumu, T., Hidetaka, N., et al. (2003). A novel and potent biological antioxidant, kinobeon A, from cell culture off sunflower. Life Sciences 74, 87�97.
Wardman, P., (2007). Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosactive species in cells and tissues: Progress, pitfalls, and prospects. Free Radical Biology & Medicine 43, 995�1022.
World Health Organization monographs on selected medicinal plants. Volume 1. 1999, Geneva. Pp 16-32.
Tabla 2. Prueba de Ames con la Cepa TA 98 para el equipo B
Tratamientos Control negativo
fracción S9
Sólo mutágeno
(por duplicado)
Con S9
(por duplicado)
CÓDIGO Reactivo
C-S9 M1 M2 C/S91 C/S92
1.- Agar de superficie* 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL
2.- Cultivo bacteriano 100 PL - - 100 µL 100 µL
3.- Mutágeno ambiental - 25ȝL 25ȝL 25ȝL 25ȝL
4.- Mezcla S9** 500 PL - - 500 µL 500 µL
*Mantener siempre a 45°C en baño maría **Mantener siempre en hielo. 11. Sacar de la incubadora dos cajas Petri, etiquetar las cajas en la tapa según el código indicado en
las tablas 1 y 2, para cada tratamiento agregando el número de grupo y equipo.
12. Mezclar el contenido de cada tubo en el agitador “vortex”.
13. Verter el contenido de cada tubo en la caja de Petri con medio mínimo de Vogel-Bonner
correspondiente.
14. Desechar los tubos de plástico en la bolsa de residuos colocada en un costado del área de trabajo
y etiquetada como R2.
15. Distribuir cuidadosa y homogéneamente el agar de superficie realizando movimientos circulares.
16. Dejar solidificar las cajas a temperatura ambiente en una superficie plana durante 10 minutos.
17. Repetir los pasos 7 al 15 para los otros dos tratamientos.
NOTA 5: Recordar en todo momento que se está trabajando con compuestos con posible actividad
mutagénica y con un cultivo bacteriano que no es inócuo.
18. Colocar el sobrante de la muestra ambiental en DMSO en el contenedor etiquetado como R3.
19. Fijar las tapas de las cajas Petri a su contraparte con cinta adhesiva e introducirlas de manera
invertida a la incubadora a 37°C por 48 horas.
20. Una vez terminado el tiempo de incubación, guardar las cajas de Petri invertidas en el
Maron, D. & Bruce, A. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research 113 (1980)173-215.
Cortinas, C. & Ostrosky, P. (Editoras) Manual de métodos para la identificación de mutágenos y carcinógenos químicos ambientales, Volumen 1. Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM. México, 1980. Págs. 31-50.
Calderón-Segura, M. E., Gómez-Arroyo, S., Villalobos-Pietrini, R., Butterworth, F. M., Amador-Muñoz, O. The effects of seasonal weather on the genotoxicity, cytokinetic properties, cytotoxicity and organochemical content of extracts of airborne particulates in Mexico City. Mutation Research 558 (2004) 7–17.
Villalobos-Pietrini, R., Hernández-Mena, L., Amador-Muñoz, O., Munive-Colín, Z., Bravo-Cabrera, J. L., Gómez-Arroy, S., Frías-Villegas, A., Waliszewski, S., Ramírez-Pulido, J., Ortiz-Muñiz, R. Biodirected mutagenic chemical assay of PM10 extractable organic matter in Southwest Mexico City. Mutation Research 634 (2007) 192–204.
APENDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS
1. Concepto de contaminación atmosférica.
2. Posibles compuestos mutagénicos existentes en las muestras seleccionadas.
3. Efectos generales que sobre el organismo tienen los contaminantes ambientales.
4. Características generales de solubilidad de dichos compuestos.
5. Fundamento de la prueba de Ames.
6. Concepto de revertante espontánea.
7. Características generales de las cepas Salmonella typhymurium utilizadas en la Prueba de Ames
y especialmente la cepa TA 98.
8. Utilidad del agar de superficie.
9. Importancia del baño de temperatura a 45°C.
10. Finalidad de colocar en el medio una solución que contenga histidina y biotina.
11. Características de la fracción S9 y su utilidad.
12. Numero de colonias revertantes necesarias para considerar un resultado positivo.
13. Precauciones que se deben considerar para obtener resultados óptimos de la prueba en el