Manual de Bioquimica i

LABORATORIO DE BIOQUMICA 1

MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUMICAI ING. ELOISA GUADALUPE CHVEZCAMPOS LABORATORIO DE BIOQUMICA 1 CONTENIDO Pgina Introduccin....................................................................................................... Objetivos de las prcticas................................................................................... Reglamento de laboratorio............................................................................. PRCTICA No. 1 SOLUCIONES AMORTIGUADORAS PRCTICA No. 2 PROPIEDADES FISICO-QUIMICAS DE LOS A.A. PRCTICA No. 3 CUANTIFICACIN DE LAS PROTENAS PRCTICA No. 4 CINTICA ENZIMTICA.. PRCTICA No. 5 FOSFORILACIN OXIDATIVA.. PRCTICA No. 6 ACOPLAMIENTO DE LA FOSFORILACIN OXIDATIVA Y CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES. APENDICE I.PREPARACIN DE SOLUCIONES ESPECIALES BIBLIOGRAFA 2 3 4 10 14 26 31 41 47 51 53 LABORATORIO DE BIOQUMICA 2 INTRODUCCIN Este curso trata se despertar el inters del estudiante por la investigacin, que constituye unapartemuyimportantedelabioqumicamoderna.Paraalcanzaresteobjetivose precisa plantear, controlar y ejecutar buenos experimentos. Seespera,enespecial,queelestudiantesefamiliariceantesconlateoraylosdetalles opeativosdecadaexperimento,porlocualesdesumaimportanciaqueelalumno consultefrecuentementelabibliografadeBioqumica.Porlotanto,elpresentemanual de prcticas, pretende ser un apoyo didctico para los estudiantes quecursan la material de Bioqumica I. Losexperimentosseleccionadostienencomoobjetivolaintegracindelos conocimientosadquiridosenelaula,asmismoalfinaldecadaunadelasprcticasse orientalarealizacindeuninforme.Porestarazn,enelpresentemanualsehan incorporadocuadrosyesquemasenloscualeselalumnopuedeirplasmandosus observaciones,dibujos,conclusiones,clculos,resultados,interpretaciones,etc.,conel objetivo de facilitar la elaboracin del reporte.

El nivel de complejidad va en incremento de forma tal que los experimentos precedentes vanpreparandoalestudianteparaeldesarrollodelosposterioresylashabilidades prcticas se van sistematizando a lo largo de los diferentes laboratorios. En la siguiente seccin del presente manualse describe las normas de seguridad para el laboratorio de bioqumica y ah se mencionan algunas de las acciones que debe realizar el alumno antesy durante la sesin de laboratorio. Por lo tanto antes de empezar cualquier trabajoenlaboratorioserindispensableleereldocumentoantescitado.Deunaforma general algunos de los aspectosrelacionados son: -Lectura previa de la prctica en el manual. -Lectura de material adicional relacionado con el experimento y vinculacin con la teora explicada en clase. -Formular hiptesis en le desarrollo experimental. -Explicacin y/o discusin durante la realizacin de la prctica. -Informe de resultados personal o grupal. -Investigar la naturaleza de los reactivos a utilizar. LABORATORIO DE BIOQUMICA 3 OBJETIVOS DE LAS PRCTICAS -Que el alumno comprenda en cada prctica lo expuesto en las clases tericas -Mediantelaobservacinylaexperimentacinelalumnocomprenderatrabajar conseguridadyprecisin,lomismoqueinterpreterydiscutirlosresultados logrados, basndose en el trabajo experimental. -Desarrollar criterios y habilidades para el diseno de nuevos experimentos. LABORATORIO DE BIOQUMICA 4 REGLAMENTO DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARALABORATORIOS DE LA CARRERA DE ING. BIOQUMICA Este documento forma parte del Manual de Seguridad para laboratorios de la Carrera de Ing. Bioqumica en el ITESI. R1.Elpresentereglamentoesaplicableentodoslostrabajosexperimentales,yaseade docenciaoinvestigacinqueserealicenenloslaboratoriosdelacarreradeIng. Bioqumica dentro del ITESI. R2. Cualquier actividad que se realice en tales laboratorios debe estar supervisada por un responsable, el profesor de la materia o el encargado del laboratorio. R3.Esnecesarioqueelpersonalquetrabajeencadalaboratorioconozcaelsistemade alertamiento, zonas de seguridad, rutas de evacuacin, el equipo para combatir incendios y las medidas de seguridad establecidas. R4. Los laboratorios debern estar acondicionados, como mnimo con: a)Control maestro para energa elctricab)Un botiqun de primeros auxiliosc)Extintores d)Un sistema de ventilacin adecuado e)Agua corriente f)Drenaje g)Un control maestro para suministro de gash)Estacin de regaderas y lavaojos i)Sealamientos de Proteccin Civilj)Guantes y lentes de seguridad k)Mascarillas de seguridad R5.Alrealizaractividadesexperimentales,nuncadeberestarunapersonasolaenlos laboratorios.Elmnimodepersonasdeberser,invariablementededos.Enelcasode que uno de ellos sea alumno, deber estar siempre un profesor o encargado. R6. Al realizar una prctica, los usuarios no deben dejar sus cosas o tiles escolares sobre ellugaromesadetrabajo,estasdebencolocarseenalgnlugarindicadoporel encargado,dondenoobstruyanlalaborexperimental.Sielalumnoutilizacajones, gavetasoarchiverosparaguardarmaterialocosasdevalordebecerrarlo,ellaboratorio no se hace responsable de cualquier prdida. R7. El equipo de proteccin personal que ser usado en los laboratorios. Alumnos : LABORATORIO DE BIOQUMICA 5 1)Bata de algodn 100% 2)Lentesdeseguridad.Encasodelentesgraduados,solicitaralosalumnosque sean de vidrio endurecido e inastillables, y uso de protectores laterales 3)El pelo recogido 4)Guantes en caso de que el experimento lo exija a criterio del profesor 5)Franela de algodn 6)Usar zapato cerrado de piel o de seguridad7)No traer anillos, aretes ni pulseras Profesor: 1)Bata de algodn 100% 2)Lentesdeseguridad.Encasodelentesgraduados,solicitaralosalumnosque sean de vidrio endurecido e inastillables, y uso de protectores laterales 3)El pelo recogido 4)Usar zapato industrial o cerrado de piel Encargado o Laboratorista 1)Bata de algodn 100% 2)Lentesdeseguridad.Encasodelentesgraduados,solicitaralosalumnosque sean de vidrio endurecido e inastillables, y uso de protectores laterales 3)Guantes, cuando se encuentre en contacto con los reactivos4)Pelo recogido 5)Usar zapato industrial o cerrado de piel Ninguna persona podr permanecer en el laboratorio si le falta alguno de los implementos anteriormente descritos. R8.Enloslaboratoriosyanexosdondeserealicenexperimentosquedaprohibido fumar, consumir alimentos o bebidas, el uso de lentes de contacto y el uso de zapatos abiertos (tipo guarache o tenis). R9.Laspuertasdeaccesoysalidasdeemergenciadebernestarsiemprelibresde obstculos,accesiblesyenposibilidaddeserutilizadasantecualquiereventualidad.El responsable del laboratorio deber verificar lo anterior al menos una vez cada semana. R10.Lasregaderasdeberncontarconeldrenajecorrespondiente,funcionar correctamente,aligualquelaestacindelavaojos,estarlomsalejadasposiblesde instalaciones o controles elctricos y libres de todo obstculo que impida su correcto uso. El responsable deber verificar esto, al menos una vez cada semana. LABORATORIO DE BIOQUMICA 6 R11.Loscontrolesmaestrosdeenergaelctricaysuministrodegas,agua,vapory vaco,paracadalaboratorio,debernestarsealadosadecuadamente,demaneratalque sean identificados fcilmente. R12.Encadalaboratorio,deberexistiralalcancedetodaslaspersonasqueenl laboren,unbotiqundeprimerosauxilios.Elresponsabledelreadeberverificarel contenidodelbotiqun,paraprocederareponerlosfaltantesyoenriquecerlosacriterio de los jefes de laboratorio. R13.LosextintorescontraincendiodebernserdeCO2odepolvoqumicosecoy debernrevisarsecomomnimounavezalsemestre,debernrecargarsecuandosea necesariodeconformidadconlosresultadosdelarevisinoporhabersidoutilizados. Durante el tiempo que el extintor est vaco, deber ser removido de su lugar para evitar confusiones en caso de necesitarlo. R14.Lascampanasosistemasdeextraccindegasesdebernmantenersesiempresin obstculosqueimpidancumplirconsufuncin.Asimismodebernseraccionadasal inicio del trabajo experimental, para verificar su buen funcionamiento; en caso contrario, elresponsabledeberavisaramantenimientoyserviciostcnicosparaqueefectenel mantenimiento preventivo o correctivo. R15.Los sistemas de suministro de agua corriente y drenaje debern verificarse a fin de que estn en buen estado; en caso contrario, los responsables de cada rea darn aviso a la coordinacindemantenimientoyserviciostcnicospararecibirelmantenimiento preventivo o correctivo que se requiera. R16.Loslugaresenlosquesealmacenanreactivos,disolventes,equipos,materiales, mediosdecultivoytodoaquellosrelacionadoonecesarioparaqueeltrabajoenlos laboratorios se lleve a cabo, estarn sujetos a este reglamento en su totalidad. R17.Quedaprohibidoarrojardesechosdesustanciasaldrenajeoporcualquierotro medio, sin autorizacin del responsable del rea. El manual de seguridad o los manuales de prcticas correspondientes debern incluir la forma correcta de desechar los residuos. R18.Al finalizar las actividades en el laboratorio, el responsable del rea, profesor o jefe de laboratorio ( el ltimo en salir del laboratorio ), deber verificar que queden cerradas las llaves del gas,agua,vaco, vapor, circuitos elctricos, luces,etc. En caso de requerir que algn equipo trabaje de manera continua, deber dejarse en forma claramente visible ylegible,lainformacinacercadeltipodeexperimento,procesooreaccinen desarrollo,lasposiblesfuentesdeproblema,lamaneradecontrolarloseventuales accidentes y la forma de localizar al responsable del equipo. LABORATORIO DE BIOQUMICA 7 Del Manejo de Sustancias y Material R19.Con respecto al manejo de sustancias, material y equipo en el laboratorio se deben de atender a los siguientes aspectos: -Para transferir lquidos con pipetas, deber utilizarse la propipeta correspondiente. Queda prohibido pipetear con la boca -Proceda siempre con precaucin al transferir sustancias de sus recipientes. Si algo sederramanotifiquealprofesoroencargado,demaneraquepuedaaplicarselos procedimientos de limpieza adecuados. -Cuandosetrabajecontubosdeensayo,nodebemirarsealinteriordelmismo mientras se calienta , ni tampoco debe apuntar la boca del tubo en direccin hacia el compaero. -Cuandosecalientantubosdeensayodebehacersepartiendodelasporciones superiores hacia abajo.De otra manera el vapor que asciende,al encontrarse con lacapadelquidosituadaporencimadel,puedecausarproyeccionesdel contenido. -Cuandoseestmanejandolquidosinflamables,hayquetenercuidadoqueno haya llamas cerca. -Cualquierrecipientedondeseencuentrengrandesvolmenesdesustancias qumicas peligrosas como cidos y lcalis, deben ser manipulados por el profesor o encargado de laboratorio. -Nuncaagregueaguasobreuncidoconcentrado.Siesnecesarioprepararun cidodiluido,debeagregarsesiempreelcidoconcentrado,enpequeas cantidades, sobre el agua y agitar. -Cuandoestmanipulando(acodando)vidriopermitaqueseenfreantesde cualquiermanejoposterior.Alcortartubosdeensaye,cuidedenodejar superficiescortantes,alisealfuego.Alintroducirtubosdevidrioataponesno apoyarse sobre la palma de la mano. -Nunca fuerce dentro o fuera los tapones y anexos de goma, de los tubos de vidrio, termmetrosocualquierotromaterialquesepuedaquebrar.Laglicerinaoel detergente facilita la tarea de quitar dichos tapones o anexos. -Nunca calentar los sistemas totalmente cerrados-Usarsoportesqueapoyenbienenlamesa,paraevitarlacadadeequiposcon centros de gravedad altos. R20.Cuandosetrabajeconsustanciastxicas,deberidentificarseplenamenteelrea correspondiente,nuncadeberntomarsefrascosporlatapaoelasalateral,siempre debern tomarse con ambas manos, una en la base y la otra en la parte media. Adems se deber trabajar en el rea con sistemas de extraccin y equipo de proteccin personal. R21.En cada laboratorio deber existir de manera clara, visible y legible, la informacin acerca de los telfonos de emergencia a los cuales llamar en caso de requerirlo: Cruz RojaBomberosAntirrbicoCentro Mdico LABORATORIO DE BIOQUMICA 8 Proteccin Civil R22.Cualquieralteracinalascondicionesdeseguridadoenelcumplimientodel presente reglamento, deber ser reportado al responsable correspondiente. R23.Laspersonasaquienesselessorprendahaciendomalusodeequipos,materiales, instalaciones,etc;propiasdeloslaboratorios.Detodoaquellomencionadoenlos reglamentosR3yR4odelassealizacionesinstaladas,sernsancionadasconformelo dicte la academia y jefatura correspondiente. De La Disposicin de Material y equipo R24. Todas la sustancias, equipos, materiales, etc; debern ser manejadas con el mximo cuidado,siguiendolascondicionesdelosmanualesdeusoomanualesdeseguridad, segn sea el caso. R25.Elequiponecesarioparalarealizacindelasprcticasserproporcionadoen condiciones normales de funcionamiento, cualquier desperfecto que resulte, el estudiante loharsaberalprofesoroencargado,sinqueintentellevaracabolareparacin correspondiente. R26. El material de consumo para cada prctica, lo proporciona el encargado en cantidad suficienteyadecuadaaltrabajoarealizar.Sielestudiantehacemalusodeeste;tendr que reponer el material de consumo.

R27.Encasodehaberrotomaterialenformairreparable,colocarlospedazosenuna bolsa adecuada y colocarla en los depsitos para tal propsito. R28.Parareponerlosdaosamaterialoequipo,quepornegligencia,malusoo cualquier otra causa, el estudiante reponerlo con las mismas especificaciones y entregarlo conlafacturadecompra.Setendrn15dasnaturalesparareponerdebidamenteel material o equipo, si no cumple no se le permitir trabajar en el laboratorio, reprobar la materiaencursorelacionadaconesteyno se podr inscribir al siguiente semestre de la carrera correspondiente. R29.Elmaterialyequipodeloslaboratorios,sonparaserusadosenprcticaso investigaciones y no se prestarn para fines personales. Asistencia y Servicio de Material R30.ElEstudiantedeberasistiralasesindelaboratorioquelecorrespondecon puntualidadoconunatoleranciade10minutos.Despusdeestos10minutosnosele entregar material. LABORATORIO DE BIOQUMICA 9 R31.La entrega de material se efectuar exclusivamente, durante la primera media hora deentradaacadasesin.Losalumnosnopodrniniciaroterminarunaprctica,sino est el profesor de la materia o el encargado de laboratorio. R32.Elestudiantetienelaobligacindehaberledopreviamentelaprcticadel manual y escuchar la explicacin del maestro sobre el experimento a realizar. R33.Se solicitar al encargado de laboratorio el material, de acuerdo al vale o boleta de cada sesin y lo revisar cuidadosamente en su presencia,firmar de conformidad, si este es el caso, cuidando de anotar cualquier desperfecto del material. R34.Losestudiantestienenlaobligacindelimpiarlamesadetrabajo,elequipoe instrumentos,dedevolverelmateriallimpioysecoyenelmismoestadoenquese recibi y no olvidar la boleta firmada. LABORATORIO DE BIOQUMICA 10 OBJETIVO -AplicarlaecuacindeHenderson-Hasselbalchparacalcularloscomponentsde unasolucinamortiguadoraaundeterminadopHyapreciarlaimportanciade tales soluciones en los organismos vivos. INTRODUCCIN Laadicindeunasalsolubledeuncidodbilaunasolucinacuosadeesecido, aumentar el Ph (disminuye la [H+]) de la solucin. La sal se ionizar totalmenteyelaumento de laconcentracin de la base conjugada del cidodbilporefctodelaleydeaccindemasasdeslazarelequilibriohaciala izquierda y extraer algunos iones hidrgeno. Debido a o anterior, el ph de una solucin de un cido dbil est determnado no tanto por la concentracin del cdo, sino por la razn de la concentracin de la sal (base conjugada) alaconcentracindelcidosindisociar.Talessolucionessellamansoluciones amortigudoras y pueden resistir el cambio de pH cuando se anade un cido o base fuerte. + + H HPO PO H24 4 2 MATERIALREACTIVOS 4 Matraces volumtricos de 100 mlFosfato de potasio monobsicso Pipetas volumtricas de 1, 2,5 y 10 mlFosfato de sodiodibsico 7 Frascos de vidrio color mbarHidrxido de sodio Potencimetro cido brico Bureta graduadaNaOH1 N Vaso de precipitado de 250 mlAgua destilada DESARROLLO PREPARACIN DE LAS SOLUCIONES AMORTIGUADORAS HaciendousodelaecuacindeHendeson-Hasselbalch,calcularlacantidaddecidoy baseconjugadaparapreparer100mldecadaunadelasiguientessoluciones amortiguadoras. PRCTICA # 1.-Soluciones amortiguadoras. LABORATORIO DE BIOQUMICA 11 ASolucin de fosfatos 0.1 M a un pH de 7.2 BSolucin de fosfatos 0.1 M a un pH de 7.6 CSolucin de fosfatos 0.1 M a un pH de 7.8 DSolucin de boratos 0.1 M a un pH de 8.0 ESolucin de boratos 0.1 M a un pH de 8.4 FSolucin de boratos 0.1 M a un pH de 8.8 GSolucin de boratos 0.1 M a un pH de 9.8 DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD AMORTIGUADORA La capacidad de amortiguacin, es la cantidad de base fuerte requerida para alterar el pH de la solucin amortiguadora en una unidad de pH. Secolocanlos100mldesolucinamortiguadoraenunvasodeprecipitadode250ml, posteriormente se introduce el electrodo de medida del potencimetro, PrepararunaburetaconsolucinNaOH1Nyseadiciona1mldeestabasealvasode precipitado que contiene la solucin amortiguadora. Registrar el pH resultante despus de agitar perfectamente. NuevamentepreparerunaburetaconNaOH1Nyadicionar1mldelabasealvasode precipitadosquecontienelasolucinamortiguadora,estepasoserealizetantasveces, hastaqueelpHdelasolucincambiaenunaunidad.Acontinuacincompletael siguiente cuadro de acuerdo a los resultados obtenidos. Volumen de base Incremento de pH C.A= PRECAUCIN!Evite golpear el electrodo. LABORATORIO DE BIOQUMICA 12 VOLUMEN DE NaOH ADICIONADO(ml) LECTURA DE pH Capacidad Amortiguadora = _________________ CONCLUSIONES CUESTIONARIO 1.Anotarloscalculusrealizadosparalapreparacindelassluciones amortiguadoras. 2.Calcularlacapacidaddeamortiguacindecadaunadelassoluciones amortiguadoras. 3.MediantelaecuacindeHenderson-Hasselbalch,explicarcuandoun amortiguador presenta su maxima capacidad de amortiguamiento. 4.Utilizando una reaccin qumica, indique lo que sucede al adicionar el NaOH a la solucin amortiguadora. 5.Utilizando una reaccin qumica, indique lo que sucede al adicionar un cido a la solucin amortigadora. 6.Explique Por qu los aminocidos tienen capacidad amortiguadora? LABORATORIO DE BIOQUMICA 13 7.Cules son los sistemas amortiguadores en las clulas vivas? 8.Delossistemasamortiguadorepresentesenlasclulasvivasculeselms importante? Por qu? 9.Qu es una acidosis respiratoria? 10. De qu manera el organismo compensa las acidosis anteriores? BIBLIOGRAFA CONSULTADA LABORATORIO DE BIOQUMICA 14 OBJETIVO -Demostrarlautilidaddelareaccindelanihidrinaparalaietificacindelos amiocidos -Realizar la separacin de los aminocidos contenidos en una mezcla por medio de cromatografa circular en papel -Comprobar la efectividad de la reaccin de Adamkiewiks para la identificacin de los grupos indoles e identificar el aminocido que contiene este grupo functional-Ratificar la utilidad de la reaccin xantoproteica en la deteccin de grupos fenoles sustituidos e identificar los aminocidos que contienen este grupo funcional -Demostrarquelareaccindelostiogruposidentificaalosgrupossulfihidriloscomprobarsuutilidadenladeteccindeaminocidosqueposeanestegrupo functional INTRODUCCIN Los aminocidos contituyen el alfabeto de la estructura proteca y determinan muchas de laspropiedadesimportantesdelasprotenas.Desdeelpuntodevistaqumicolos aminocidos pueden definirse como compuestos qumicos orgnicos que poseen al menos un grupo amino y uno carboxilo. FIG.AA Losaminocidostienenpropiedadesfsico-qumicascomunesquederivandeesta caractersticaestructuralcomo:sersustanciasplaresyporconsiguientepresentarun elevadopuntodefusinyebullicin,ascomosersolublesensolventespolares;en cuantoalascaratersticasqumicaspresentarnreaccionespropiasdelosgrupos qumicos que poseen. En ellos tambin existe una cadena lateral o grupo R de estructura variable que identifica a cada aminocido particular y lo que permtir la difernciacin en laboratorio por medio de procesimientos tanto fsicos como qumicos. Losaminocidossoncompuestosslidos;incoloros;cristalizables;deelevadopuntode fusin (habitualmente por encima de los 200 C); solubles en agua; con actividad ptica y conuncomportamientoanftero.Laactividadpticasemanifiestaporlacapacidadde desviarelplanodeluzpolarizadaqueatraviesaunadisolucindeaminocidos,yes debida a la asimetra del carbono , ya que se halla unido (excepto en la glicina) a cuatro radicales diferentes. Esta propiedad hace clasificar a los aminocidos en Dextrogiros (+) si desvian el plano de luz polarizada hacia la derecha, y Levgiros (-) si lo desvian hacia la izquierda. PRCTICA # 2.-Propiedades fsicco qumicas de los aminocidos.. LABORATORIO DE BIOQUMICA 15 Elcomportamientoanfteroserefiereaque,endisolucinacuosa,losaminocidosson capaces de ionizarse, dependiendo del pH, como un cido (cuando el pH es bsico), como una base (cuando el pH es cido) o como un cido y una base a la vez (cuando el pH es neutro). En este ltimo caso adoptan un estado dipolar inico conocido como zwitterions (del alemn in hbrido), en este estado es como predominan en el interior de la clula. Reaccin de la NinhidrinaFIGURA NIHDRINA En esta prctica se aprovechar la reaccin de los aminocidos con la Nihidrina, en la que participanttantoelgrupocarboxilocomoelamino,paralaidetificacindelapresencia de estos compuestos y su utilizacin en el revelado de la cromatografa. Nihindrina(Hidratodetricetohidrindreno),enpresenciadecompuestosqueposeanal menosungrupoaminoyotrocarboxiloreaccionanformandounderivadocoloreado, generalmenteazul(exceptoprolinaehidroxiprolinagenerancolracinamarilla)ycon desprendimiento estequiomtrico de dioxido de carbono, lo que permite que esta reaccin seaasuvezunmtodogeneralparalaestimacincuantitativAycualitativadelos aminocidos. FIGURA RX NIHIDRINA Cromatografa de Particin en Soporte de papel Estemtodosebasaenlapropiedadquetienenciertoscompuestosdesersolubles aunque en magnitudes diferentes, en dos o ms solvenes que son inmiscibles entre s que se hallan en contacto. Uno de los dos solventes permanence estacionario se le denomina fase fija, en tanto que el otro se desplaza continuamente, por lo que se le denomina fase mvi.Despusdeuntiemposuficienteparaalcanzarelequilibrio,elcompuestose encuentradistribuidoenlasdosfaseslquidasenunmodocaracterstico.Laexpression numrica de esta propiedad es el coeficiente de distibucin (K). | || | BAK = Donde: A: concentracin del sovente A B: concentracin del solvente B LABORATORIO DE BIOQUMICA 16 Unodelossistemasdesolventesmssencillosquepuedeaplicarseeselfenolsaturado en agua. Desdeelpuntodevistadesusolubilidadtodoslosaminocidossonsoublesenagua debido a la presencia de su estructura invariante, su solublidad variar de acuerdo con la polaridadquepresentesucadenalateral,demaneraquelosaminocidosclasificados como polares inicos sern mucho ms solubles en agua que aquellos que posean grupos hidrofbicos en su cadena R. Cromatografa Circular El papel filtro se coloca horizontalmente sobre una caja Petri que contega el solvente, se le adiciona un sistema capilar que posibilite que el papel alcance el solvente, se tapa y se deja que la fase mvil alcance el borde del papel. Este procedimiento tiene la ventaja de ser muy simple (no necesita equipos especiales) y rpido, por lo que resulta ideal para que el personal inexpeto obtenga resultados que sean demostrativos. En caso de utilizar el mismo tipo de papel, los mismossolventes y las mismas condiciones ambientales,lamovilidaddeunamanchacorrespondienteaunasustanciapuraes constanteyporlotantoesposibleidentificaresamanchaporcomparacindirectacon una mancha patron. En caso de no contar con una mancha patron, es possible identificarlo a partir de los valores Rf. Solvente Distmancha DistRf..= Fig 4. Cromatografa circular Reacciones qumicas de los aminocidos Lasreaccionesquesepresentanacontinuacinhansidoseleccionadasporser representatives, stas permitern efectuar la diferenciacin y/o identificacin de algunos de ellos LABORATORIO DE BIOQUMICA 17 Reaccin de Adamkiewics La reaccin de Adamkiewics es especfica para los grupos indoles. Se basa en la propiedad que tiene este grupo qumico de reaccionar con gran nmero de aldehdos, entre ellos el formaldedo, a travs deuna reaccin de condensacin mediada porlapresenciadeunagentedeshidratantecomoelcidosulfricoygenerandoasun derivado coloreado characterstico. Esta reaccin es propia del triptfano. FIG RX. Debe se;nalarse que las protenas que contengan a este amincido tamin daran positive la reaccin, pues el cido sulfrico presente provocara la desnaturalizacin de la protena con la subsiguiente exposicin al medio de los grupos indlicos existents en las cadenas lateralsdelosaminocidos,entreellaslasdeltriptfano.Ademslareaccindel sulfricoestanenergticaqueprovocaralahidrlosisprotecaylaliberacindel susodicho aminocido. Reaccin Xantoproteica La reaccin xantoproteca es especfica para grupos fenilos sustituidos. Enellaocurrirlanitracindelgrupofeniloqueposeaunamolculaorientadorapara posiciones orto del anillo cuando se ponga en contacto con el cido ntrico. La nitracin deesteanillodeterminarqueelcompuestoresultantetengauncolor.FIGRX XANTOPROTEICA Deacuerdoalopostuladoanteriormente,todoslosaminocidosquepresentenensu estructuragruposfenilossustitudoscomolatirosina,triptfano,daranpositiveconla reaccin xantoproteca. En esta reaccin el cido ntrico provocar la desnaturalizacin e hidrlisis parcial de las protenas,porlotantolasprotenasalosaminocidosmencionadosanteriormente ambient daran positive con esa reaccin. Reaccin de los Tiogrupos LapresenciadelosgruposSH(sulfihdrilootiol)esuncompuestoorgnicoque permite transcurra una reaccin en presencia del acetato de plomo en medio alcalino en el cual Entre los tres aminocido azufrados que existen: cistena, cistina y metionina, solo los dos primerosdarnlareaccindelostiogrupos,mientraslametioinadarnegativaaltener bloqueado su grupo tiol por la presencia del metilo. LABORATORIO DE BIOQUMICA 18 MATERIALREACTIVOS 10 tubos de ensaye de 15 mlAminocidos Mechero de BunsenAlbmina de huevo CubaNinhidrina Vaso de precipitados de 250 mlGelatina, Sacarosa Placa PetriTriptfano CapilarFormaldehdo Vidrio de reloj Fenol, Fenialalanina Pipeta 10 mlAc. Sulfrico, Ac. Ntrico Hidrxido de potasio al 40% Aceato de plomo al 10% Agua destilada DESARROLLO Experimento # 1 Reaccin de la Ninhidrina Prepare 4 tubos de ensayo segn se muestra en el cuadro siguiente: TUBO# REACTIVO 1234 Albminade huevo 0.5 ml___ Solucinde aminocidos _0.5 ml__ Scarosa__0.5 ml_ Agua destilada__0.5 ml Ninhidrina0.5 ml0.5 ml0.5 ml0.5 ml Agite todos los tubos de ensayoycolquelos en un bano de aua en ebullicin durante 5 minutos. LABORATORIO DE BIOQUMICA 19 OBSERVACIONES

Experimento # 2 Cromatografa circular en papel . Despus de colocados los guantes y utilizando un apis y regal, divida el papel filto que tiene en su puesto de trabajo en 4 cuadrantes simtricos, tal como se muestra en la figura siguiente y proceda aplicar al orificio ms prximo central y en forma de bandas finas las soluciones de aminocidos de acuerdo a la distribucin que se orienta en la propia figura. Fig 7. Paralarealizacindeesteexperimientoesnecesarioelusodeguantes quirrgicos o de laboratorio de latex, ya que en sus manos se encuentran presentesdiverosaminocidosquecontaminarantodoelmaterial; ademselsistemadesolventesutilizadocontieneunaelevada concentracin de fenol que es altamente castico. Alanina Leucina Mezcla de a.a. Acido glutmico LABORATORIO DE BIOQUMICA 20 Coloque el capilar que se encuentra en su puesto de trabajo en el centro del papel filtro y ubiquedichopapelsobrelaplacaPetriquecontieneelsistemadesolventes. Inmediatamente tape la placa de Petri y deje corer el solvente hasta alzanzar el borde del papel. AlterminarlacorridacromatogrficaextraigaelpapelfiltrodelaplacaPetriydjelo secarmediantesuexposicinalcalorencontactodirectoconunaresistenciaelctrica. Debe tener cuidado de no quemar el papel filtro. Finalizando este procedimiento de secado, se debe sumerjir el papel en un vidrio de reloj enelquepreviamentesecolocaunasuficientecantidaddelreactivodelaninhdrina.Se sacadeinmediatoelpapelfiltrodelrelojysecolocaenelhornoa120Cdurante5 minutosno hasta que aparezca en el mismo las manchas azul-violceas caractersticas de los aminocidos con la reaccin de la ninhidrina. OBSERVACIONES:Representeeneldibujosiguienteelresultadoobtenidocalculeel valorRf de cada uno de los aminocidos conocidos as como el o los que se encuentran en la mezcla de aminocidos. UnavezcalculadosestosvaloresdeRf ,procedaaidentificarlasmanchasquese obtuvieron de la corrida cromatogrfica de la mezcla de aminocidos, considerando como nmero 1 la que se encuentra ms cerca del orificio central del papel. Explica la razn por la cual se produce esta separacin de los aminocidos. Aminocidos identificados 1) 2) 3) 4) LABORATORIO DE BIOQUMICA 21 Experimento # 3 Reaccin de Adamkiewics Prepare 4 tubos de ensayo segn se muestra en el cuadro siguiente: TUBO# REACTIVO 1234 Gelatina0.5 ml___ Albminade huevo _0.5 ml__ Triptfano__0.5 ml_ Agua destilada__0.5 ml Formaldehdo3 gotas3 gotas3 gotas3 gotas Acido sulfrico1 ml1 ml1 ml1 ml Debetomarencuentadosmedidasimprescindiblesparaquelatcnicafuncione correctamente: 1.Despus de anadir el formaldehdo debe agitar los tubos de ensayo 2.Anadirelcidosulfridomuylentamenteyporlasparedesdelrecipienteyno agitar el tubo de ensayo La positividad se expresa.. que se apreciar en la interfase de OBSERVACIONES Recuerdequelareaccindedeshidratacinmediadaporelcido sulfrico es altamente exotrmica.y si lo adiciona muy rpido la reaccin puede ebullir e incluso saltar y producirle quemaduras LABORATORIO DE BIOQUMICA 22 Precise por qu existen diferencias entre el resultado obtenido con la albmina de huevo y con la gelatina. Experimento # 4 Reaccin Xantoproteica Prepare 5 tubos de ensayo segn se muestra en el cuadro siguiente: TUBO# REACTIVO 12345 Albminade huevo 2 ml____ Fenol_2 ml___ Triptfano__2 ml__ Fenilalanina___2 ml_ Agua destiladao____2 ml Acido ntrico1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml CONCLUSIONES (Explique brevemente estos resultados) : LABORATORIO DE BIOQUMICA 23 Llevarlostubosalbanodeaguahirvienteymantenerlosahduranteunminuto,qu observa? Enfre los tubos de ensao y andale a todos ellos 5 ml de a solucin de hidrxido de sodio al 20% Qu observa?

Comparelosresultadosobtenidosconeltriptfanoylafenilalanina.Expliquela diferencia observada. CONCLUSIONES (Explique brevemente estos resultados) : LABORATORIO DE BIOQUMICA 24 Experimento # 5 Reaccin de los Tiogrupos Prepare 3 tubos de ensayo de la siguiente forma: TUBO# REACTIVO 123 Albminade huevo 1 ml__ Cistena_1 ml_ Agua destilada__ Hidrxidode potasio a 40% 1 ml1 ml1 ml Acetatode plomo al 10% 3 gotas3 gotas3 gotas Llevarlostubosalbanodeaguahirvienteymantenerlosahdurante10minutos,qu observa? Explique por qu la albmina manifiesta este resultado LABORATORIO DE BIOQUMICA 25 CUESTIONARIO 1.Porquseutilizaaguadestiladaentodoslosexperimentosqumicosdeesta prctica? 2.Porqulaalbminadehuevotienediferenteresultadocuandoserealizala reaccin de la ninhidrina con relacin al resto de los resultados? 3.De acuerdo con los resultados diga qu amnocidos se encuentran formando parte de la albmina de huevo? 4.Sobrelabasedelaestructuraqumicadelosaminocidosutilizados,explique por qu se produce diferente migracin en la cromatografa? BIBLIOGRAFA CONSULTADA LABORATORIO DE BIOQUMICA 26 OBJETIVO Compararlatcnicatradicionalparacuantificarprotenas(mtododeBiuret),conel mtodo de Bradford que es muy sensible, rpido y exacto. INTRODUCCIN Loslaboratoriosdeinvestigacin,rquieresdemtodosrpidosysensiblespara cuantificar potenas. Las tcnicas disponibles cumlen parcialmente los requerimientos de este tipo de cuantificaciones. ElmtododeLowryestsujetoainterferenciascomoionesK+ yMg++,EDTA,tris, TIOESYCARBOHIDRATOS.ElmtododeBiuretespocosensibleyestsujetoa interferencias como amonaco, TRIS y glicerol. Lastcnicasanterioressehanmodifiadoparaeliminartalesinterferencias,perolos procedimientos se han hecho ms elaborados y tardados. Elmtodoqueseensayar(mtododeBradford),eliminalamayoradelosproblemas antesdescritosysebasaenqeelazuldecoomassie(blueG-250)existeendosformas coloridas (rojayazul), la formaroja es transformada a laforma azul cando se forma un complejoconlaprotena.Estecomplejotieneuncoeficientedeextincinalto,locual hace que el mtodo seamuy sensible (detectag).La formacin del complejo es rpido (aprox. 2 minutos) y estable hasta por una hora. MATERIALREACTIVOS 13 tubos de ensaye de 12 x 100Reactivo de Bradford 3 pipetas de 5 mlNaCl 0.15 M. 2 pipetas de 1 mlReactivo de Biuret GradillaSolucin amortiguadora TRIS Bano MaraEstndar de protena 10 mg/ml EspectrofotmetroEstndar de protena 100 mg/100 ml Papel milimtrico PRCTICA # 3.-Cuantificacin de las protenas. LABORATORIO DE BIOQUMICA 27 DESARROLLO Mtodo de Biuret Estatcnicaestfundamentadaenlaproduccindeunquelatosolubledecolorazul intesno a voleta, formado por pptidos y protenas en un medio alcalino en presencia del in Cu++. Sepreparanseistubosdeensayedeacuerdoalasiguietetabladedistribusinde reactivos. Tubo No. Estndar de protena (mg/ml) NaCl 0.15 M (ml) Muestra problema (ml) Reactivo de Biuret (ml) 102.001.003.00 22.52.7503.00 35.02.5003.00 47.52.2503.00 5102.0003.00 603.0003.00 Se colocan los tubos de ensaye en un bano Mara a 37C durante 1 min, posteriormente se enfran los tubos de ensaye con agua de la llave. Hacer un barrido en el espectofotmetro, para determinar la longitud de onda a la cual se obtienelamximaabsorbencia.SepUedeutilizarcualquiertubo(porejemploel3), calirando con el tuo No. 6 (blanco). Determinar laabsorbencia de cada una de las soluciones (1 a la 5), utilizando el valor de longitud de onda determinado en la experiencia anterior. Fig 8.Espectgrafos LABORATORIO DE BIOQUMICA 28 Registralosdatosyelaboraunagrfica(enpapelmilimtrico)deabsorbenciacontra concentracin (mg/ml), tomado solo los valores de los tubos del 2 al 5. Apartirdestagrfica,interpolaelvalordelaabsorbenciadelamuestraproblemay determina su concentracin. Mtodo de Bradford Estatcnicasebasaenlaformacindeunligandodecolorazul,queseobtieneporla unin del azul de coomassie a las protenas. DelestndardeprotenaempleadoenelmtododeBiuret(10mg/ml),sehaceuna dilucinadecuadaparaobtenerunaconcentracinde100g/100l.Estasolucin resultante, se utilizar como estdar en el mtodo de Bradford. Acontinuacinsepreparan7tubosdeensaye,deacuerdoalasiguientetablade distribucin de reactivos. Tubo No. Estndar de protena (l) Solucin amrtiguadora TRIS (l) Muestra problema (l) Reactivo de Bradford (ml) 1010005 2208005 3406005 4604005 5802005 6100005 7050505 Se mezclan perfectamente cada uno de los tubos de ensaye y se determina la absorbencia aunalongituddeondade595nm.SecalibraelespectrofotmetroconeltuboNo.1 (blanco). OBSERVACIONES : Tubo No. 2 3 4 5 LABORATORIO DE BIOQUMICA 29 Aligualqueelmtodo anteriorseregistranlosdatosyseelaboraunagrfica(enpapel milimtrico)deabsorbenciacontraconcentracin(g/ml),tomandoslolosvaloresde los tubos del 2 al 6. Utilizandolagrficaanterior,interpolarelvalordelaabsorbanciadelamuestra problema y determina su concentracin. Realiza los siguientes clculos para expresar la concentracin de protena en mg/ml ( )( )( )100020 lucin factordedi gprotenamlmgprotena= Semultiplicapor20,porhabertomado50ldemuestraproblema.Deestaformase logra obtener el valor por ml (50 l x 20 = 1000 l =1 ml. El factor de dilucin, es el numero correspondiente a la dilucin utilizada para ograr que lamuestraoriginaltengaunaconcentracindelordendeg.Porejemplo,siladilucin ser de 10, se divide entre 1000 para convertir los g a mg. CUESTIONARIO 1.Cul es el fundamento del mtodo de Lowry para cuantificar protenas? 2.Cul es la estructura qumica del quelato que se forma en el mtodo de Biuret? 3.Calcula el porcentaje de error, entre los valores obtenidos (mg/ml) para la muestra problemaporelmtododeBiuretyporelmtododeBradford(considerarel mtodo de Bradford como 100% efectivo) 4.Cul es el criterio que se utiliza para determinar a que logitud de onda se debe de leer la absorbencia de una muestra problema? 5.Qu es elcoeficiente de extincin molar de un compuesto? 6.Qu nos dice la ley de Lambert-Beer, en cuanto a la absorbencia y concentracin de una solucin coloreada? 7.Qu funciones desempenan las protenas en los organismos vivos? OBSERVACIONES : Tubo No. 2 3 4 5 6 LABORATORIO DE BIOQUMICA 30 8.Culeslaraznporlacual,seutilizalaalbminadehuevocomoantdotoen intoxicaciones con metales? 9.Cules son los tipos de protenas presentes en el suero sanguneo? CONCLUSIONES. BIBLIOGRAFA CONSULTADA. LABORATORIO DE BIOQUMICA 31 OBJETIVOS -Demostrar que en la saliva existe actividad de la enzima -amilasa. -Comprobarelefectodelaconcentracindelaenzimasobrelavelocidaddela reaccin. -Determinar el pH ptimo de la enzima -amilasa salival. -Comprobar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzitica. -Identificar un inhibidor de la enzima -amilasa. INTRODUCCIN La cintica qumica es la rama de la qumica que se encarga de estudiar la velocidad y los mecanismos de las reacciones. Al aplicar esta rama general a la accin de las enzimas, se habla entoces de la cintica enzimtica. Seconsideraalavelocidaddelareaccincomounaexpresindelarapidezconque transcurrelamismaysepuedecalcular,biencomolacantidaddesustancias reaccionantesquedesaparecenenlaunidaddetiempoocomolacantidaddeproductos queseformanenlaunidaddetiempo.Paralosefectosdelapresenteprcticasevan utilizar para expresar la desaparicin del producto. Entrelosdiferentesfactoresquemodificanlavelocidaddelareaccinenzimtica tenemos: 1.Concentracin de la enzima 2.Concentracin de sustrato 3.Concentracin de coenzimas 4.pH 5.Temperatura 6.Inhibicin enzimtica. Detodoslosanteriores,losquetendrngranrepercusinenlaregulacindel metabolismocelularsonel1,2y6;entantoquelosotrosestarndirectamente vinculados con el preceso de salud y enfermedad. La-amilasasalivalesunaenzimadelgrupodelashidrolasasyespecficamentedelas endohidrolasas,antiguamentedenominadnaptialina,seencuentradirectamente suspendidaenunasolucindemuyfcilobtencin,yesprcticamentelanicaenzima existente en la saliva.PRCTICA # 4.-Cintica enzimtica LABORATORIO DE BIOQUMICA 32 Uno de los aspectos en el que se debe tener especial atencin es el garantizar que durante todoeltiempoenelqueseesttrabajando,nosevayaaproducirinactivacindeestas protenas.Existenmltiplesfactoresquepuedeninactivaraunaenzimamediantesu desnatralizacin,queincluyendesdematerialdelaboratoriosucioyporconsiguiente contaminado con otras sustancias que puedan ser agentes desnaturalizantes o inhibidores delaenzima,hastaelpococontroldelatemperaturayelpH.Otragranventajaenla utilizacin de la -amilasa salival es que la misma es relativamente termoestable y no se desnaturaliza sino a temperauras elevadas. La -amilasa va catalizar la hidrlisis de un enlace que se encuentra situado interiormente enunamacromolculaynoafectaenloasolutoalosenlacesqueseencuentranenlos extremosdelsustrato.Msespecficamenteestaenzimasecatalogacomouna-endoglicosilasa porque cataliza la hidrlisis de los enlaces glicosdicos. En la figura que aparece a continuacin aparece la estrucutra de la glucosa O Fig 9. Estructura de la Glucosa En el almidn las unidades de -D-glucosa que lo componen, se unen entre s mediante el establecimientodeenlaces-1-6-O-glicosdicos.Enelalmidnexistendostiposde cadenasdiferente,unaquenoseencuentraramificadallamadaamilosayotraquese encuentra muy ramificada denominada amilopectina. Fig 10. Esquema de la estrucutra helicoidal de la Amilosa en el grano de almidn. OH OH OH OH OH Glucosa LABORATORIO DE BIOQUMICA 33 Ambasmolculasseimbricanentresparadarlugaralaaparicindelgrnulode almidn que constituye la reserva de combustible biolico en los vegetales. Laglucosaqueformaelalmidntienelapropiedaddeserunmonosacridoreductor deido a la presencia en su estrucutra del denominado carbono anomrico; sin embargo el almidn pierde esta caracterstica de ser un agente reductor, porque en su estrucutra todos los carbonos anomricos de sus glucosas constituyentes se encuentran comprometidos en laformacindelosenlacesglicosdicos,exceptounospocosqueformanlosescasos extremos reductores de la molcula; sin embargo la mayor parte de los extremos de esta molcula son no reductores. La propia estructura de la milosa permiti disenar una reaccin para la identificacin del almidn que se puede hacer fcil y rpidamente en el laboratorio mediante la adicin del yodo, el cual formara con la hlice del polisacrido un coplejo de inclusin de color azul,tal como se muestraen el siguiente esquema. Fig 11. Formacin del complejo de Inclusin con el yodo. Lafragmentacinsucesivadelalmidndeterminaquevayanapareciendocompuestos quepresentandiferentecoloracinconelreactivodellugol,locualconstituyeun exelenteindicadorquepermiteseguirelcursodelareaccin.Cabedestacarquelos productos finales obtenidos en este proceso son los disacridos maltosa e isomaltosa y el trisacridoisomaltotriosa,sinquepuedaalcanzarselaformacindelaglusoca,puesel enlaceglicosdicoexistenteenestosdisacridosesunenlaceexternoylaenzimanoes especfica para l. MATERIALREACTIVOS Beaker 50 mlAcido tricloroactico 10 Tubos de ensayo 12 x 100Agua destilada KCl, KBr, KF Bufferfosfato4.9,6.3,6.9, 7.5 y 8.9 Lugol Enzima LABORATORIO DE BIOQUMICA 34 DESARROLLO Recoleccin de la muestra de la saliva y preparacin de la solucin de la enzima Loprimeroquesedebehaceresrecolectarlamuestradelasalivaparaobteneruna solucindeenzima.Paraelloenjugueselabocavariasvecessonaguacorrientey procedaarecogerenunbeakerde50mllimpioaproximadamnete2mldesaliva. Adicinelealasalivarecogida10mldeaguadestiladaymzclelabien.Filtreesta solucin de saliva y rotule a este tubo de ensayo como solucin de enzima. Experimento # 1 Demostracin de la Actividad de la -amilsica en la saliva Prepare 5 tuos de ensayo con 0.5 ml de cido Tricloroactico (TCA) cada uno y rotlelos del 0 al 4. Prepare adems un tubo de ensayo segn se muestra en el cuadro siguiente. A este tubo de ensayo le llamaremos tubo de reaccin. REACTIVOSCANTIDAD Almidn1.0 ml Agua destilada4.9 ml Cloruro de potasio1.0 ml Buffer fosfato pH 6.9 0.1 ml Agitebienestetubodeensayoyprocedaaadicionarle1mldesolucindeenzimae inmediatamente,sinperdereltiempoprocedaagitaryaextraer1mldeesetuboy adicionarlorpidamentealtuborotulado0yalmismotiempocomienceamedirel tiempo. Cada minuto subsiguiente usted debe repetir el paso anterior, es decir extraer una porcin alcuota de 1 ml del tubo de reaccin e irla adicionando a los tubos que contienen el (TCA) hasta alcanzar el tubo marcado 4 minutos. De inmediato adicinele a cada uno de los tubos de ensayo 2 gotas de reactivo de lugol. A continuacin dibuje en los espacios correspondientes los resultados obtenidos con cada uno de los tubos de ensayo despus de haber anadido el lugol. Recuerde agitar el tubo de ensayo cada vez que anada la porcin de alcuota LABORATORIO DE BIOQUMICA 35 Explique los resultados obtenidos

Experimento # 2 Efecto de la concentracin de la enzima sobre la velocidad de la reaccin. Prepara 4 tubos de ensayo de la forma siguiente: TUBO# REACTIVO 1234 Buffer pH 6.90.1 ml0.1 ml0.1 ml0.1 ml_ KCl0.2 ml0.2 ml0.2 ml0.2 ml Almidn0.5 ml0.5 ml0.5 ml0.5 ml Agua destiladao1.2 ml1.1 ml1.0 ml0.9 ml Enzima0.1 ml0.2 ml0.3 ml0.4 ml LABORATORIO DE BIOQUMICA 36 Paradetenerlareaccinanada0.2mldeTCAacadatubodeensayodespusdehaber transcurridos4miutosdereaccin.Esdecirseprocederdelamismaformasecuencial conqueseanadilaenzima,deestamaneraalos4minutosdehaberadicionadola enzimaaltubo#1serquedebeagregarelTCAaesetuboyalosrestantesseles adicionar el cido en intervalos de 30 segundos. Despus de haber retenido la reaccin en todos los tubos de ensayo, proceda a agregarle a todoslostubos2gotasdelreactivodelugolyobservelosresultadosobtenidos reflejndolos en el dibujo que debe pintar a continuacin Explique los resultados obtenidos

Recuerdequeeltiempodereaccinesnecesariocontrolarlo cuidadosamentedemaneraquelaenzimaacteentodoslosgruposde ensayodeigualmanera;paraellanoadicionelaenzimahastanohaber preparadolostodoslostubosdeensayoyhaberlosagitado.Comienceel trabajoaadiendoaltubo#1lasolucindeenzimayagitenuevamente, midaeltiempoenesemomento,transcurridos30segundosanadala enzima al tubo # 2, al cabo de otros 30 segundos se le adiciona al tubo # 3 yaltubo#4seleadicionarlaenzimadespusdeotros30segundos. Recuerde que siempre debe agitar los tubos de ensayo. LABORATORIO DE BIOQUMICA 37 Experimento # 3 Determinacin del pH ptimo de la-Amilasa salival Prepara 5 tubos de ensayo de acuerdo a las indicaciones siguientes: TUBO# REACTIVO 12345 Buffer pH 4.90.1 ml____ Buffer pH 6.3_0.1 ml___ Buffer pH 6.9__0.1 ml__ Buffer pH 7.5___0.1 ml_ Buffer pH 8.90.1 ml KCl0.2 ml0.2 ml0.2 ml0.2 ml0.2 ml Almidn0.5 ml0.5 ml0.5 ml0.5 ml0.5 ml Agua destilada1.0 ml1.0 ml1.0 ml1.0 ml1.0 ml Enzima0.5 ml0.5 ml0.5 ml0.5 ml0.5 ml Para agregar la enzima debe tener los mismos cuidados que con la reaccin anterior en el control del tiempo, es decir irla adicionando secuencialmente cada 30 segundos y de igual forma se debe agregar el TCA para detener la reaccin a los 4 minutos exactos de haber anadido la enzima. Una vez concluidos todos los pasos anteriores adicione 2 gotas de lugol a cada uno de los tubos de ensayo y dibuje los resultados en el espacio siguiente:

LABORATORIO DE BIOQUMICA 38 Escriba el pH ptimo de la enzima y explique cmo llega usted a esa conclusin. Experimento # 4 Efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reaccin enzimtica. Prepare 3 tubos de ensaye de acuerdo con las indicaciones siguientes: TUBO# REACTIVO 123 Agua destilada1.0 ml1.0 ml1.0 ml Buffer pH 6.90.1 ml0.1 ml0.1 ml KCl0.2 ml0.2 ml0.2 ml Almidn1.0 ml1.0 ml1.0 ml Enzima0.5 ml0.5 ml0.5 ml Despusdepreparadoslostubosdeensayo;PEROANTESDEADICIONARLA ENZIMA,coloqueeltubo#1durante5minutosenelbanodehieloyeltubo#3enel anodeaguaenebullicin.Transcurridosestos5minutosysinsacarlostubosdesus respectivos banos de incubacin, anada la solucin de enzima y controle que el tiempo de reaccin sea de 4 minutos, adicionando el TCA en el momento apropiado. Agrguele acada tubo de ensayo 2 gotas de lugol, observe los resultadosy dibjelo en el espacio siguiente: LABORATORIO DE BIOQUMICA 39 Qu explicacin le da usted a los hallazgos encontrados? Experimento # 5 Identificador del Cofactor y de un Inhibidor De la enzima -Amilasa salival La enzima -Amilasa salival requiere como cofactor de la presencia de iones cloruro; sin embargolosionesfluoruroconstituyenuninhibidordelaenzimaylosbromurosno afectan la velocidad de la reaccin. Sobre esta base se han preparado 3 soluciones en las que en cada una de ellas se ecuentra uno de los iones mencionados, en forma de su sal de potasio. Siguiendo las intrucciones que se brindan en el cuadro siguiente prepare 3 tubos de ensayo. TUBO# REACTIVO 123 Solucin KCl0.2 ml__ Solucin KBr_0.2 ml_ Solucin KF__0.2 ml Buffer pH 6.90.1 ml0.1 ml0.1 ml Almidn0.5 ml0.5 ml0.5 ml Agua destilada1.0 ml1.0 ml1.0 ml Enzima0.5 ml0.5 ml0.5 ml LABORATORIO DE BIOQUMICA 40 Recuerdeadicionarlaenzimadeformasecuencialparacontrolareltiempoydetenerla reaccin con el TCA a los 4 minutos exactos despus de haberse inicado la misma. Anadaacadatubodeensayo2gotasdelugolyobservelosresultados.Exprselos mediante un dibujo en el espacio siguiente:

Cul es la solucin que se comporta como inhibidora, cul la activadora y cul la inerte, y cmo pudo diferencarlas? CUESTIONARIO 1.Por qu se utiliza la saliva como material biolgico en esta prctica? 2.Qu funcin desempena el TCA? 3.Cmo detect la actividad enzimtica de la saliva? 4.Qu factoresestudiados afectaron la velocidad de lareaccinenzimrica?. Por qu? 5.Cul es el pH ptimo de la enzima y cmo lo determin? 6.Cul fue la susancia activadora y cul la inhibidora? Cmo la pudo determinar? CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA CONSULTADA LABORATORIO DE BIOQUMICA 41 OBJETIVO -RelacionarelconsumedeglucoseconloscambiosdepHproducidosporlas levaduras -Describir las vas por las cuales la glucose genera los cambios de pH. -Interpretarelefectodelosinhibidoresylosdesacoplantessobrelasalidade protones. INTRODUCCIN La degradacin oxidativa de los alimentos a dixido de carbono y agua es exergnica (la oxidacin de la glucosa de la reaccin 1) mol kcal FO H CO O a Gluo/ 6866 6 6 cos2 2 2 = A+ +(1) Estaenergaseliberaenlasclulasalpasarlossubstratosatravsdevariasrutas bioqumicas. La energa liberada en las diversas rutas es variable. Al oxidarse totalmente la glucosa enel sistemaglicoltico, ciclo de Krebsy sistema transportador de electrones (unos-590kcal/moldeglucosa).Estehechoseponedemanifiestoalconsiderarel transportedeelectronespormolculadeglucosaylaenergaliberadadurantela oxidacin de los tranportadores de electrones iniciales (por ejemplo, oxidacin de DPNH, reaccin 2). mol Kcal FO H DPN O DPNH H/ ' 522102 2 = A+ + + ++(2) Partedeestaenerga,liberadaporlosalimentosdurantesudegradacinesretenidapor lasclulascomounaformaespecialdeenergaqumica(reactividadqumica),quese almacenaenlosenlacesfosfatoanhidrodelATP.LasfosforilacionesdelADPque resultan en formaciones de ATP o almacenamiento de energa, se clasifican en dos tipos: -Fosforilaciones a nivel substrato y -Fosforilaciones de transporte de electrones. PRCTICA# 5.-Fosforilacin Oxidativa LABORATORIO DE BIOQUMICA 42 Enlafosforilacinaniveldelsubstrato,elATPseformacomoconsecuenciadela interconversin de un substrato que no es un transportador de electrones. El segundo tipo de fosforilacin, la oxidacin del substrato se acompana de la reduccin de un primer aceptor de electrones como DPN+, TPN+ o una flavina (FAD o FMN) y que durante la subsiguiente transferencia de estos electrones al O2 tienen lugar fosforilaciones del ADP. Elmecanismomoleculardelafosforilacinoxidativahaconstituidodurantemucho tiempo,uninteresanteproblemaaresolver.Sehanrealizadomuchosintentos experimentales para aclarar las etapas intermedias. Uno de los mtodos ha sido el empleo deinibidoresespecficosparaefectuarladiseccindelprocesoglobalenreacciones individuales. Lafosforilacinoxidativaresultainfluidaporciertonmerodeagentesqumicosentre los que se encuentran los desacoplantes y los inhibidores. Losagentesdesacoplantespermitenlacontinuacindeltransporteelectrnico,pero impidenlafosforilacindelADPaATP;esdecirdesacoplanalasreaccionesque producen energa de las que la conservan. Sucaractersticaesqueestimulanlavelocidaddeconsumodeoxgenodelas mitocondriasintactasenausenciadeADP.Adems,provocanquelasmitocondrias aumenensuactividadhidrolticasobreelATP,mientrasqueenausenciadeagentes desacoplantes,laactividadATPsicadelamitocondriaesmuydbil.Losagentes desacoplantes pueden promover el paso de H+ a travs de la membrane mitocondrial, que normalmente es impermeable a dichos iones. Los inhibidores de la fosforilacin oxidativa, impiden tanto la estimulacin del consumo de oxgeno por el ADP, como la fosforilacin del ADP a ATP. Impiden el mecanismo de formacindeATPqueutiliceelintermediariodeenergaelevada,oseaelestado producido por el transporte de electrones. Aconsecuenciadeello,eltransportedeelectronesnopuedecontinuar,amenosquese utilice y consuma el intermediario o el estado de energa elevado. LABORATORIO DE BIOQUMICA 43 Fig. 12 Ruta que siguen los protones en la levadura. MATERIALREACTIVOS 2 vasos de precipitados de 100 mlSusp. de levaduras 200 mg/ml 2 pipetas de 5 ml Glucosa al 10% Pipeta de 10 mlDinitrofenol 40mM en etanol PotencimetroNaN3 400 mM Papel milimtricoAgua destilada Preparacin del Control Silaslevadurasconsumenglucosa,coneltiemposeobservarunadisminucin progresiva de su concentracin en el medio de cultivo y cambios en el pH extracelular. Glucosa Etanol Glucosa H+ ADP ATP H+ ADPATP H+ H+ Acetaldehdo Mitocondria H+ ADPP ATPP ADP ATPP NAD NADH LABORATORIO DE BIOQUMICA 44 Diluir5mldelasuspensiondelevadurascon40mldeaguadestilada.Apartirdeesta solucin se debe determiner el pH cada 5 minutos durante 10 minutos, para as obtener la lnea basal. Adicionar 5 ml de glucosa al 10%, posteriormente determiner el pH de la solucin cada 5 minutos durante 20 minutos, y luego cada 10 minutos hasta completer 30 minutos. DETERMINACINTiempo(min)pH 1. Levaduras 5 10 2Levadura + Glucosa 5 10 15 20 3Levadura + Glucosa 10 20 30 Efecto de un Desacoplante Diluir 5 ml de la suspensin de levaduras con 40 ml de agua destilada. Anadir 0.2 ml de lasolucindeDinitrofenol40mM(concentracinfinalde200mM).Serepitenlas operaciones que se realizaron en la seccin anterior para determinar el pH cada 5 minutos durante 10 minutos; adicionar la glucosa y nuevamente determinar el pH hasta completar 30 minutos. DETERMINACINTiempo(min)pH 1. Levaduras 5 10 2Levadura + Glucosa 5 10 15 20 3Levadura + Glucosa 10 20 30 LABORATORIO DE BIOQUMICA 45 Efecto de un Inhibidor Diluir 5 ml de la suspensin de levaduras con 40 ml de agua destilada. Agregar 0.5 ml de lasolucindeazidadesodio400mM(concentracinfinalde5mM).Nuevamente repetir las experiencias como las secciones anteriores para determinar pH. DETERMINACINTiempo(min)pH 1. Levaduras 5 10 2Levadura + Glucosa 5 10 15 20 3Levadura + Glucosa 10 20 30 CUESTIONARIO 1.Hacerunagrficadecadaunodelosexperimentos,utilizandolosvaloresdelas lecturas de pH contra tiempo. 2.Cul es el significado de los cambios de pH con desacomplante y con inhibidor? Comparer con el control. 3.Hacerunarelacindelasvasqueproducenestoscambios,tomandoencuenta que: las levaduras poseen una ATPasa de protones en la membrana mitochondrial queseencargadesintetizarATP;yquetieneotraATPasadeprotonesenla membraneplasmticacuyafunctionessimilaralabombadeNa+/K+delas clulas de los mamferos. (Ver figura 12). CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA CONSULTADA Cuidadoalmanejardinitrofenolylaazidadesodioyaquesonmuy txicos. Lavarse las manos despus de su manejo. LABORATORIO DE BIOQUMICA 46 LABORATORIO DE BIOQUMICA 47 OBJETIVO -Utilizando la tcnica de polarografa (electrodo de oxgeno), medir los cambios en la velocidad de consumo de O2 en mitocondrias de hgado de rata; en estado 3, en estado 4, en presencia de un inhibidor y/o desacoplante. INTRODUCCIN Elacoplamientoestrictamenteobligadoentrelasreaccionesdetransferenciade electrones y las reacciones de la fosforilacin oxidativa, puede ser muy bien ilustrado con el experimeto que se propone a continuacin. Eltransportedeelectronesenlamitocondria,puedesermonitoreadomidiendolela velocidadenelconsumodeoxgenoporunasuspensindemitocondriasdehgado.El consumo de O2 puede ocurrir rpidamente despus de la adicin de un sustrato oxidable (eldonadordeelectrones),deADP(aceptordefosfato)yfosfato.Elestadoactivoen presencia de sustrato y ADP se ha designado como estado 3 y es una situacin en la cual ocure una rpida transferencia de electrones, consumo de oxgeno y una rpida sntesis de ATP. DespusdelaconversindetodoelADPadicionadoaATP,lavelocidadde transferenciadeelectronesvuelveaserlamismaqueseobservantesdelaadicinde ADP.Porlotanto,larespiracinestacopladaalasntesisdeATP,estarelacinha recibido el nombre de control respiratorio o control de aceptor de fosfato. La razn de la velocidad de respiracin entre el estado activo (estado3) y el estado de reposo (estado 4),sehadenominadocomorazndelcontrolrespiratorioyesunamedidadela efectividaddelacoplamientoentrelatransferenciadeelectronesylafosforilacin oxidativa. Preparaciones de mitocondrias danadas y preparaciones a las cuales se les ha adicionado undesacoplante,exhibenunabajarazndelcontrolrespiratorio,indicandoquela integridad de la membrana mitocondrial se requiere para el acoplamiento. Despus de la adicin de ADP, el cual aumenta la velocidad de respiracin (estado 3), se puede agregar un unhibidor de la fosforilacin oxidativa como la oligomicina (realmente uninhibidordelaATPasamitocondrial),laoligomicinadetienelasntesisdeATP,y comoelprocesodetransportedeelectronesylasntesisdeATPestnacoplados,la respiracin (transporte de electrones) se inhibe casi completamente. PRCTICA# 6.-Acoplamiento de la fosforilacin oxidativa y la cadena de transporte de electrones LABORATORIO DE BIOQUMICA 48 Si despus de la inhibicin del consumo de oxgeno y la sntesis de ATP, se adiciona un desacoplante(2,4-DinitrofenoloFCCP),stecasuaunrpidoconsumodeloxgeno. Comolarespracinotransportedeelectronesestahoradesacopladodelasntesisde ATP, el transporte de eletrones continua pero la sntesis de ATP podra no ocurrir. Debenotarsequelaregulacindelavelocidadderespiracindeuntejidoporel suministrodelaceptordefosfato(ADP),esunasituacinfisiolgicanormal.Por ejemplo,cuandoelmsculoesejercitado,elATPsedescomponeenADPyPi,yla creatinina fosfato es convertida a creatinina conforme el enlace fosfato de alta energa es transferido para formar ATP por medio de la creatinina fosfocinasa. Conforme se acumula el ADP durante la actividad muscular, la respiracin o consumo de oxgeno es activado, y la energa generada de esta forma, permite que los niveles de ATP y creatinida fosfato se normalicen. MATERIALREACTIVOS Rata machoHielo escarchado Material de diseccinMedio 1 Pipetas de 1 y 5 mlMedio 2 HomogenizadorMedio 3 2 Tubos para centrfuga de 25 mlReactivo de Bradford Ultracentfuga refrigeradaReactivo de Biuret GasaEstndar de protena 8 Tubos de ensayeSoln. amortiguadora Tris Oxmetro con graficadorGlutamato/malato2.5mM /2.5 mM MicropipetasADP 112.5 mM MicrojeringasAntimicina A 1 mg/ml Espectrofotmetro2,4-dinitrofenol 40 mM Bano Mara Papel milimtrico DESARROLLO Aislamiento de Mitocondrias Sacrificarpordecapitacinunaratadepesoentre150y250gr;dejarladesangrar, extraerle el hgado y colocarlo en un vaso que contenga medio 1 previamente enfriado (a partirdestaexperiencia,esnecesariotrabajarcontodoslosrecipientesymediosde aislamiento sumerjidos en hielo escarchado). LABORATORIO DE BIOQUMICA 49 Se corta el hgado en pequenos trozos y se hacen dos lavados con medio 1, para evitar un exceso de sangre. Posteriormente se trasvasa el hgadp a un tubo homogenizador fro, se le adiciona aproximadamente 20 ml de medio 1. Homegenizar con el homogenizador. Sereparteelhomogenizadoporpartesigualesendostubosdecentrfugafrosyse adiciona medio 1 hasta partes del volmen del tubo. Centrifugar los tubos a 2500 -3000 rpm durante 10 minutos, en una centrfuga refrigerada a 4C. Se recupera el sobrenadante de los tubos y se adiciona medio 1 hasta partes del volmen del tubo. Nuevamentecentrifugarlostubosa7500rpmdurante10minutos,enunacentrfuga refrigerada a 4C. Decantaryresuspender;elsobrenadantesedesechayelprecipitadoqueyacontienelas mitrocondriaseresuspendeconlatcnicadededofroutilizandoaproximadamente2 mldemedio1(limpiarcongasaloslpidosquesedepositanalrededordeltubode centrfuga). Adicionar medio 1 a los dos tubos, hasta partes del volmen del tubo y centrifugar los tubos a 7500 rpm durante 10 minutos, en un centrfuga refrigerada a 4C. Decantar y resuspender al igual que la experiencia anterior, pero utilizando medio 2 para resuspender. Centrifugar los tubos a 9000 rpm durante 10 minutos, en una centrfuga refrigerada a 4C. Decantar y resuspender en medio 2, utilizando solamente 1 ml para los dos tubos, y reunir las dos suspensiones en un solo tubo. Determinacin de Protenas Se determina la concentracin de protenas de la suspensin mitocondrial resultante en el primerexperimento,empleandoelmtododeBiuretodeBradford(verlaprctica2de este manual). Consumo de Oxgeno por la Suspensin Mitocondrial Colocar 2900 l de medio 3 en la cmara receptora de la muestra del oxmetro.Equilibrar el medo 3 con aire a 25C y con agitacin continua, para esto se selecciona en eloxmetrolaposicindeaire(AIR)ysecalibraa100%.Secolocaelgraficadoren escala total (100% de aire) y se asegura el control de calibracin (CAL). La muestra mitocondrial (1 a 10 l) se introduce en la cmara, se debe tener cuidado que la concentracin mitocondrial no debe ser mayor de 2 3 mg/ml. LABORATORIO DE BIOQUMICA 50 Posterirmenteesnecesarioestablecerlalneabasedeactividadparalamuestra, adicionando 20 l de glutamato/malato (2.5 mM/2,5 mM) y dejar correr la reaccin 40 50 segundos (estado 4). Adicionar 8 l de ADP 112.5 mM y dejar que ocurra la reaccin hasta que todo el ADP sea utilizado (estado 3). Esto ocurre cuando la curva en el graficador regresa a estado 4. Adicionar3ldeantimicinaA1mg/mlydejarcorrerlareaccinde40a60segundos. Adicionar15lde2,4-dinitrofenol40mMydejarcorrerlareaccin6segundos. Desprender el papeldel graficador para su anlisis. CUESTIONARIO 1.Culesfueronlasconcentracionesresultantesenlacmarareceptoradela muestra, para glutamato/malato, ADP, antimicina A y 2,4-diitrofenol? 2.Elaborarungrficoenelcualsesenalenlosdiferentespuntosdeadicinala muestra mitocondrial y explicar los cambios de pendiente en la misma. 3.Cul es el fundamento del funcionamiento del electrodo de O2? 4.Qu parmetroes necesario conocer, para determinar la cantidad deO2 disuelto en el medio colocado en la cmara? CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA CONSULTADA LABORATORIO DE BIOQUMICA 51 REACTIVO DE BRADFORD Disolver100mgdeAzuldeCoomassiebrillante(BLUE-G-250)en50mldeetanolal 95%, agregar 100 ml de H3PO4 al 85% (p/v) y diluir con agua hasta 1000 ml. Guardar en frasco de color mbar. REACTIVO DE BIURET Disolver 3 gr de CuSO4 5H2O y 9 gr de tartrato sdico potsico en 500 ml de NaOh 0.2 M, agregar 5 gr de KI y diluir con NaOH 0.2 M hasta 1000 ml. Guardar en frasco mbar. SOLUCIN AMORTIGUADORA TRIS Disolver 0.60570 gr de Tris-base (5 mM), 10.43709 gr de KCl (140 mM) y 0.3722 gr de EDTA (1 mM), en 1000 ml de agua y ajustar el pH a 7.4. UREASA Trituray moler 1.5gr de semillas de soya o de haba, al polvo resultante se le adicionan 10mldeunamortiguadordefosfatos0.1MapH7.01conteniendo5mMde2-mercaptoetanol y se agita durante 1 hora. Se centrifuga la suspensin a 2000 rpm por 15 minutos.Elsobrenadanteseutilizacomosolucinstockdeenzima.Seguardaa temperatura de 3-5C. REACTIVO DE FENOL Disolver4.7grdefenolgradoreactivoen100mldeaguadesionizadaodestiladaque contenga7.5mldeunblanqueadorcomercial(NaOClal5%).BurbujeargasCl2 (KClO3+HCl) en la solucin y almacenar en frasco color mbar a 4C. APENDICE LABORATORIO DE BIOQUMICA 52 MEZCLA DE AMINOACIDOS Disolver0.12grdelosaminocidosdisponibles(tratardequeseaunacantidad proporcional de cada uno, peroel peso total debe ser 0.12gr)y disolverlos en 50 ml de agua destilada. La concentracin final es de aproximadamente 0.02 M DINITROFENOL Disolver 0.0756 gr (40 mM) de 2,4-dinitrofenol en 10 ml de etanol. AZIDA DE SODIO Disolver 0.26 gr (400 mM) de Na N3 en 10 ml de agua destilada. MEDIO 1 Manitol40.08gr(220mM),sacarosa23.96gr(70mM),MOPS0.4186gr(2mM)y EGTA0.3804gr(1mM),paradisolveren1000mldeaguadesionizada.ElEGTAse disuelve en la mnima cantidad de KHO antes de adicionarse. El pH se ajusta a 7.4. MEDIO 2 Se prepara igual que el medio 1, pero sin EGTA. MEDIO 3 KCl0.3728gr(100mM),KH2PO40.03402gr(5mM),MgCl20.03049gr(3mM)y HEPES 0.11915 gr (10 mM), se disuelven en 50 ml de agua desionizada. Se ajusta el pH a 7.4. LABORATORIO DE BIOQUMICA 53 1.Donald Voet / Judith G. Voet, 1992 Bioqumica Ediciones Omega, Barcelona. 2.J.M. Clark Bioqumica Experimental Ediciones Acribia, Zaragoza Espana. 3.Freifelder D. Tcnicas de Bioqumica y Biologa Molecular, 1981 Editorial Revert, Espana. 4.Lehninger, 1995 Principios de Bioqumica Segunda edicin. Omega 5.Devlin, Thomas M, 2000 Bioqumica con aplicaciones clnicas Tercera edicin. Ed. Revert. 6.Mathews Van Hold, 2002 Bioqumica Addison Wesley, Espana. BIBLIOGRAFA DE REFERENCIA