Manual de Laboratorio de Bacteriologa y Patogenia Bacteriana
Manual de Laboratorio de Bacteriologa y Patogenia
BacterianaINSTITUTO TECNOLGICO DE SONORADra. Ana Laura Miranda R.
M.C. Jorge Alberto Robles M. - MADN. Maribel Castro U.
INSTITUTO TECNOLGICO DE SONORA
DIRECCIN DE RECURSOS NATURALES
DEPTO. DE CIENCIAS AGRONMICAS Y VETERINARIAS
MANUAL DE PRACTICAS DEL
LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA Y PATOGENIA BACTERIANA
MC JORGE ALBERTO ROBLES MASCAREO
MC ANA LAURA MIRANDA ROMERO
MADN MARIBEL CASTRO URREA
DIRECTORIO
RECTOR
DR. ISIDRO ROBERTO CRUZ MEDINA
VICERECTOR ACADMICO
DR. JESUS HECTOR HERNANDEZ LOPEZ
VICERECTOR ADMINISTRATIVOMTRO. JAIME RENE PABLOS TAVARES
DIRECTOR ACADMICO
DIRECCIN DE RECURSOS NATURALES
DR. JAIME GARATUZA PAYANJEFE DE DEPARTAMENTO
CIENCIAS AGRONMICAS Y VETERINARIASPh.D. JAVIER ROLANDO REYNA
GRANADOSINDICE
Pgina
INTRODUCCIN2
REGLAMENTO INTERNO DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGA Y PATOGENIA
BACTERIANA3
PRCTICA 1. Medidas de seguridad en el laboratorio de
microbiologa5
PRCTICA 2. Morfologa microscpica y tinciones simples7
PRCTICA 3. Morfologa colonial y aislamiento por estra
cruzada11
PRCTICA 4. Tincin de gram17
PRCTICA 5. Tincin de ziehl-nielsen20
PRCTICA 6. Tinciones selectivas23
PRCTICA 7. Aislamiento de hongos y morfologa colonial 26
PRCTICA 8. Cultivo de anaerobios34
PRCTICA 9. Uso de medios selectivos38
PRCTICA 10. Uso de pruebas bioqumicas43
PRCTICA 11. Pruebas de sensibilidad a antimicrobianos47
PRCTICA 12. Coleccin y envo de muestras al laboratorio51
PRCTICA 13. Anlisis bacteriolgico de procesos piognicos54
PRCTICA 14. Anlisis bacteriolgico de heces y orina57
PRCTICA 15. Anlisis bacteriolgico de rganos62
PRCTICA 16. Mecanismos de patogenicidad
PRCTICA 17. Anlisis bacteriolgico de alimentos para consumo
animal66
BIBLIOGRAFA70
ANEXO 1. Lineamientos generales de laboratorios del itson 71
ANEXO 2. Riesgo biolgico73
ANEXO 3. Cuidados y manejo del microscopio75
ANEXO 4. Lavado, esterilizacin y desinfeccin de materiales
77
ANEXO 5. Tabla de interpretacin de prueba de sensibilidad a
antimicrobianos 78
ANEXO 6. Formatos de reporte79
INTRODUCCIN
La adquisicin de habilidades y conocimientos que implican el
aprendizaje de la Bacteriologa y Patogenia Bacteriana, tiene
implcito para el facilitador del curso y el estudiante, el manejo
de microorganismos potencialmente patgenos o patgenos para su
salud. De ah que resulta indispensable la comunicacin clara y
participacin responsable de cada uno de los integrantes del grupo
con la finalidad de minimizar y controlar los riesgos biolgicos,
fsicos y qumicos que se presentan en la realizacin de cada una de
las prcticas que se describen en este manual.El Manual de
Bacteriologa y Patogenia Bacteriana del Instituto Tecnolgico de
Sonora tiene como objetivo ser una gua para el alumno y el
facilitador del curso en el proceso de aprendizaje, da inicio con
la presentacin de los lineamientos del Laboratorio de Bacteriologa
y Patgena Bacteriana y se desarrolla de tal forma que permite al
alumno construir su propio conocimiento a travs de la adquisicin de
habilidades manuales, de observacin minuciosa y del conocimiento a
un nivel descriptivo, por lo que al inicio las prcticas de
laboratorio son muy sencillas y permiten la integracin gradual del
conocimiento, hasta la participacin del alumno en actividades de
campo como la toma de muestras, la integracin de la historia
clnica, que implican el manejo y contacto con las diferentes
especies animales, as como la interaccin con los productores para
recabar la informacin necesaria, culminando en la aplicacin e
integracin del conocimiento para llegar a un diagnstico definitivo.
Se incluyen adems en las ltimas sesiones el manejo de pruebas semi
automatizadas con principios biotecnolgicos, que tienen gran
demanda por su precisin y rapidez, con esto se pretende brindar al
alumno herramientas actualizadas y conocimientos de vanguardia para
su posterior aplicacin en el rea mdica. LINEAMIENTOS
INTERNOSDEL
LABORATORIO DE BACTERIOLOGA Y PATOGENIA BACTERIANAEste documento
tiene como objetivo evitar los riesgos de exposicin y accidentes de
contaminacin con microorganismos en el laboratorio.
1. Los maestros, alumnos de servicio social y estudiantes usaran
siempre bata blanca, limpia, abotonada y de manga larga.
2. La tolerancia mxima para permitir el acceso de los alumnos al
laboratorio es de 10 minutos.
3. Usar el cabello recogido, calzado cerrado. No se permitir el
acceso con pantaln corto por riesgo de quemaduras y
contaminacin.
4. Los alumnos deben tener las uas cortas, sin alhajas (anillos,
reloj, pulsera, etc.)5. No se permite el uso de sombrero y
gorras.
6. El alumno guardar sus objetos personales en las gavetas.
7. Est prohibido introducir alimentos, comer, beber, fumar y
masticar chicle en el laboratorio.
8. Apagar el telfono celular al ingresar al laboratorio, no se
permitir su uso interno.
9. Evitar llevarse objetos a la boca, tocarse la cara, cabello,
ojos, etc.
10. Mantener limpia la mesa de trabajo, desinfectarla al inicio
y al trmino de la prctica.
11. Las cajas de petri y materiales de laboratorio contaminados
se les retirara la cinta adhesiva y etiquetas y se colocarn en el
rea sucia para su posterior esterilizacin y lavado.
12. Los portaobjetos y pipetas contaminados, se colocarn en
recipientes con desinfectante, en el rea sucia, para su posterior
lavado.
13. Es requisito indispensable para el ingreso al laboratorio
que el alumno lleve el manual de practicas correspondiente.14. En
caso de heridas o erosiones en la superficie corporal, el alumno
dar aviso al maestro, quien evaluar la magnitud de la lesin y
aplicar las medidas de seguridad necesarias para el caso.
15. El alumno dar aviso inmediato al maestro en caso de
derramarse un cultivo viable o romperse una caja de petri. 16.
Antes de salir verifique que las llaves de gas y agua estn bien
cerradas.
17. Lavar perfectamente sus manos con agua y jabn y aplicarse el
antisptico a disposicin antes de salir del laboratorio.
18. Los reportes de cada prctica se entregarn una semana despus
de concluida, sin excepcin.
19. Los exmenes se aplicarn al inicio de cada prctica.
20. Es obligatorio que el alumno entregue el diagrama de flujo
previo a la realizacin de la prctica.
21. Todos los alumnos estn obligados a participar en el da
asignado para la esterilizacin y limpieza de los
materiales.ATENTAMENTE
Academia de Bacteriologa y Patogenia BacterianaPrctica 1
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGAINTRODUCCINAnte los mltiples casos que se han
presentado de infecciones asociadas al laboratorio en los ltimos
aos, organismos internacionales como la Organizacin Mundial de la
Salud (OMS), han recomendado tomar medidas preventivas para
proteger la salud de los investigadores, tcnicos laboratoristas y
estudiantes. Si se consideran estas medidas de seguridad el
personal que trabaja en laboratorios de microbiologa puede
minimizar el riesgo de infeccin.
Las medidas de seguridad deben ser adecuadas para el tipo de
microorganismo en estudio, pues estos varan en su capacidad de
producir infecciones. Algunos pueden ser inofensivos, otros pueden
causar sntomas leves; otros ms pueden ser graves para la salud y
los menos pueden tener una amplia capacidad de difundirse y causar
brotes epidmicos. Esta gama ha permitido a los investigadores
clasificar a los microorganismos en cuatro grupos de riesgo. Estos
se han publicado en las Medidas de seguridad del programa de
Microbiologa de la Organizacin Mundial de la Salud, (ver anexo
2).
COMPETENCIA: El alumno aplicar las medidas de seguridad que se
han implementado en el laboratorio de bacteriologa y patogenia
bacteriana para la proteccin de la salud y se comprometer a seguir
los lineamientos marcados en el Manual de Laboratorios del
ITSON.
DESARROLLO DE LA PRCTICA:Mtodos microbiolgicos
a) El alumno procesar la lectura sealada por el maestro en
relacin al Riesgo Biolgico del Manual de Laboratorios del ITSON, as
como la clasificacin de los microorganismos, las barreras de
proteccin y el tipo de laboratorio. Se sugiere la lectura del
Captulo I del libro Mtodos microbiolgicos de Collins (1989). b) El
alumno identificar en el laboratorio las reas de trabajo, rea sucia
y de lavado; adems del equipo y los materiales de bioseguridad, as
como su uso.Equipo de bioseguridad.
Extintor
Materiales para bioseguridad
Guantes de asbesto
Guantes de latex
Cubrebocas
Lentes antisalpicaduras
Bata Desinfectantes y antispticosCofia
Depsitos de material punzocortante
Bolsas de residuos biolgico infecciosos
RESULTADOSLee y analiza en grupo el anexo 1 del lineamiento
generales del laboratorio del itson y el anexo 2 de riesgo
biolgico.ASIGNACIN
Elaborar un mapa conceptual sobre la importancia de la
bioseguridad en la prevencin de enfermedades y accidentes dentro
del laboratorio de microbiologa. Del capitulo I medidas de
seguridad en laboratorio de Collins (1989). Prctica 2
MORFOLOGA MICROSCPICA Y TINCIONES SIMPLES
INTRODUCCIN
El microscopio es un instrumento que seguramente ha sido
utilizado por los estudiantes en otros cursos, sin embargo se ha
incluido en este curso para recordar su manejo y desarrollar la
habilidad para trabajar con el objetivo de inmersin cuyo uso es
obligado en la observacin de microorganismos y sus estructuras.
El microscopio compuesto es un instrumento de precisin que
consiste en una serie de lentes diseadas y acomodadas para proveer
las mximas amplificaciones posibles del espcimen que se va a
observar. El aumento total que se puede alcanzar en un microscopio
compuesto depende de la combinacin del ocular con el objetivo y se
obtiene multiplicando el nmero de aumento del ocular por el nmero
de aumento del objetivo. En el anexo 2, se pueden ver los cuidados
y manejo del microscopio.Tratar de observar a los microorganismos
con un microscopio ptico sin un contraste adecuado es casi
imposible, ya que como los microorganismos estn compuestos sobre
todo de agua, que es el medio en el que normalmente estn
suspendidos, es como tratar de ver un objeto blanco sobre un fondo
blanco. Las tinciones que se usan en microbiologa se desarrollaron
para incrementar el contraste entre el espcimen y el fondo que lo
rodea, ante la necesidad de poner de manifiesto la forma, tamao y
agrupacin de las bacterias, as como sus estructuras. Fue Roberto
Koch quien introdujo en microbiologa el uso de preparaciones fijas
o permanentes (frotas), al dejar secar al aire las preparaciones en
fresco y sin teir, para fijarlas qumicamente y teirlas despus con
colorantes derivados de la anilina. En la actualidad, la mayora de
las tcnicas de tincin usan frotis fijos que consisten en colocar
sobre un portaobjetos, una suspensin de bacterias que se deja
secar. A la preparacin as obtenida, se le pasa rpidamente sobre una
flama para que el calor fije las clulas al portaobjetos. La accin
desnaturalizante del calor deshidrata la suspensin y mata a la
mayora de las bacterias, dejndolas en posibilidad de ser teidas
posteriormente, as mismo, evita que las bacterias se desprendan del
portaobjetos durante los diferentes procesos de tincin. Es
importante saber que algunas bacterias pueden sobrevivir a la
fijacin del calor, por lo que todo frotis fijo debe considerarse
potencialmente infeccioso.
En el procedimiento de tincin se emplea un slo colorante. Una
vez fija la preparacin, se le agrega la solucin colorante y se deja
actuar aproximadamente un minuto, se enjuaga con agua para quitar
el exceso de colorante, se deja secar y se procede a observar al
microscopio.
Los colorantes son sustancias que originalmente se derivaron de
la anilina y que qumicamente estn constituidos por uno o ms anillos
aromticos. Estos anillos aromticos presentan sustituyentes llamados
cromforos que son responsables del color, formando los compuestos
cromgenos. Estos cromgenos presentan adems, grupos ionizables
llamados auxocromos que permiten unir el colorante a estructuras de
carga contraria de clulas y tejidos. Sin estos grupos las
soluciones coloridas no podran teir.Figura1. Colorante
safranina
Fuente:
http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/v10n3/larez.html
COMPETENCIA: El alumno diferenciar la forma y agrupacin
microscpica de los microorganismos mediante el uso de tinciones
simples y el microscopio compuesto.MATERIAL:
Microscopio de campo luminoso
Tela suave y papel seda
Aceite de inmersin
Lpices de colores
Soluciones de cristal violeta, azul de metileno, Verde de
malaquita, safranina y fucsina bsica.
Cultivo de bacterias
Portaobjetos
Asa bacteriolgica
Mechero de Bunsen
Puente de coloracin.
MTODOS:
Antes de iniciar con los procedimientos de la prctica leer el
anexo
1. Elaboracin de frotis a partir de un medio slido
-Marca en un extremo los portaobjetos limpios y
desengrasados
-Con el asa bacteriolgica o un gotero, coloca una pequea gota de
agua en el centro del portaobjetos.
-Con el asa estril toma una pequea cantidad de crecimiento y con
movimientos giratorios haz una suspensin homognea en la gota de
agua, extendindola para formar una pelcula delgada.
Esterilice nuevamente el asa.
- Deja secar al aire el frotis
-Fija el frotis al calor pasando la parte posterior del
portaobjetos dos o tres veces por la flama del mechero, hasta
alcanzar una temperatura que sea soportable en el dorso de la mano.
Es importante que la laminilla no se caliente demasiado pues podras
calcinar a las bacterias modificando as sus caractersticas
morfolgicas y tintoriales.
-Colocar el frotis en el puente de tincin y cubrirlo con el
colorante seleccionado durante un minuto- Lavar con chorro de agua
suave y escurrir
-dejar secar al aire y observar al microscopio con todos los
objetivos 10X, 40X y 100X
2. Elaboracin de frotis a partir de medio lquido
- Marca en un extremo los portaobjetos limpios y
desengrasados.
- Sin poner agua, coloca con el asa estril dos o tres gotas del
cultivo en el centro del portaobjetos y extindelas para formar una
pelcula delgada y homognea.
- Deja secar al aire los frotis
- Fija los frotis al calor como se explico en el caso
anterior.
- Colocar el frotis en el puente de tincin y cubrirlo con el
colorante seleccionado durante un minuto
- Lavar con chorro de agua suave y escurrir
- Dejar secar al aire y observar al microscopio con todos los
objetivos 10X, 40X y 100X
- Realizar los dibujos correspondientes de cada una de las
observaciones realizadas, indicando formas y agrupaciones. Compara
tus observaciones con la figura 2.ASIGNACIN:1. Incluir en el
reporte los esquemas de las preparaciones observadas con los
objetivos 10x, 40x y100x de cada uno de los microorganismos.
2. Investiga quien fue Roberto Koch y haz una resea de sus
principales aportaciones a la microbiologa.
3. Investiga la forma, y caractersticas generales de los
microorganismos que observaste e incluye la referencia de las
fuentes consultadas.Prctica 3
MORFOLOGA COLONIAL Y AISLAMIENTO POR ESTRA
CRUZADAINTRODUCCINAdems del mtodo de las diluciones para aislar
microorganismos, existen otros que son cualitativos, siendo el de
la estra cruzada el ms comn. Este consiste en tomar directamente de
la muestra que nos interesa, una pequea cantidad con ayuda del asa
bacteriolgica que se deposita en la superficie del medio de cultivo
slido; luego se hacen estras con movimientos sucesivos del asa
hacia un lado y otro, a la vez que se recorre de una orilla hacia
el centro de la placa. Este procedimiento es equivalente a las
diluciones ya que cada vez que se va extendiendo el contenido
microbiano a lo largo de la estra, llegar el momento en que an
cuando se tenga en un principio una gran cantidad de organismos, se
obtendrn colonias aisladas en algn punto a lo largo de la serie de
estras. Un buen aislamiento en placa se dar cuando se obtengan
colonias aisladas de microorganismos, con una distancia que nos
permita distinguir y describir su morfologa colonial. La observacin
cuidadosa de las colonias ha mostrado que las caractersticas
morfolgicas suelen ser constantes el medio de cultivo usado y que
stas varan en apariencia dependiendo del grupo microbiano. Esto ha
permitido iniciar el reconocimiento de los principales grupos de
microorganismos sin llegar a ser una identificacin definitiva.
Las caractersticas que se toman en cuenta para describir la
morfologa colonial son las descritas a continuacin y que se
observan en la figura 2.Tamao: medir el dimetro en milmetros
Color: coloracin de la colonia y del medio de cultivo
Forma: pueden ser puntiformes, circulares o irregulares
Elevacin: pude ser plana, elevada, convexa, pulvinada, umbonada,
umbilicada o crateriforme.
Bordes: pueden ser enteros, lobulados, ramificados,
filamentosos, dentados o irregulares.
Superficie: puede ser lisa, rugosa o granular.
Luz reflejada: puede ser brillante o mate
Luz transmitida: puede ser opaca, transparente o translcida.
Consistencia: puede ser dura o suave, esta ltima puede ser
butirosa, mucoide o friable.
Figura 2. Morfologa colonial
FUENTECOMPETENCIA: Adquirir los conocimientos necesarios para
diferenciar las formas coloniales bacterianas y desarrollar las
habilidades para poder llevar a cabo el aislamiento de bacterias
por medio de la tcnica de estra cruzada.
MATERIAL:
Cajas petri con medios de cultivo:
1. Generales (Agar Nutritivo)
2. Diferenciales (Agar Sal Manitol, Verde Brillante y TCBS)3.
Caldo tripticaseina de soya (medio lquido en tubo).4. Agar
Nutritivo inclinado (en tubo).
Cultivos bacteriolgicos varios:1. Bacillus,
.- Escherichia coli,
- Klebsiella pneumoniae
2. Pseudomonas- Staphylococcus .
Cultivos de levaduras:
1. Torula sp,
- Sacharomyces.
Materiales:
Asa bacteriolgica
Portaobjetos
Mechero de Bunsen
Cubreobjetos
Chispa
Regla Gradilla
Bolsa de plstico transparentePuente para tincin
MTODO
Descripcin de la morfologa colonial.
1. Escoger 2 medios de cultivo diferentes y seleccionar una
colonia aislada .
2. Medir cada una de las colonias (usar regla) y expresarlo en
mm.
3. Describir el color de cada colonia.
4. Describir la forma, borde, elevacin y superficie de acuerdo a
la gua anexa.
5. Observar la luz reflejada y transmitida a contraluz, sin
abrir la caja de Petri.
6. Apreciar la consistencia tocando la colonia con el asa
previamente flameada y enfriada.
I. Procedimiento para la siembra en estra cruzada.
NOTA IMPORTANTE: Sembrar y manipular los cultivos en un rea
aproximada de 20 cm alrededor del mechero de Bunsen.No abrir la
caja fuera de esta rea.
No hablar mientras siembres y manipules los cultivos.
1. Flamear y enfriar el asa bacteriolgica.
2. Tomar una pequea porcin de una colonia aislada.
3. Tocar el agar suavemente y deslizar el asa sin rasgarlo a
manera de zigzag. (Observar el esquema anexo en la parte marcada
con el nmero 1 (primer cuadrante).
4. Flamear al rojo el asa, enfriar y extender las ltimas lneas
de siembra del primer cuadrante. (Observar el esquema anexo en la
parte marcada con el No.2. (segundo cuadrante).
5. Repetir el mismo procedimiento segn se indica en el esquema,
en el tercero y cuarto cuadrante.
6. Practica este procedimiento en las circunferencias anexas al
final de esta prctica usando un lpiz.Figura 3. Tcnica de
aislamiento por estra cruzada
7. Identifica las cajas con los siguientes datos:
Nmero de equipo.
Horario de laboratorio
Nombre del cultivo bacteriano.
8. Incubar las cajas hasta las 24 horas a 37C. (El maestro
indicar el rea a usar de la incubadora).
9. Describir la morfologa colonial de una colonia aislada de
cada una de las cepas bacteriolgicas que se proporcionaron.
10. Introducir las cajas de Petri en una bolsa de plstico
(solicitarla en el almacn) y colocarlas en el refrigerador con su
respectiva identificacin.
II. Siembra en medios slidos en tubo con agar inclinado1. Tomar
una asada del cultivo a sembrar con el asa previamente esterilizada
y enfriada
2. Abrir el tubo de agar cerca de la flama, sin soltar la
tapadera
3. Introducir el asa con el cultivo hasta el fondo del tubo
4. Arrastrar el asa haciendo zigzag sobre la superficie del
agar
5. Incubar los tubos durante 24 hrs a 37C (el maestro indicar el
rea a usar de la incubadora)
6. Introducir los tubos en una bolsa de plstico y colocarlas en
el refrigerador con su respectiva identificacin.III. Siembra en
medio lquido1. Tomar una asada del cultivo a sembrar con el asa
previamente esterilizada y enfriada
2. Abrir el tubo de agar cerca de la flama, sin soltar la
tapadera
3. Introducir el asa con el cultivo hasta el fondo del tubo
4. Agitar el asa vigorosamente dentro del medio de cultivo
5. Incubar los tubos durante 24 hrs a 37C (el maestro indicar el
rea a usar de la incubadora)
6. Introducir los tubos en una bolsa de plstico y colocarlas en
el refrigerador con su respectiva identificacin
ASIGNACIN
1. Investiga al menos otros 2 mtodos de aislamiento de cultivos
bacterianos.
2. Compara el mtodo desarrollado en la practica con los mtodos
que investigaste, seala adems las ventajas y desventajas de cada
uno de ellos.
Prctica 4
TINCIN DE GRAM
INTRODUCCIN
En 1884 un mdico dans, Hans Cristian Gram, desarroll y public un
mtodo de tincin que lleva su nombre y que es de enorme utilidad en
cualquier laboratorio de bacteriologa. La tcnica adems de revelar
detalles referentes a la forma y agrupacin bacteriana, como
cualquier otra tcnica de tincin, permite clasificar a las bacterias
en dos grandes grupos Gram positivas y Gram negativas.
La diferenciacin de Gram se tiene en el color que adquieren las
bacterias cuando se tratan con el colorante cristal violeta seguido
por una solucin yodurada de potasio (lugol), como mordiente o
mordente. Ciertas bacterias pierden la coloracin violeta rpidamente
cuando se decoloran con alcohol etlico, en tanto que otras la
pierden con ms lentitud. Despus de la decoloracin se usa un
colorante de contraste que casi siempre es safranina. Las bacterias
resistentes a la decoloracin conservan una tonalidad azul o morada
clasificndose como Gram positivas. Las bacterias que no pueden
retener la tincin con cristal violeta, toman la coloracin de
contraste presentando una coloracin rosa o roja; a estas bacterias
se les denomina Gram negativas. Es importante observar que la base
de esta diferenciacin es ms bien la velocidad de decoloracin que
una caracterstica absoluta de las bacterias, por lo que el
procedimiento se debe realizar con mucho cuidado.
La afinidad tintorial mostrada por las bacterias Gram positivas
y Gram negativas, se debe a las diferencias en la estructura de la
pared celular. Las bacterias Gram negativas tienen una capa delgada
de peptidoglicano rodeada de una membrana externa construida de
fosfolpidos y lipopolisacrido.
La tincin de Gram es aplicada en forma universal como primer
paso en la identificacin de las bacterias. Desafortunadamente
existen algunos grupos bacterianos en los cuales la tincin de Gram
no es de utilidad taxonmica, por ejemplo: las espiroquetas,
micobacterias, clamidias, rickettcias y micoplasmas.
El mtodo de la tincin de Gram ha sufrido varas modificaciones y
algunas de stas son incluso mejores que el mtodo original. Los
objetivos principales para modificar la tincin han sido:
1.Obtener un colorante primario ms estable que el original, ya
que ste se deteriora rpidamente
2.Reducir el tiempo requerido para completar la tcnica.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn los conocimientos necesarios
para aplicar la tcnica de tincin de Gram en especies bacterianas
conocidas y poder determinar si pertenecen al grupo Gram positivo o
Gram negativo.
MATERIALSolucin de cristal violeta
Solucin de lugol
Solucin de alcohol-acetona
Solucin de safranina
Portaobjetos
Asa bacteriolgica
Mechero Bunsen
Microscopio
Aceite de inmersin
Cepas de Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus y
Escherichia coli.Puente para tincinMTODOS1. Tincin de Gram
- Haga frotis de cada bacteria y fjelos a la flama del mechero,
tome en cuenta el procedimiento a seguir si los hace a partir de
medio slido o lquido.
- Cubra los frotis con la solucin de cristal violeta (colorante
primario).
Deje actuar esta mezcla por 1 minuto.
-Escurra el exceso de colorante y lave con un chorro suave de
agua.
-Sacuda la laminilla para evitar gotas gruesas de agua y aplique
la solucin de lugol (mordente). Deje actuar por 1 minuto.
-Escurra el exceso de lugol y lave con un chorro suave de
agua.
-Sacuda la laminilla y aplique el alcohol-acetona (agente
decolarante) durante 3 a 5 segundos. Corte el proceso de
decoloracin lavando con agua.
-Sacuda el frotis y aplique safranina (colorante de contraste) y
djelo actuar por 10 -20 segundos.
-Lave por ltimo con un chorro de agua suave y deje secar el
frotis al aire y use un papel absorbente presionando ligeramente
sin tallar.
-Observe al microscopio con el objetivo de inmersin.
INFORME
1.Haga esquemas de las preparaciones realizadas con las cepas de
referencia y anote el nombre de las bacterias, la forma, agrupacin
y su reaccin de Gram.
2.Haga esquemas de las preparaciones de las mezclas de bacterias
teidas.ASIGNACIN1. Explique cual es el paso crtico en la tincin de
Gram.
2. Indique al menos dos factores que pueden alterar los
resultados en la tincin de Gram.3. Anote cinco gneros bacterianos
de importancia veterinaria que sean Gram positivos y cinco Gram
negativos.PRCTICA 5
TINCIN DE ZIEHL-NIELSEN
INTRODUCCINAdems de la tincin de Gram, hay otra tincin
diferencial empleada en bacteriologa que es la tincin de
Ziehl-Nielsen o cidorresistente. Esta tincin se fundamenta en que
la mayora de las bacterias son decoloradas por una mezcla de
alcohol-cido siendo la excepcin las de los gneros Mycobacterium y
Nocardia. Estos gneros bacterianos forman un grupo de
microorganismos que se definen, con base en sus propiedades
tintoriales, como bacilos cido alcohol resistentes (BAAR). Son
relativamente impermeables a los colorantes bsicos, pero una vez
teidos, retienen fuertemente el colorante y resisten la decoloracin
con solventes orgnicos acidificados. La propiedad de ser
cido-alcohol resistente est determinada por la composicin de la
pared celular, la cual adems de la peptidoglicana, est constituida
por un alto porcentaje de glicolpidos hidrofbicos (ceras), como el
cido miclico en Mycobacterium y el cido nocrdico en el gnero
Nocardia. La presencia de estas cepas hidrofbicas previenen la
penetracin de soluciones acuosas, siendo la causa de que estos
microorganismos no puedan ser teidos por los mtodos convencionales
como la tcnica de Gram.
En la actualidad la tincin de Ziehl-Neelsen tiene gran
importancia como una de las pruebas en el diagnstico de
Mycobacterium tuberculosis agente causal de tuberculosis,
enfermedad granulomatosa crnica tanto del hombre como de los
animales y cuya incidencia ha aumentado recientemente.
Es importante mencionar que en el anlisis de un frotis de
material clnico sospechosos de contener bacilos tuberculosos, el
hallazgo de un solo bacilo cido alcohol resistente tiene valor
diagnstico ya que en la mayora de los casos no son abundantes. Sin
embargo la interpretacin del hallazgo debe hacerse con cautela y
con base en la historia clnica y otras pruebas de laboratorio,
debido a la existencia de especies saprofitas de Mycobacterium y
que podran conducir a un diagnstico falso. Por otra parte, existen
algunas especies de Corynebacterium y Nocardia que ocasionalmente
pueden comportarse como bacterias cido-alcohol resistente.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn los conocimientos para llevar
a cabo la tincin de Ziehl-Nielsen sobre clulas bacterianas
conocidas para poner de manifiesto las diferencias entre las
bacterias cido alcohol-resistentes y las que no lo son.
MATERIAL:
Solucin fucsina fenicada
Solucin de alcohol cido
Solucin de azul de metileno
Puente de coloracin
Portaobjetos
Mechero de Bunsen
Microscopio
Asa bacteriolgica
Aceite de inmersin
Cepas de Staphylococcus aureus, Bacillus y Klebsiella
Montajes de Mycobacterium tuberculosis teidos con
Zielh-Neelsen
MTODOS:
Tcnica de Ziehl-Neelsen.
1.Haga dos frotis con las cepas asignadas.
2.Deje secar los frotis al aire y fjelos con calor.
3.colocar papel filtro sobre el frotis
4.Cubra los portaobjetos con fucsina fenicada.
5.Caliente suavemente con la flama del mechero hasta la emisin
de vapores y mantenga la emisin durante cinco minutos.
NOTA: El colorante no debe hervir ni secarse, por lo que puede
continuar agregando colorante conforme sea necesario.
6.Dejar enfriar
7.Escurra el exceso de colorante y retire suavemente el
papel
8.lave con un chorro de agua suave.
9.Decolore exhaustivamente con alcohol cido, realizando dos
decoloraciones de un minuto cada una
10.Lave con un chorro suave de agua.
11.Cubra el frotis con azul de metileno y djelo actuar durante
un minuto.
12.Lave por ltimo con un chorro suave de agua y deje secar la
preparacin.
13.Observe los frotis con objetivo de inmersin.
14.Describa la morfologa microscpica de las cepas a las que
realiz la tincin y al montaje de Mycobacterium tuberculosis y
realice esquemas de c/u de los frotis.Las bacterias cido alcohol
resistentes (BAAR +) se tien de color rojo y las no cido-alcohol
resistentes (BAAR -) de color azul.
INFORME1.-Describa la morfologa microscpica de las cepas a las
que realiz la tincin de Ziehl-Nielsen y haga esquemas de cada uno
de los frotis
ASIGNACIN1 Investigar Por qu es necesario calentar el colorante
primario en esta tcnica?
2. Investigar a que se debe la propiedad de algunas bacterias de
ser cido-alcohol resistente.PRCTICA 6
TINCIONES SELECTIVAS
INTRODUCCINMuchas estructuras bacterianas se pueden observar en
condiciones adecuadas, sobre todo cuando se aplican ciertas tcnicas
de tincin. Aunque algunos constituyentes celulares son comunes en
todas las clulas, otros solo los poseen ciertas especies. Las
tinciones selectivas se utilizan para poner de manifiesto
estructuras celulares o bien para obtener informacin acerca de sus
componentes a travs de su reaccin con los colorantes. En general
las tcnicas de tincin se basan en el hecho de que la estructura
celular que se desea poner de manifiesto tiene mayor grado de
afinidad por los colorantes utilizados, que el resto de la clula.
As se puede teir o poner de manifiesto estructuras como la cpsula,
pared celular, material gentico, fimbrias o pilis, flagelos,
endoesporas e inclusiones citoplasmticas.
Los colorantes cidos, que no tien a la clula, son a veces tiles
para revelar las capas superficiales con bajo ndice de refraccin,
como la cpsula, que se encuentra sobre la pared celular envolviendo
a las bacterias. La mayora de las cpsulas bacterianas estn
compuestas por polisacridos mientras que otras son de naturaleza
polipeptdica. La cpsula desempea un papel importante en la
virulencia de algunas bacterias patgenas, ya que les confieren
propiedades antifagocticas que interfieren con los mecanismos de
defensa de los organismos infectados. Las cpsulas no pueden
observarse en frotis teidos con las tcnicas usuales, porque son
incapaces de retener el colorante y porque los procesos de fijacin
al calor y el lavado las disuelven; por lo tanto, las tinciones
negativas como la de rojo congo y la de tinta china o nigrosina
donde no se tie la bacteria pero s su alrededor y no se usa el
calor, ni sustancias qumicas fuertes, resultan ser la mejor
opcin.
Las esporas bacterianas o endoesporas son estructuras producidas
durante el ciclo de vital de ciertos gneros, que presentan una gran
resistencia a agentes fsicos y qumicos debido al nmero y estructura
qumica de sus cubiertas. Por sta misma razn, las endoesporas son
impermeables a los colorantes y en una tincin normal, se observan
como estructuras altamente refringentes y sin teir. Sin embargo
cuando se aplica calor a un frotis cubierto de verde malaquita como
en el caso de la tcnica de Schaeffer y Fulton, se facilita la
penetracin del colorante. El lavado y teido posterior con safranina
como colorante de contraste, permite ver a las endoesporas de color
verde dentro de clulas rojas.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn y aplicaran los conocimientos
para realizar algunas tcnicas de tincin selectivas y observar
algunas estructuras bacterianas (cpsulas y endoesporas).
MATERIALSolucin de cristal violeta
Solucin de lugol
Solucin de alcohol-acetona
Solucin de verde malaquita
Solucin de safranina
Solucin de rojo congo
Solucin mordente de cpsula
Papel filtro
Agua destilada
Portaobjetos
Pinzas de diseccin sin dientes
Puente de tincin
Mechero de Bunsen
Asa bacteriolgica
Pizeta
Microscopio
Aceite de inmersin
Cepas de Klebsiella pneumoniae, Bacillus sp y Staphylococcus
aureus MTODOSI. Observacin de cpsula
Tcnica del rojo congo
1. Coloque una pequea gota de rojo congo en el centro del
portaobjetos.
2. Tome un poco de cultivo de Klebsiella pneumoniae y suspndala
en la gota de rojo congo, extindala hasta formar una pelcula
delgada.
3. Deje secar al aire y NO FIJE EL FROTIS AL CALOR.4. Cubre el
frotis con mordente de cpsula y djelo actuar por un minuto.
5. Lave el frotis con agua destilada y deje secar al aire.
6. Observe el portaobjetos con lente de inmersin.
7. Repita el mismo procedimiento con la cepa de Staphylococcus
aureus.
8. Realice los esquemas de sus observaciones.
9. Al terminar la observacin, deseche la preparacin en un frasco
con desinfectante.
Figura 4. Estructura bacteriana Figura 5. Observacin microscpica
de capsula
Fuente: www.alaquarium.com/bacterias
Fuente: ASM MicrobeLlibrary.org
II. Observacin de esporas.
Tcnica de tincin de Gram.
1. Haga un frotis de la manera usual con Bacillus.2. Tia el
frotis por la tcnica de Gram.
3. Observe el frotis con lente de inmersin.
4. Repita el mismo procedimiento con el cultivo de
K.pneumoniae.
5. Realice los esquemas de sus observaciones.
6. Al terminar la observacin, deseche la preparacin en un frasco
con desinfectante.
Tcnica de Schaeffer y Fulton.
1. Haga un frotis de la manera usual con Bacillus.2. Cubra el
frotis con un papel filtro e imprgnelo con verde malaquita.
3. Caliente el frotis con el mechero hasta la emisin de
vapores.
4. Mantenga la emisin por cinco minutos. Evite que el colorante
hierva o se seque el frotis.
5. Deje enfriar y desprenda suavemente el papel filtro.
6. Lave el frotis exhaustivamente con un chorro de agua suave y
sacdalo para eliminar el exceso de agua.
7. Cubra el frotis con safranina y djela actuar por un
minuto.
8. Lave con un chorro de agua suave.9. Secar al aire la
preparacin o con ligera presin con toallas absorbentes.10. Observe
con lente de inmersin.Figura 6. Esporas bacterianas. A)
subterminales b y c) centrales d) terminales Fuente: Johnson T. And
Case C (1992).Figura 7. Esporas bacterianas.FuenteASIGNACIN
1. investigue cinco ejemplos de bacterias de importancia en
veterinaria que tengan capsula.
2. investiga que compuestos qumicos pueden formar a las
capsulas.
3. investigar tres ejemplos de bacterias de importancia en
veterinaria que formen esporas.
4. investigar cuales son las partes que forman a una espora
bacteriana.
PRCTICA 7
AISLAMIENTO DE HONGOS Y MORFOLOGA COLONIAL
INTRODUCCIN
Los hongos son organismos eucariticos unicelulares o
filamentosos con paredes celulares compuestas de quitina y otros
polisacridos, no fotosintticos, saprofitos o parsitos,
quimiorganotrficos aerobios que se nutren por absorcin y se
propagan por esporas producidas en condiciones normales de
reproduccin sexual y asexual. Esta definicin tan vaga y amplia se
hizo para abarcar todas las anomalas morfolgicas y fisiolgicas que
ocurren entre los hongos.
La clasificacin de los hongos se basa en gran parte en las
estructuras de reproduccin que incluyen la naturaleza del ciclo
biolgico, las estructuras reproductoras y las esporas. Los
principales grupos taxonmicos se basan en las esporas de
reproduccin sexual. Aunque en un sentido sistemtico formal las
levaduras no son diferentes del resto de los hongos, en la prctica
es frecuente que stas se traten por separado de los hongos
filamentosos tanto en los sistemas de clasificacin como de
identificacin, ocurriendo lo mismo para otro tipo de hongos como
son las setas. Algunos hongos presentan un comportamiento dimrfico,
esto significa que pueden presentar una forma filamentosa y otra
levaduriforme dependiendo del ciclo de vida, del hbitat en el que
se encuentren o de las condiciones de cultivo.
Tradicionalmente los hongos se han separado en dos grandes
grupos, los Mixomicetos y los Eumicetos. Los mixomicetos
representan la lnea divisoria entre los protozoos y los hongos.
Desde el punto de vista veterinario, los hongos tienen gran inters
debido a que algunas especies causan enfermedades (micosis) y otras
se desarrollan en el alimento para animales produciendo
micotoxinas, que pueden provocar intoxicaciones alimenticias.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn las habilidades para llevar a
cabo el aislamiento de hongos, y realizar la diferenciacin de las
estructuras que los forman mediante una descripcin morfolgica tanto
macroscpica como microscpica
MATERIAL
Cajas de petri con agar rosa de bengala
Cajas petri con agar dextrosa Sabouraud
Tubos de ensaye de 16 X 150 con 10 ml de formaldehdo al 10%
Asa en ngulo recto
Portaobjetos y cubreobjetos
Puente de coloracin
Solucin de lactofenol azul de algodn.
Barniz de uas transparente
Fenol al 3 %.
Algodn
Papel Kraft.
Microscopio
Cubrebocas
Guantes de latex
Jabn antisptico lquido verificar con Jorge si esta en el listado
de uso del maestro.Cepas de Penicillium sp, Aspergillus sp y
Sacharomyces cerevisae o Torula MTODOSPRIMERA SESION
Aislamiento de hongos
1. Revisa antes de iniciar que hayas cumplido con las
indicaciones de la NOTA IMPORTANTE.
2. Coloca sobre el papel humedecido los cultivos de hongos a
sembrar, el mechero de bunsen y los medios de cultivo.
3. Esteriliza al fuego el asa doblada en ngulo recto (90) y toma
un poquito del micelio areo.
4. Siembra el hongo por picadura en el centro de una placa de
agar dextrosa Sabouraud.
5. Repite el mismo procedimiento con la placa de agar Rosa de
Bengala.
6. Siembra el hongo levaduriforme (Sacharomyces o Torula)
estriando sobre la placa de agar.(como en la prctica 3)
7. Sella las placas con cinta maskintape.
8. Incuba los medios de cultivo inoculados a temperatura
ambiente durante 3 - 4 das.
9. Revisa los medios de cultivo cada 24 a 48 hrs.
10. Anota los cambios de forma y color que se presentan.
Observacin de la morfologa microscpica.1. Revisa antes de
iniciar que hayas cumplido con las indicaciones de la NOTA
IMPORTANTE.
2. Coloca sobre el papel humedecido los cultivos de hongos a
sembrar, el mechero de bunsen y los medios de cultivo.
3. Marca con lpiz de cera los portaobjetos y coloca en el centro
una gota de lactofenol azul de algodn.
4. Haz una suspensin con un poquito del micelio revolviendo
exhaustivamente para separarlo.
5. Coloca un cubreobjeto.
6. Observa con objetivos 10X y 40X.
7. Realiza los dibujos de las estructuras que observes.
8. Compara tus dibujos con los esquemas anexos.
9. Repite el procedimiento para la levadura, pero tiendo con
Gram
SEGUNDA SESIN
1. Revisa antes de iniciar que hayas cumplido con las
indicaciones de la NOTA IMPORTANTE.
2. Coloca sobre el papel humedecido los cultivos de hongos que
sembraste en la primera sesin y el mechero de bunsen.
3. Describe la morfologa colonial de los hongos,
intercambindolos entre los equipos.
4. Describe las siguientes caractersticas y registrar conforme
se pide en el cuadro siguiente. Cuadro 1. Caractersticas a evaluar
de la morfologa colonial de los hongos.TamaoAspectoColor del
micelio areoColor del micelio vegetativoProduccin y color del
pigmento difusible
Mide en cm, el dimetro de la colonia fungal.
Observa la superficie del hongo, que puede ser; algodonoso,
aterciopelado, grnulos o pulvurulento.Observa los cambios de color
y descrbelos partiendo del centro a la periferia.Observa el grueso
del agar y describe el color del crecimiento fungal.
Nota algn cambio de color en el medio de cultivo original.
5. Realiza preparaciones en fresco de los dos hongos
seleccionados.
6. Coloca un poco de micelio areo en un portaobjetos que
contenga una gota de lactofenol azul de algodn.
7. Dispersa el micelio en el colorante.
8. Cubre la preparacin con un cubreobjetos.
9. Observa la preparacin al microscopio usando objetivos seco
dbil y seco fuerte.
10. Describe la morfologa microscpica considerando las
siguientes caractersticas mostrados en cuadro 2 y compara con las
figuras 8 y 9.Cuadro 2. Morfologa microscpicaDimetro de micelioTipo
de micelio
Microsifonado, macrosifonado o cenoctico.Observa las hifas.
Describe si son septados, ramificadas, pigmentadas o hialinas
Figura 8.Tipo de esporas y estructuras reproductoras. Fuente:
Williams et. al (1997).Figura 9. Tipos de Hifas Fuente: Williams
et. al (1997).
ASIGNACIN
1. Realice los esquemas de la morfologa colonial de los hongos
que se observaron.2. Investigue en libros, revistas, artculos y
fuentes confiables sus caractersticas y estructuras microscpicas.3.
Realice esquemas de sus estructuras microscpicas.PRCTICA 8
CULTIVO DE ANAEROBIOS
INTRODUCCIN
Un factor que influye de manera importante en el crecimiento
microbiano es el oxgeno y aunque es un gas muy reactivo, muchos
microorganismos dependen de la disponibilidad del oxgeno molecular
como nutriente. Los microorganismos se pueden clasificar de acuerdo
a sus necesidades y tolerancia al oxgeno en: aerobios estrictos,
microaerofilicos, anaerobios facultativos, anaerobios estrictos y
anaerobios aerotolerantes. Los aerobios estrictos dependen del
oxgeno, ya que lo utilizan como aceptor final de electrones en la
cadena respiratoria y no pueden llevar a cabo la fermentacin. Los
microaerofilicos no requieren de oxgeno pero lo toleran a bajas
concentraciones. Los anaerobios facultativos utilizan el oxgeno si
est disponible, pero tambin pueden crecer en ausencia del mismo, ya
que pueden realizar un metabolismo oxidativo o fermentativo
dependiendo de las condiciones de cultivo. Los anaerobios estrictos
no pueden utilizar el oxgeno ya que solo pueden efectuar un
metabolismo fermentativo e incluso no crecen o mueren en presencia
de oxgeno debido a que les resulta txico an a bajas
concentraciones, mientras que los anaerobios aerotolerantes crecen
a bajas o elevadas concentraciones de oxgeno aunque no lo utilicen
en su metabolismo. An cuando la toxicidad del oxgeno se manifiesta
claramente sobre los anaerobios, a concentraciones elevadas resulta
txico incluso para los aerobios estrictos ya que el oxgeno es un
agente oxidante fuerte, capaz de generar un grupo de radicales
libres (singlete, superxido, perxido e hidrxilo), que reaccionan
sobre molculas orgnicas. Los microorganismos que toleran el oxgeno,
por lo general contienen enzimas que los protegen de la toxicidad
como son la catalasa, peroxidasa y la superxido dismutasa.
Mientras que la aereacin se emplea para incrementar el
crecimiento de los microorganismos aerobios, el oxgeno debe ser
excluido del medio de cultivo para permitir el crecimiento de los
anaerobios estrictos. Esto se puede hacer agregando sustancias
reductoras al medio de cultivo que reaccionan con el oxgeno
molecular disuelto, eliminndolo. Por ejemplo, frecuentemente se
aade tioglicolato de sodio, cistena u otros compuestos que
contienen grupos sulfhidrilos. En los medios lquidos se suele
burbujear nitrgeno, hidrgeno o bixido de carbono para desplazar al
oxgeno y posteriormente se sella el recipiente para evitar que
entre de nuevo el oxgeno. Adems, hay muchos modelos de cmaras de
cultivo para anaerobios que se emplean para eliminar el oxgeno de
la atmsfera. Estos modelos como el sistema GasPack, generan
hidrgeno el cual reacciona con el oxgeno mediante un catalizador
dentro de la campana produciendo agua; tambin se genera bixido de
carbono para reemplazar el volumen de gas agotado por la conversin
de oxgeno a agua. En todos estos mtodos es recomendable utilizar
indicadores de oxido-reduccin como el azul de metileno y la
resarzurina que permiten conocer las condiciones del sistema; en
condiciones oxidadas los indicadores estn coloreados y en
condiciones reducidas son incoloros. La cuantificacin del estado de
oxidacin de un medio se expresa por la relacin del potencial de
xido-reduccin (O/R). El potencial se puede medir utilizando
electrodos y un potencimetro, cuando los valores son positivos
significa que hay oxgeno disuelto en el medio y los compuestos
orgnicos estn parcialmente oxidados, cuando son negativos significa
que no hay oxgeno disuelto y los compuestos orgnicos estn
reducidos.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn los conocimientos y
habilidades para poner en prctica algunas tcnicas para el
aislamiento y cultivo de bacterias anaerobias.
MATERIAL
Tubos de 16 X 150 con 5 ml de agua destilada estrilTubos de 16 X
150 con tapn de rosca con caldo tioglicolato
Tubos de 16 X 150 con tapn de rosca con caldo nutritivo
Pipetas Pasteur estriles
Cajas de petri con gelosa sangre
Plastilina
Muestra de material fecal animal
Cepas de Clostridium sp, Bacillus subtilis y Escherichia
coliMTODOS
PRIMERA SESIN
1. Aislamiento de bacterias anaerobias de material fecal.
- Adicionar aproximadamente un gramo de muestra a un tubo con 5
ml de agua destilada estril, agitar y dejar sedimentar durante 10
minutos.
- Tomar una asada del sobrenadante y sembrar por estra cruzada
en una placa de gelosa sangre.
- Agitar de nuevo el tubo y calentar la muestra a ebullicin por
10 minutos y dejar sedimentar otros 10 minutos.
- Sembrar otra placa con gelosa sangre.
- Incubar laS cajas en anaerobiosis a 37 C durante 40 horas.
2. Cultivo de bacterias anaerobias en medios lquidos.
- Inocular con ayuda de una pipeta Pasteur estril cada una de
las cepas proporcionadas en los tubos con caldo tioglicolato y
caldo nutritivo.
- Incubar a 37 C durante 24 - 48 horas.
3. Cultivo de microorganismos anaerobios por comensalismo.
-Divide una caja de gelosa sangre en dos y en un lado siembra
una asada de Clostridium sp y del otro lado una asada de Bacillus
subtilis.
-Sella con plastilina los bordes de la caja
-Incuba a 37 C durante 24 - 48 horas.
SEGUNDA SESIN
1.Describe la morfologa colonial de dos colonias aisladas a
partir de la muestra de materia fecal y la morfologa microscpica
utilizando la tincin de Gram.
2.Observa el crecimiento de las cepas bacterianas sembradas en
los medios lquidos y discute los resultados.
3. Observa el crecimiento de la bacteria anaerobia y de la
aerobia y realice un frotis y tincin de Gram de cada uno. Haga
esquemas.
ASIGNACIN1. Investiga en libros, revistas y artculos confiables
al menos tres bacterias anaerobias de importancia en medicina
veterinaria.2. Investiga los patrones de crecimiento bacteriano en
diferentes medios de cultivo de las bacterias anaerobias
PRCTICA 9
USO DE MEDIOS SELECTIVOS
INTRODUCCIN
Los requerimientos nutricionales de las bacterias son muy
variados, lo cual hace necesario contar con una amplia gama de
medios de cultivo. La seleccin de stos depende de la cantidad y
variedad de microorganismos en la muestra a estudiar, del tipo de
microorganismo que se prefiere aislar y los que se quiere eliminar
para que su abundancia no los encubra o dificulte el
aislamiento.
Basados en la utilidad diagnstica de los medios de cultivo, es
posible hacer la siguiente clasificacin:
Medios simples.- Son medios que promueven el desarrollo de
microorganismos nutricionalmente poco exigentes. Estos medios
reciben tambin el nombre de medios bsicos o generales. Se utilizan
principalmente para muestreos de medio ambiente o superficies,
anlisis cuantitativos y conservacin de cepas.
Medios enriquecidos.- Son medios que han sido suplementados con
nutrientes que proporcionan factores de crecimiento para promover
el desarrollo de microorganismos de requerimientos nutricionales
exigentes. Estos medios contienen generalmente uno o ms de los
siguientes ingredientes: sangre, suero, plasma lquido asctico,
huevo carne vitaminas, aminocidos especficos, NAD o hemina, entre
otros.
Medios selectivos: Estos medios contienen sustancias inhibidoras
para suprimir parcial o totalmente el desarrollo de microorganismos
no deseados. Las sustancias utilizadas con mayor frecuencia son
colorantes, sales inorgnicas, sales biliares, antibiticos y
detergentes. Los medios selectivos tienen una gran utilidad para el
aislamiento de grmenes patgenos a partir de muestras clnicas que
contengan bacterias de la microflora normal.
Medios diferenciales.- Estos medios contienen indicadores que
permiten diferenciar algunos gneros o especies bacterianas por el
aspecto caracterstico de sus colonias. La mayora de los medios
selectivos son tambin diferenciales. Ejemplos: Agar verde
brillante, agar ENDO, agar eosina azul de metileno, agar
Salmonella-Shigella, agar McConkey. Estos permiten diferenciar
enterobacterias fermentadoras de lactosa (coliformes).
Medios de enriquecimiento.- Estos medios son lquidos y poseen
efecto inhibitoria sobre ciertos gneros bacterianos, favoreciendo
al mismo tiempo el desarrollo de otros que se encuentran en menor
proporcin en la muestra. Son medios muy utilizados en la
bacteriologa del tracto intestinal, principalmente para el
enriquecimiento de Salmonella sp. a partir de muestras de heces en
las cuales el nmero de salmonelas puede ser muy pequeo en
comparacin al elevado nmero de bacterias que normalmente habitan el
tracto intestinal. Estos medios se inoculan mediante un hisopo o
bien depositando la muestra en el medio a una proporcin de 1:10,
ejemplo, un gramo de muestra en 10 ml de medio, El perodo de
incubacin de estos medios debe ser de 12-18 horas y es necesario
resembrar a partir de ellos, en medios selectivos y diferenciales
para identificar colonias caractersticas. Ejemplos de stos medios
son el caldo selenito y el caldo tetrationato, medios de
enriquecimiento para Salmonella sp.
Medios de transporte.- Son medios utilizados para el transporte
de las muestras clnicas desde el lugar de su coleccin hasta el
laboratorio. Su finalidad es preservar la viabilidad de los
microorganismos cuyo aislamiento va a intentarse posteriormente. La
composicin de este tipo de medios vara considerablemente de acuerdo
al microorganismo cuya viabilidad se desea preservar. Estos medios
pueden ser desde una simple solucin fisiolgica amortiguada, hasta
medios ms complejos que contengan sustancias inhibidoras, agentes
reductores, sustancias osmticamente activas (sacarosa), suero, etc.
Algunos ejemplos de estos medios son: Medio de Stuart, medio de
Carry-Blair, utilizados como medios de transporte de uso general
para un gran nmero de bacterias aerobias y anaerobias. Medio
Campy-thio y medio Clark-Dufty, diseados para preservar la
viabilidad de Campylobacter sp. y la solucin amortiguadora de
Bovarnyk, para preservar la viabilidad de Chlamidias y
Riquettsias.
Medios especiales.- Son medios que no pueden ser fcilmente
agrupados en alguno de los grupos de medios descritos anteriormente
y la mayora son utilizados para comprobar una o ms caractersticas
bioqumicas de los microorganismos.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn las habilidades para poder
identificar diferentes tipos de medios de cultivo y su utilidad en
el aislamiento e identificacin de bacterias.MATERIAL
Caja petri con agar Mac Conkey
Caja petri con agar eosina azul de metileno
Caja petri con agar Staphylococcus
Caja de petri con agar Sal y manitol
Tubo de 13X100 con caldo glucosado
Tubo de 13 X 100 con medio Stuart
Tubo de 16 X150 con Caldo bilis verde brillante al 2%
Cepas de Escherichia coli, Salmonella cholerae suis, Proteus sp
y Staphylococcus aureus, Bacillus sp.
MTODOS
1. Medios de cultivo selectivos
1) Sembrar por estra cruzada la mezcla de bacterias (Gram + y -)
proporcionada por el profesor en el Agar Sal y manitol y el Agar
Verde brillante.
2) Sembrar por estra cruzada los cultivos puros antes
mencionados en los medios de cultivo restantes, conforme lo indica
las tablas 1 y 2 anexas.3) Identificar las cajas de petri y los
tubos con el nombre del cultivo.
4) Formar un paquete con las cajas y los tubos sembrados para
incubar a 37C durante 24-48 horas.
5) Observar el cambio de color que se da en los medios de
cultivo, la morfologa colonial de los cultivos.
6) Interpretar los resultados, de acuerdo al tipo de medio de
cultivo y el microorganismo sembrado, registra conforme se te pide
en los cuadros 3 y 4.INFORME1) Describa la morfologa colonial de
las cepas proporcionadas y sembradas en los diferentes medios de
cultivo.
2) Indica los cambios de color que se aprecian en los medios de
cultivo y a que se atribuyen.
3) Interprete y discuta los resultados.
4) Complete las tablas anexas con sus observaciones.ASIGNACIN:
1) Investiga la composicin qumica de los medios de cultivo lquidos
y slidos que sembraste.2) Investiga y explica a que se atribuyen
los cambios que observaste en los medios de cultivo conforme a la
cepa bacteriana que sembraste en cada uno de ellos.
Cuado 3. Caractersticas y composicin qumica del medio de
cultivo.Medio de cultivoColor del medio de cultivoIndicador que
contiene el medioTipo de medio de cultivoCepa bacterianaForma de
siembra en el medio de cultivo
Caldo glucosadoE.coli Salmonella
Caldo bilis verde brillanteE.coli
Medio StuartS.aureus
Mac ConkeySalmonella
Verde brillanteMezcla de bacterias
Eosina Azul de metilenoProteus
A.Estafilococcus 110.S.aureus
Sal y manitolMezcla de bacterias
Agar nutritivo Bacillus
Cuadro 4. Cambios del medio de cultivo y morfologa
bacterianaMedio de cultivoCepa bacterianaMorfologa colonialForma y
agrupacin bacteriana y tincin de GramModificacin en el medio a las
24 hrs de cultivo
Caldo glucosadoE.coli Salmonella
Caldo bilis verde brillanteE.coli
Medio StuartS.aureus
Mac ConkeySalmonella
Verde brillanteMezcla de bacterias
Eosina Azul de metilenoProteus
A.Estafilococcus 110.S.aureus
Sal y manitolMezcla de bacterias
Agar nutritivoBacillus
PRACTICA 10
USO DE PRUEBAS BIOQUIMICAS
INTRODUCCIN
La identificacin de una bacteria a partir de una muestra clnica
exige su aislamiento en cultivo puro, de ah que es muy importante
la tcnica d siembra y el uso de diferentes medios de cultivo. Sin
embargo el crecimiento de las bacterias implica necesidades de
ciertos nutrientes para llevar a cabo su metabolismo, el cual puede
variar segn el tipo de bacteria de que se trate, de ah el uso de
una gran variedad de pruebas bioqumicas que miden la presencia o
ausencia d enzimas que participan en el catabolismo del sustrato
que se aade al medio diferencial.
Muchas de estas pruebas se leen mediante los cambios de color
que se producen en los medios de cultivo por la presencia de
indicadores de pH. As se usan medios diferenciales como por
ejemplo: el caldo rojo de fenol, al cual se le adicionan
carbohidratos (glucosa, trehalosa, maltosa, fructosa) para valorar
la fermentacin de azucares mediante la observacin de burbujas de
gas de hidrogeno o dixido de carbono atrapadas en un vial invertido
y la acidificacin del medio original se har evidente por el viraje
de color rojo original a amarillo.
Existe una gran variedad de pruebas bioqumicas que auxilian al
mdico clnico o al microbilogo en la identificacin del gnero y la
especie del agente patgeno presente en una muestra clnica, esto es
de gran importancia, pues con la correcta interpretacin de estos
hallazgos podr confirmarse el diagnstico del agente causal de la
enfermedad y con ello podrn adoptarse las medidas teraputicas y
preventivas idneas segn el caso.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn los conocimientos y
habilidades para identificar, inocular e interpretar las diferentes
pruebas bioqumicas utilizadas para la identificacin bacteriana.
MATERIALTubos de 13x100 con medio SIM
Tubos de 13x100 con citrato de Simmons
Tubos de 13x100 con caldo glucosado
Tubos de 13x100 con medio TSI
Tubos de 13x100 con agar urea
Portaobjetos
Solucin de rojo de metilo
Solucin de alfa-naftol
Solucin de KOH o KOH al 40 %Solucin de KOH al 3%
Reactivo de Kovac`s
Cepas bacterianas de: E. coli, Salmonella sp, Klebsiella sp,
Proteus sp, Streptococcus sp y Staphylococcus aureus
METODOS
1. Prueba para confirmacin de la tincin de Gram o de KOH al
3%
Esta prueba consiste en colocar sobre un portaobjetos una gota
de KOH al 3% y con el asa hacer una suspensin de la colonia de
bacterias a probar
Mezclar con movimientos giratorios de 1 a 3 minutos
Separar el asa de la mezcla, si se forma una hebra o hilo
viscoso, indica que se trata de bacterias Gram negativas, si esto
no sucede, se tratar de bacterias Gram positivas
Realiza esta prueba con diferentes cultivos Gram + y
Diagrama 1. Pruebas Bioqumicas Gram. (+)
Diagrama 2. Pruebas Bioqumicas Gram (-)
2. Pruebas bioqumicas para bacterias Gram negativas
2.1. Medio TSI
Sembrar por picadura y estra en la superficie de los tubos de
TSI cada una de las cepas proporcionadas
Incubar los tubos a 37C durante 24 horas
Observar e interpretar los resultados como sigue:
a) Fermentacin de glucosa: color amarillo en el fondo del tubob)
Fermentacin de lactosa: color amarillo en la superficie del medioc)
Produccin de gas: burbujas en el fondo del tubod) Produccin de cido
sulfhdrico: precipitado de color negro en el fondo del tubo 2.2.
Prueba de rojo de metilo y Vogues-Proskauer
Sembrar en dos tubos de caldo glucosado o medio RM-VP las cepas
proporcionadas
Incubar a 37C durante 24-48 hrs
Observar e interpretar los resultados como sigue:
a) Prueba de rojo de metilo: Aada al tubo 5 gotas del reactivo
rojo de metilo y sin agitar observe la presencia de un anillo de
color rojo en la superficie del medio; la prueba ser negativa
cuando no exista el color rojob) Prueba de Vogues-Proskauer: Aada
al tubo 6 gotas de alfa-naftol y dos gotas de KOH creatina, agitar
suavemente y dejar reposar el tubo de 10 a 15 min. La prueba
positiva ser la aparicin de color rojo en la superficie del tubo y
en la negativa no hay coloracin roja2.3. Utilizacin de citrato
Sembrar un tubo de citrato de Simmons por estra en la
superficie, para cada cepa proporcionada
Incubar los tubos a 37C durante 24-48 hrs.
Observar e interpretar el resultado como sigue: El crecimiento y
vire del indicador de verde a azul, significan que el
microorganismo dio la prueba a la utilizacin del citrato.
2.4. Medio SIM
Sembrar por picadura utilizando el asa recta, un tubo con medio
SIM para cada cepa proporcionada
Incubar los tubos a 37C durante 24-48 hrs
Observe e interprete los resultados como sigue:
a) Produccin de cido sulfhdrico: precipitado de color negro
b) Movilidad: positivo si hay turbiedad, e inmvil si solo hay
crecimiento en la picadura
c) Produccin de indol: Aada 5 gotas de reactivo de Kovacs, la
coloracin roja indica que la prueba es positiva.
2.5. Produccin de ureasa
Siembre el agar inclinado una asada de cultivo abundante sobre
la superficie
Incube a 37C de 1 a 7 das
La reaccin positiva se observa al virar el medio a un color rosa
intenso
Si no hay cambios en el medio de cultivo, es negativo
3. Pruebas bioqumicas para bacterias Gram positivas3.1 prueba de
catalasa: Esta prueba es muy til para la diferenciacin de los
estreptococos de los estafilococos y micrococos
- Sobre un portaobjetos colocar una gota de perxido de hidrgeno
al 3%, y con el asa tomar una de las colonias
- Mezclar la colonia con la gota con movimientos giratorios
- La lectura se hace inmediatamente, si aparece un burbujeo la
prueba es positivaNOTA: Pueden presentarse falsos positivos si la
colonia se toma de un medio adicionado con sangre
3.2 Prueba de coagulasa
- Tomar con el asa aproximadamente 5 colonias del medio de Baird
Parker e introducirlas en el vial que contiene el plasma hidratado
e incubar a 37C de 1 a 3 hrs
- Evitar agitar el tubo para observar la formacin del coagulo,
se considera la prueba positiva si el contenido del tubo en ms de
tres cuartas partes presenta la formacin de un coagulo
compactoSegunda sesin: Interpreta segn la prueba realizada,
revelando las reacciones bioqumicas, a travs de los cambios en
medio utilizados. INFORME
Haga una tabla donde coloque los resultados de las pruebas
bioqumicas de las cepas utilizadas en la prctica.Defina conforme
las reacciones bioqumicas observadas y su morfologa al menos el
genero de los microorganismos analizados.ASIGNACIN
Investiga las reacciones bioqumicas en fuentes confiables
(Libros, Revistas, Pg. Web y Artculos) de las cepas bacterianas que
utilizaste en la prctica.
PRCTICA 11
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS
INTRODUCCIN
La observacin del afecto inhibidor de algunos microorganismos
sobre otros data desde 1874. Pasteur y otros investigadores
observaron que infectando a un animal con Pseudomonas aeruginosa,
lo protega contra Bacillus anthrasis.
Posteriormente se us el trmino antibiosis para explicar el
efecto de inhibicin sobre otros microorganismos y el trmino de
antibitico para la sustancia que causa tal efecto. Este fenmeno
puede apreciarse al realizar pruebas de sensibilidad a
antimicrobianos. Las pruebas de uso ms comn y comercial son las de
difusin en agar, en las que se aplica una fuente de antibitico a
una superficie de medio slido: el agente difunde a travs del medio
inhibiendo el crecimiento del microorganismo sensible. Sin embargo,
en la actualidad se conocen varios factores que pueden influir en
el tamao de la zona de inhibicin.
Ejemplo: 1) Los componentes del medio de cultivo: Ingredientes
como la peptona, triptona y extracto de levadura, pueden variar en
su contenido mineral, y minerales como el calcio, magnesio y el
hierro, disminuyen la actividad de los aminoglucsidos y aumentan el
efecto del cido fusdico. Otro ejemplo es el efecto de los
carbohidratos sobre la ampicilina y la furantona.
2) Efecto del pH: La actividad de los aminoglucsidos se ve
aumentada en medio alcalino; as como la presencia de dixido de
carbono en la estufa y carbohidratos fermentables en los medios de
cultivo, pueden inducir condiciones cidas.
3) Tamao del inculo: Se ha observado que las siembras densas
disminuyen en algn grado las zonas de inhibicin, por lo que los
cultivos en caldo y las suspensiones en medio slido se pueden
diluir para obtener el inculo idneo.
Las pruebas de susceptibilidad bacteriana por el mtodo de
difusin en agar, son pruebas cualitativas en las que se utilizan
discos de papel filtro impregnado con concentraciones conocidas de
los diferentes agentes quimioteraputicos (sensidiscos). Estos
discos se colocan sobre la superficie del agar previamente sembrado
con la cepa problema. Despus de la incubacin, se observan zonas o
halos de inhibicin del desarrollo bacteriano alrededor de los
discos con los quimioteraputicos, a los cuales el microorganismo es
susceptible. Por el contrario, si la cepa bacteriana es resistente,
se presenta crecimiento alrededor del disco.
El uso indiscriminado de los antimicrobianos ha originado la
seleccin de cepas bacterianas multiresistentes, por lo que resulta
difcil predecir la susceptibilidad con base a la experiencia
clnica. Muchas cepas de microorganismos tradicionalmente sensibles
a ciertos antibiticos son ahora resistentes, debido principalmente
a la amplia distribucin de plsmidos de resistencia mltiple.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirn los conocimientos y
habilidades para realizar e interpretar las pruebas de sensibilidad
a antimicrobianos por difusin en agar
MATERIAL
Colorantes para tincin de Gram.
2 portaobjetos.
Cajas petri con agar Mueller-Hinton
Hisopos estriles
Discos de papel filtro impregnados con quimioteraputicos
Frascos de alcohol
Pinzas y gradillaMechero Bunsen
2 tubos con Solucin salina fisiolgica
Tubo 0.5 de la serie de Mac Farland.
Cepas crecidas de Escherichia coli y Staphylococcus
aureusMTODOS- Realice una tincin de Gram de una colonia
caracterstica de E.coli y S. aureus.PREPARACIN DE INOCULO:- Tome
varias colonias (2-3) caractersticas de E .coli y suspndalas en una
tubo con sol. Salina fisiolgica homogenizando con movimientos
suaves para evitar derrames.- Compare la turbidez de esta suspensin
con la turbidez del tubo 0.5 de Mac. Farland.- Ajuste la turbidez
si es necesario adicionando una colonia ms. - Repita este mismo
procedimiento con la cepa de S.aureus. INOCULACIN DE LAS PLACA DE
MUELLER HINTON:- Humedezca un hisopo en la suspensin de la cepa de
E. coli y exprima el exceso en las paredes del tubo.
- Inocule una placa de agar Mueller-Hinton sembrando en toda la
superficie del agar con el hisopo y permita que la placa seque de 3
a 5 minutos.
- Coloque los sensidiscos sobre la superficie del agar ayudndose
con la pinza previamente flameada en alcohol y presinalos
ligeramente para poner en contacto el antibitico con la cepa.
- Repita el procedimiento anterior, con la cepa de
Staphylococcus aureus.- Incube las placas a 37C durante 24 horas-
Mida (en mm) el dimetro de inhibicin del crecimiento producido por
cada antibitico y anote los resultados.- Interprete segn la tabla
1. Interpretacin de antibiograma segn los halos de inhibicin.Tabla
1. INTERPRETACIN DE ANTIBIOGRAMATABLA DE INTERPRETACIN DE
ANTIBIOGRAMA
R=resistente; I=intermedio; S=sensible
Abreviatura Agente antimicrobiano Contenido del discoDimetro de
halo de inhibicin en mm
R I S
AKAmikacinaEnterobacteriaceae 30 g 17
AMAmpicilina10g
Enterobacteriaceae 30 g 17
Staphyloccocus spp 29
Enterococous spp 17
Streptococcus spp - - >24
CBCarbencilina100g
Enterobacteriaceae < 19 20-22 >23
Pseudomonas aeruginosa 17
CFCefalotinaEnterobacteriaceae 30 g 18
FEPCefepimeEnterobacteriaceae 30 g 18
CTXCefotaximaEnterobacteriaceae 30 g 23
CAZCeftazidimaEnterobacteriaceae 30 g 18
CROCeftriaxonaEnterobacteriaceae 30 g 21
CXMCefuroximaEnterobacteriaceae 30 g 23
CLCloranfenicolEnterobacteriaceae 30 g 18
DCDicloxacilina 1 g
Staphyloccocus spp 13
ENXEnoxacinaEnterobacteriaceae 30 g 18
EEritromicina 15 g
Enterococcus spp 23
GEGentamicinaEnterobacteriaceae 10 g 15
LEVLevofloxacinaEnterobacteriaceae 5 g 17
NETNetilmicinaEnterobacteriaceae 30 g 15
NFNitrofurantoinaEnterobacteriaceae 300 g 17
PEFPefloxacina5 g 23
PEPenicilina10U
Staphyloccocus spp 29
Enterococcus spp 15
N. gonorrhoeae 47
Streptococcus spp - - >24
TETetraciclinaEnterobacteriaceae 30 g 19
SXTTrimetoprim-sultametoxazol 25 g 16
NORNafloxacina5 g 21
Ceptioflur 21
ENREnrofluxacina 5 g 22
Florfenicol 21
CIPCiprofluxacin5 g 21
INFORME1.Anote el resultado de la actividad de los antibiticos
en placa sobre E. coli y S. aureus en la tabla siguiente.Tabla 2.
Actividad de los antibiticos sobre E. coli y S
aureus.ANTIBITICO
Nombre / abreviaturaE. coli
Medida en mm del haloSensibilidad
R=resistente; I=intermdio; S=sensibleS.aureus
Medida en mm del haloSensibilidad
R=resistente; I=intermdio; S=sensible
2.Mencione aquellos antibiticos con mejores resultados de
inhibicin para cada cepa bacteriana y si se trata del mismo
antibitico o no. Explique porqu. Fundamentado con investigacin
confiable (libros, artculos, revistas). ASIGNACIN: Investigar
acerca de las consecuencias del uso irracional de los
antimicrobianos en los animales en produccin y elabora un ensayo.
(Incluye las copias de la fuente de informacin).
PRCTICA 12
COLECCIN Y ENVIO DE MUESTRAS AL LABORATORIO
INTRODUCCIN
La bacteriologa y micologa clnicas se encargan del estudio de
las muestras de pacientes de los cuales se sospecha una enfermedad
infecciosa. El laboratorio de bacteriologa y micologa veterinaria
puede apoyar al mdico veterinario de la siguiente manera:
Confirma el diagnstico presuntivo
Sugiere la quimioterapia de la enfermedad
Colabora en el conocimiento epidemiolgico de las
enfermedades
Permite la elaboracin de productos biolgicos como las
bacterinas
Los resultados del examen bacteriolgico y micolgico, as como la
rapidez con que stos sean obtenidos, no dependen solo de los mtodos
de laboratorio empleados, sino tambin de la forma en que sean
colectadas y envidas las muestras clnicas. Dichos resultados pueden
verse influenciados por la presencia de microorganismos que son
parte de la flora microbiana normal, por la migracin bacteriana
post-mortem o por la aplicacin de antimicrobianos antes del envo de
la muestra. El mdico debe tener en mente estos factores para
realizar la interpretacin de los resultados obtenidos por el
laboratorio.
Los problemas que con mayor frecuencia se presentan en la
identificacin bacteriana y micolgica en el laboratorio son:
Envo de muestras no representativas de la enfermedad en
cuestin
Toma de muestras sin asepsia
Envo de muestras en condiciones inadecuadas
Falta de historia clnica completa y de un diagnstico
presuntivo
Por lo tanto, es indispensable tener conocimientos previos sobre
la correcta obtencin y envo de muestras al laboratorio. A
continuacin se enlistan algunas normas generales:
1. Tomar la muestra del sitio anatmico ms representativo del
problema, de preferencia en la etapa aguda de la enfermedad.
2. Las muestras obtenidas a partir de animales muertos debern
tomarse dentro de las tres primeras horas de ocurrida la muerte o
sacrificio.
3. Las muestras deben colectarse bajo estrictas condiciones de
asepsia. Tanto el material de coleccin como el recipiente en que la
muestra sea transportada debern ser estriles. Este ltimo
preferentemente debe tener un tapn de rosca.
4. Los especimenes colectados no deben entrar en contacto con
desinfectantes
5. Las muestras deben identificarse con los siguientes datos:
especie, raza, edad, sexo, arete o nombre del animal, as como la
direccin, telfono y nombre del propietario
6. Una vez colectadas las muestras deben enviarse al laboratorio
dentro de las siguientes 4-24 hrs, en hielo o congelantes, en cajas
de poliuretano
7. Cuando sea necesario el uso de hisopos para la coleccin de
muestras, estas deben enviarse en medio de transporte (Stuart,
Cary-Blair, etc)
8. Debe de anexarse la historia clnica completa que incluya: La
hora de coleccin de la muestra, hora de la muerte del animal (si es
el caso), nmero de animales infectados, signos y lesiones que
presenta el animal; adems si el animal del que proviene la muestra
fue tratado con antimicrobianos (cual) y el diagnstico
presuntivo.
9. Es muy importante hacer notar que el manejo de las muestras
debe realizarse con precaucin, ya que algunos agentes causantes de
las enfermedades infecciosas de los animales, constituyen un riesgo
para la salud humana.
COMPETENCIA: Los alumnos desarrollaran las habilidades
necesarias para seleccionar los procedimientos ms adecuados de la
toma y envo de muestras para su envo al laboratorio de diagnstico
bacteriolgico.
MATERIAL
Tubos con medio de transporte Stuart
Hisopos estriles
Jeringas desechables estriles
Bolsas de plstico estriles
Recipiente estril para muestra de orina
Guantes de ltex
METODOS
1. Asignar a cada equipo el tipo de muestra que deber traer, de
que forma la podr colectar y la forma de transportacin al
laboratorio. Es indispensable que provenga de un animal
enfermo.Para realizar prctica 13 anlisis bacteriolgico de procesos
biognicos Muestra 1: Pus, abscesos, exudado de heridas, hisopos
nasales, hisopos auditivos, exudados farngeos, segn lo asignado por
el maestro. Farngeo
Exudados nasal
Auditivo
Para realizar prctica 14 anlisis bacteriolgicos de heces y orina
Muestra 2: Orina o heces de cerdo, bovino o equino segn lo asignado
por el maestroPara realizar prctica 15 anlisis bacteriolgico de
rganos 12 Muestra 3: rganos afectados con lesiones visibles de la
especie animal asignada por el maestro.
Corazn Rin
Pulmn rganos Intestino Hgado
Bazo
Linfonodulos
Cerebro
Nota: Las muestras correspondern a la solicitada por el maestro
en el tiempo indicado para realizacin de cada una de las prcticas
13,14 y 15.
INFORME1. Anexe la historia clnica de la muestra en cuestin en
el reporte.
2. Describa detalladamente los pasos seguidos para la toma y
envo de la muestra que obtuvo para la prctica de anlisis
bacteriolgico de productos biolgicos.ASIGNACINEntregar una
secuencia fotogrfica numerada de los pasos de la toma de muestra,
con la descripcin del procedimiento en cada imagen. La asignacin se
entregar en un disco (por equipo).PRCTICA 13
ANLISIS BACTERIOLGICO DE PROCESOS PIOGNICOS
INTRODUCCIN
El estudio de la microflora normal o patgena de los animales o
humanos, requiere de conocimientos previos sobre toma y envo de
muestras al laboratorio, tipos de medios de transporte y de
aislamiento de microorganismos, as como de antecedentes propios de
los microorganismos que se deben estudiar. Para esta prctica se han
seleccionado algunos productos biolgicos a estudiar y se hace
referencia a los posibles microorganismos involucrados en procesos
infecciosos.
Procesos piognicos: Son aquellas infecciones asociadas a
microorganismos que estimulan la formacin de pus, que se forma po
la acumulacin de leucocitos y restos del microorganismo. Dentro de
los procesos infecciosos quedan incluidos los abscesos que son una
forma de inflamacin localizada y llena de pus, la mayora estn
rodeadas de tejido conectivo, capilares proliferantes y leucocitos.
Las manifestaciones clnicas asociadas a la presencia de abscesos
dependen de su localizacin y etiologa. Hay abscesos que no son
detectados, sino hasta el momento de la necropsia, por ejemplo:
abscesos hepticos, cervicales, etc. Mientras que otros producen un
malestar generalizado en el animal, como los abscesos en la cavidad
oral, pulmn, etc.
La etiologa de los procesos piognicos puede ser muy variada, sin
embargo, la ms comn es la bacteriana. Entre los microorganismos
piognicos ms comunes se encuentran:
Aerobios y facultativos
AnaerobiosStaphylococus aureus
Actinomyces spp.
Streptococcus spp.
|Fusobacterium necrophorum
Corynebacterium spp.
Clostridium perfringens
Pseudomonas aeruginosa
Peptococcus spp.
Escherichia coli
Peptostreptococcus spp.
Proteus spp.
Propionibacterium spp.
Pasteurella multocida
Bacteroides spp.
Eubacterium spp
COMPETENCIA: El alumno enviara correctamente una muestra de un
proceso piognico, para su estudio y seleccionar los materiales
necesarios para el aislamiento e identificacin de un posible agente
patgeno.MATERIAL
Hisopos estriles
Placas con agar sal manitol
Microscopio
Placas con agar sangre
Asa bacteriolgica
Pruebas bioqumicas para Gram (-)Mechero de bunsen
Agar TSI o Kliger
Puente de tincin
Agar urea de Christensen
Portaobjetos
Agar citrato de SimonsJeringa desechable
Medio SIM
Bolsas de plstico
Prueba de oxidasa
Encendedor de piedra
Reactivo de Kovacs
Regla
Hidrxido de potasio al 3 %
Tubos de solucin salina fisiolgica
Reactivo de rojo de metilo
Tubo 0.5 de serie de MacFarland
Agua destilada
Perxido de hidrgeno al 3%
Colorantes para t. De Gram
Pruebas bioqumicas para Gram (+)Sensidiscos para Gram + y
Prueba de oxidasa
Agar Mueller Hinton
Caldo urea o agar urea de Christensen
Pinzas y tijeras para flamear
Cloruro de sodio al 6.5%
Alcohol al 70%
Caldo sangrePapel Kraft
Metodologa para procesos piognicos:Primera sesin
Con un hisopo estril toma la muestra y depostala en el primer
cuadrante de cada una de las placas de agar sangre y agar sal y
manitol.
Con el asa bacteriolgica, completa la siembra aislando por estra
cruzada e incuba las placas a 37 C durante 24 - 48 horas.
Segunda sesin
Describe en cada placa, la morfologa colonial de aquellas que
sospeches sean causantes del proceso infeccioso.
NOTA: Considera a las colonias predominantes de un solo
tipo.
Realiza un frotis de cada colonia y telos por Gram.
Si son bacterias gram negativas, siembra las pruebas bioqumicas
e incbalas por 24 hrs a 37 C, si no hay cambios espera hasta 72
hrs.
Realiza un antibiograma.
Si son bacterias gram positivas realiza las pruebas bioqumicas e
incbalas por 24 hrs a 37 C, si no hay cambios espera hasta 72
hrs.
Realiza un antibiograma.
Tercera sesin
Interpreta junto con el profesor los resultados de las pruebas
bioqumicas y del antibiograma para identificar al microorganismo
aislado y su sensibilidad a los antimicrobianos.
ASIGNACIN
1. Investiga en fuentes de informacin confiables, las
caractersticas morfolgicas de las bacterias identificadas
2. Investiga la enfermedad que la bacteria identificada produce,
incluyendo la descripcin de la enfermedad, especies afectadas, modo
de transmisin y tratamiento.
3. Incluye al menos dos referencias bibliogrficas
consultadasINSTITUTO TECNOLOGICO DE SONORA
LABORATORIO DE BACTERIOLOGA Y PATOGENIA BACTERIANA
PRCTICA 14
ANLISIS BACTERIOLGICO DE HECES Y ORINA
INTRODUCCIN
Muestras de orina: Las infecciones urinarias se diagnostican
frecuentemente en los perros. Estas se presentan tambin en otras
especies, pero por lo general no se envan muestras al laboratorio
de estos animales. Algunos de los microorganismos que causan
infecciones en los perros, pueden producirlas tambin en otras
especies de animales domsticos. Ejemplos:
Perro
Bovinos
PorcinosProteus mirabilis
Corynebacterium renale
Eubacterium suis
Pseudomonas aeruginosa
C.renale
Staphylococcus aureus
Enterococcus
Escherichia coli
Enterobacter spp.
Streptococcus pyogenes
Streptococcus viridans
Corynebaterium renale
Las infecciones urinarias causadas por bacterias del gnero
Leptospira, son por lo general enfermedades primarias de los
animales, que en ocasiones pueden transmitirse al hombre. Algunas
especies o serotipos importantes son:
Leptospira icterohemorragiae
Rata, ratones
L. canicola Perros, bovinos, porcinos, zorrillos, chacales.
L. pomona
Bovinos, porcinos, zorrillos,
mapaches, gato montes.
L. grippotyphosa
Mapache, ratn, zorro, ardilla,,
conejoL. hardjo
Bovinos.
El hombre puede adquirir la enfermedad a partir de animales
infectados y aguas contaminadas. Los veterinarios y empleados del
rastro se encuentran sujetos a mayor riesgo de adquirir la
infeccin.
Para obtener muestras de orina se recomienda tomar en cuenta
varias condiciones de bioseguridad como son el uso de bata
abotonada, guantes, lentes y cubrebocas. Se puede realizar la
puncin de vejiga, la cateterizacin de la uretra o durante la
miccin. Para la obtencin de las muestras del tracto reproductor se
pueden usar hisopos estriles para el tero, cuello o vagina y de
semen en caso de machos, envindolas en un medio lquido, o en un
medio de transporte. Las muestras de orina y de semen deben
conservarse en refrigeracin.
Muestras de heces: Cuando existe una infeccin bacteriana del
intestino, una de las primeras manifestaciones clnicas es la
diarrea y ocasionalmente otros signos como deshidratacin, dolor
abdominal, septicemia, toxemia y fiebre dependiendo del agente
etiolgico, adems de la edad; la especie del animal y la resistencia
individual. De acuerdo con la presentacin en el animal, la
enteritis puede ser aguda o crnica. En la enteritis aguda la
diarrea se presenta sbitamente, las heces son blandas y liquidas
con olor desagradable y en algunos casos con moco o sangre
abundante. La coloracin es variable dependiendo del agente
etiolgico. A este tipo de diarreas se asocian las siguientes
bacterias:
Escherichia coli
Salmonella spp.
Serratia spp.
Serpulina hyodisenteriae
Clostridium spp.
Candida spp.
Actinobacillus spp.
Campylobacter spp.
En la enteritis crnica la diarrea se caracteriza por ser de
consistencia blanda, con o sin presencia de moco y por lo general
su olor es normal. La prdida progresiva de peso y la emaciacin son
frecuentes y generalmente no hay anormalidades sistmicas. A estas
diarreas se asocian las siguientes bacterias:
Mycobacterium paratuberculosis
Proteus spp.
Pseudomonas
Candida spp.
Salmonella spp.
El diagnstico de los problemas entricos incluye el anlisis por
parte del mdico veterinario de los cambios patolgicos funcionales
en los animales, as como problemas de higiene en el manejo de
excretas, agua y alimentos como posibles fuentes de contaminacin, y
del anlisis bacteriolgico para determinar el agente infeccioso
involucrado, con el fin de establecer un control epidemiolgico y
evitar prdidas econmicas.
COMPETENCIA: El alumno una vez colectada la muestra, la
transportara al laboratorio, para llevar a cabo el aislamiento e
identificacin de un posible agente patgeno y determinar su
sensibilidad a antimicrobianos.
Es indispensable que las muestras provengan de un animal
enfermo, la muestra de orina debe ser turbia o sanguinolenta y las
heces deben ser diarreicas.
MATERIAL
Hisopos estriles
placas con agar verde brillante
Microscopio
Placas con agar MacConkey
Asa bacteriolgica
Placas con agar sangre
Mechero de bunsen
Placas con agar Mueller-Hinton
Tubos con caldo lactosado
Puente de tincin
Tubos con caldo selenito
Portaobjetos
Pruebas bioqumicas para Gram (-)Encendedor de piedra
Agar TSI o Kliger
Agar urea de Christensen
Agua destilada
Agar citrato de Simons
Prueba de oxidasa
Medio SIM
Perxido de hidrgeno al 3%
Reactivo de Kovacs
Hidrxido de potasio al 3%
Reactivo de rojo de metilo
Colorantes para Tincin de Gram
Pruebas bioqumicas para Gram (+)Sensidiscos para Gram + y
Caldo sangre
Frascos de vidrio
Caldo urea o agar urea de Christensen
Pinzas para flamear
Cloruro de sodio al 6.5%
Alcohol al 70%
Carbohidratos, etc.
Muestras de orina
* Primera sesin
- Usando una pipeta Pasteur estril, inocula aproximadamente 1 ml
de orina en un tubo con caldo lactosado e incuba a 37 C durante 18
- 24 horas. Del crecimiento obtenido, siembra una placa con agar
verde brillante.
- Siembra con el asa 2 o 3 gotas de orina en una placa de agar
sangre y asla por estra cruzada. Incuba la placa a 37 C por 24 - 48
horas.
* Segunda sesin
- Describe la morfologa colonial de al menos una colonia de las
aisladas en las placas de agar sangre y verde brillante, haga los
frotis respectivos y telos por la tcnica de Gram para describir la
morfologa microscpica.
- Los aislamientos que resultaron simbrelos en los tubos para
las pruebas bioqumicas correspondientes. * Tercera sesin
- Lee los resultados de las pruebas bioqumicas y junto con apoyo
del maestro identifica a nivel de gnero tus aislamientos.
- De las bacterias identificadas, selecciona una e inocula una
placa de agar para realizar un antibiograma. Interpreta tus
resultados a las 24 hrs.
3. Muestras de heces
* Primera sesin
- Siembra una asada de la muestra en la placa de agar Mac Conkey
y asla por estra cruzada. Incuba la placa a 37 C durante 24 - 48
horas.
- Inocula aproximadamente 0.5 g de la muestra en el tubo con
caldo selenito. - Incuba a 37C durante 18-24 horas y subcultiva en
el medio de verde brillante sembrando por estra cruzada e incuba a
37 C durante 24 horas.
* Segunda sesin
- Describe el crecimiento microbiano en ambos medios de cultivo,
selecciona una colonia de cada placa y anota las caractersticas de
la morfologa microscpica de las colonias sembradas. Realiza un
frotis y tilo con Gram, siembra las pruebas bioqumicas
correspondientes.
* Tercera sesin
- Lee los resultados de las pruebas bioqumicas y con apoyo del
maestro, identifica a nivel gnero tus aislamientos.
- De las bacterias identificadas, selecciona una y siembra una
placa de agar para realizar el antibiograma.
- Interpreta tus resultados a las 24 hrs.
ASIGNACIN
1. Investiga las caractersticas morfolgicas de las bacterias
identificadas
2. Investiga la enfermedad que la bacteria identificada produce,
incluye la descripcin de la enfermedad, especies animales
afectadas, modo de transmisin y tratamiento. Consulta al menos 2
autores.PRCTICA 15
ANLISIS BACTERIOLGICO DE ORGANOS
INTRODUCCIN
El anlisis bacteriolgico de rganos est recomendado cuando se
sospecha de muertes por septicemia o por el hallazgo de lesiones
macroscpicas en uno o varios rganos especficamente relacionados con
alguna enfermedad. Ejemplo: en las neumonas (pulmn), enteritis
(intestino), abortos (rganos fetales), encefalitis (cerebro), etc.
La eleccin de las muestras depender de la experiencia del clnico,
del diagnstico presuntivo y de los hallazgos a la necropsia.
El anlisis bacteriolgico y micolgico constituye en estos casos
un apoyo en el diagnstico definitivo. Los siguientes son algunos
ejemplos de microorganismos tpicamente asociados a septicemias:
Brucella spp
Erysipelothix spp.
Leptospira spp.
Haemophilus spp.
Pasteurella spp.
Bacillus anthracis
Clostridium spp.
Pseudomonas spp.
Listeria monocytogenes
Campylobacter spp.Salmonella spp.
Escherichia coli
Criptococcus spp.
Leccidioides spp.
Histoplasma spp
Blastomyces spp.COMPETENCIA:El alumno enviar una muestra de
rganos afectados correctamente al laboratorio, y llevar a cabo la
identificacin del agente bacter