BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam bidang ilmu kimia karena kebanyakan materi yang terdapat dialam dapat berupa campuran. Untuk memperoleh materi murni dari suatu campuran , kita harus melakukan suatu pemisahan. Berbagai teknik pemisahan dapat diterapkan untuk memisahkan campuran . Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat di negara-negara berkermbang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak di bidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekuler. Bidang ilmu pengetahuan Biologi Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah rnetode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik). Ringkasnya metode elektroforesis ini mulai berkembang akhir abad ke 19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik 1
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam bidang ilmu kimia karena
kebanyakan materi yang terdapat dialam dapat berupa campuran. Untuk memperoleh materi
murni dari suatu campuran , kita harus melakukan suatu pemisahan. Berbagai teknik
pemisahan dapat diterapkan untuk memisahkan campuran .
Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat di negara-negara berkermbang
akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak di bidang
teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekuler.
Bidang ilmu pengetahuan Biologi Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah
rnetode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan
penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik). Ringkasnya
metode elektroforesis ini mulai berkembang akhir abad ke 19 setelah ditemukan penelitian
yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul
yang bermuatan listrik, dalam ha1 ini termasuk juga protein (Pornet, Quincke, Hardy. dalam
Richardson dkk, 1986). menurut passteur dkk. (1988) elektroforesis berasal dari bahasa
Junani yangmempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik.
Pemisahan elektroforesis pertama diterbitkan pada tahun 1930 oleh ilmuwan Swedia
Arne Tiselius. ia memisahkan protein serum sesuai dengan chanrge mereka dalam tabung
berbentuk u diisi dengan buffer. untuk ini dan lainnya accomplishments.Tiselius dianugerahi
hadiah nobel pada tahun 1948. Hari elektroforesis terbentuk baik pada gel slab atau slab gel
elektroforesis dikembangkan pada tahun 1950 dan sejak itu menjadi teknik standar yang
1
digunakan di laboratorium biokimia. elektroforesis Capilary dikembangkan lebih baru pada
1980-an. CE dapat dengan mudah otomatis dan sekarang merupakan metode yang
berkembang sangat cepat dalam dunia akademis dan industri . banyak modus yang berbeda
elektroforesis telah dikembangkan untuk dilakukan baik dalam gel dan capilaries. fokus di
sini adalah set pada teknik yang sering digunakan untuk analisis DNA dan protein.
B. Tujuan
a. Mengetahui prinsip dan teori elektroforesis
b. Mengetahui Jenis-Jenis Elektroforesis
c. Mengetahui Instrumen dari Elektroforesis
d.. Mengetahui kegunaan/ aplikasi elekroforesis
2
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Prinsip dan Teori Elektroforesis
Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas analit
menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat diterapkan untuk
pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk protein, asam nukleat, asam
amino dan karbohidrat. pemisahan dapat dilakukan pada analisis serta skala preparatif.
keuntungan utama atas metode khromatografi cair adalah efisiensi yang lebih tinggi dari
pemisahan elektroforesis. hal ini terutama berlaku bagi molekul besar.(Andreas Manz, et.al,
2010)
Elektroforesis adalah pergerakan partikel bermuatan listrik atau molekul dalam
medium konduktif di bawah pengaruh medan listrik diterapkan. media konduktif biasanya
buffer berair, juga disebut sebagai elektrolit atau run penyangga. campuran analit
dimasukkan ke dalam medium yang mengandung jangka penyangga dan medan listrik
diterapkan. Dalam contoh yang ditunjukkan pada gambar 2.1 campuran analit mengandung
molekul bermuatan negatif. berdasarkan atas permohonan dari medan listrik, anion mulai
bergerak menuju elektroda positif (anoda). perbedaan muatan dan ukuran menyebabkan
mobilitas yang berbeda dan dengan demikian pemisahan komponen sampel yang berbeda.
sama, ion bermuatan positif bergerak menuju katoda dalam medan listrik diterapkan.
pori-pori besar hanya terbatas untuk protein berat molekul yang sangat tinggi atau asam
nukleat. untuk sebagian analit, agarosa gel nonrestrictive.
Gel Poliakrilamida disiapkan oleh co-polimerisasi akrilamida dan agen cross-
linking, NN metilen - bisacrylamide dalam buffer elektroforesis dipilih. ukuran pori dan sifat
pengayakan maka molekul PA gel tergantung pada konsentrasi total serta tingkat silang C%
Pergerakan DNA pada elektroforesis dipengaruhi oleh beberapa faktor sebagaberikut:
1. Ukuran molekul DNA.
Molekul DNA kecil akan melintasi gel lebih cepat karena ruang gerak yang tersedia
untuk melintasi gel lebih banyak.
2. Konsentrasi gel.
Konsentrasi agarosa yang semakin tinggi menyebabkan molekul-molekul DNA sukar
melewati gel. Konsentrasi gel tinggi mempermudah DNA berukuran kecil melewati
gel, sedangkan konsentrasi gel rendah mempermudah molekul DNA berukuran besar
untuk melintasi gel.
3. Bentuk Molekul
Molekul yang berbentuk supercoil atau elips akan bergerak lebih cepat melewati gel.
4. Densitas muatan
22
Molekul dengan densitas tinggi akan lebih cepat bergerak dibandingkan molekul
dengan densitas yang rendah. Densitas merupakan jumlah muatan per unit volume
molekul.
5. Pori-pori gel.
Pori-pori yang lebih besar akan mempermudah pergerakan DNA melewati gel,
sedangkan pori-pori yang lebih kecil akan lebih sulit dilalui oleh molekul DNA.
6. Voltase.
Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul DNA. Hal tersebut
dikarenakan oleh tingginya muatan positif yang ditimbulkan.
7. Larutan buffer.
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga migrasi
DNA akan lebih cepat.
5. Elektroforesis Kapiler (CE)
Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk
memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi tinggi
yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer.Elektroforesis kapiler merupakan
pengembangan konsep elektroforesis konvensional. Konsep dasar elektroforesis kapiler
adalah tidak sedikit molekul berada dalam larutan sebagai partikel bermuatan (ion), baik
bermuatan positif (kation) maupun bermuatan negatif (anion). Kalau medan listrik diberikan
kepada larutan molekul bermuatan tersebut maka masing-masing ion bergerak menuju
elektroda yang berlawanan muatannya. Kation menuju katoda sebaliknya anion menuju
anoda. Sifat kelistrikan inilah yang sebenarnya merupakan konsep dasar elektroforesis
(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
23
Elektroforesis konvensional diperlukan media tempat pemisahan, misalnya kertas
atau gel yang masing-masing ujung tercelup dalam larutan buffer. Cuplikan berupa
campuran (misalnya campuran protein) diteteskan pada bagian tengah media tersebut. Salah
satu larutan buffer dihubungkan melalui elektroda platina atau batang karbon dengan kutub
negatif arus searah dan larutan buffer lainnya dihubungkan melalui elektroda platina atau
batang karbon dengan kutub positif arus searah. Oleh karena itu komponen-komponen
campuran bermuatan listrik maka komponen-komponen campuran tersebut bermigrasi
ketika arus listrik searah dialirkan. Komponen-komponen yang bermuatan positif bergerak
menuju katoda (kutub negatif). Sebaliknya komponen-komponen yang bermuatan negatif
bergerak menuju anoda (kutub positif). Sedangkan komponen-komponen yang netral tidak
bergerak. Hasil pemisahan elektroforesis konvensional ditunjukan oleh adanya noda-noda
berwarna sepanjang media pemisah(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Elektroforesis konvensional mudah dilakukan menggunakan peralatan sederhana.
Akan tetapi hasil pemisahan seringkali tidak memuaskan, noda yang satu dengan yang lain
kadang-kadang sukar dibedakan karena tumpang tindih sebagai akibat dari noda-noda
tersebut yang terlalu melebar. Kendala lain dari elektroforesis konvensional ini adalah tidak
dapat mendeteksi konsentrasi cuplikan yang rendah. Selain itu waktu yang diperlukan untuk
melakukan satu analisis terlalu lama. Untuk mempercepat pemisahan bisa diusahakan
dengan cara menambah tegangan listrik arus searah tapi hasilnya tetap kurang efisien. Hal ini
disebabkan tegangan listrik yang tinggi dapat menimbulkan panas sehingga menurunkan
efisiensi pemisahan(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Elektroforesis konvensional nampaknya tidak dapat diharapkan lebih banyak lagi
untuk pemisahan campuran yang lebih banyak lagi untuk pemisahan campuran yang lebih
komplek dengan hasil yang lebih efesien dan cuplikan yang sangat sedikit dengan
24
konsentrasi sangat rendah. Untuk menanggulangi kendala-kendala yang terdapat pada
elektroforesis konvensional ini maka telah diadakan modifikasi peralatan dan muncullah
istilah elektroforesis kapiler(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Aliran Elektroforentik.
Sifat alamiah ion-ion selalu bergerak menuju kutub listrik yang berlawanan, kation akan
bergerak menuju katoda (kutub listrik negatif), sebaliknya anion akan bergerak menuju
anoda (kutub listrik positif). Akan tetapi, molekul netral tidak akan bergerak. Aliran ion-ion
menuju kutub listrik yang berlawanan ini disebut aliran elektroforetik yang diperlihatkan
dalam gambar 2. Aliran elektroforetik inilah yang merupakan dasar pemisahan dalam
elektroforesa klasik (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Gambar 2.4. pengaruh medan listrik terhadap ion-ion (aliran elektroforetik) (sumber:
L. Thompson, et.al (1997))
Aliran elektroosmotik.
Dalam elektroforesik kapiler, pipa kapiler yang terbuat dari gelas menggantikan media kertas
atau lempeng silika gel pada elektroforesis klasik. Di sini, latutan buffer dipakai sebagai
pengisis pipa kapiler. Bila permukaan pipa kapiler tersebut berkontak dengan larutan dalam
air maka permukaan gelas akan dilapisi anion (SiO-) yang berasal dari reaksi hidrolisis silika
dengan air sehingga permukaan pipa kapiler tersebut bermuatan negatif. Akibatnya kation-
kation yang berasal dari buffer menutupi lapisan negatif pipa kapiler dan merupakan lapisan
25
kedua pada permukaan pipa kapiler. Kalau arus listrik searah bertegangan tinggi dialirkan
diantara ujung-ujung pipa kapiler maka kation-kation yang melapisi permukaan pipa kapiler
tersebut akan bergerak menuju katoda (kutub negatif). Aliran lapisan kation yang cepat ke
katoda ini dikenal dengan aliran elektrostatik. Aliran elektroosmotik diilustrasikan dalam
gambar 3(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Gambar 2.5. Pengaruh medan listrik terhadap ion-ion (aliran elektroosmotik)
(sumber: L. Thompson, et.al (1997))
Karena cepatnya aliran elektroosmotik maka aliran elektroosmotik akan lebih
dominan dibandingkan dengan aliran elektroforetik. Dengan demikian secara keseluruhan
aliran menuju ke satu arah yaitu ke katoda. Jadi dalam kenyataannya semua molekul baik
yang bermuatan maupun netral akan terbawa ke katoda. Tentunnya ion positif (kation)
bergerak menuju katoda paling cepat karena aliran elektroforetiknya searah dengan aliran
elektroosmotik. Molekul netral menepati urutan tercepat kedua dan ion negatif (anion) paling
lambat karena aliran elektroforentiknya berlawanan dengan aliran elektroosmotik(Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006).
Gerakan ion-ion atau molekul menuju katoda dalam eksperimen elektroforesis
kapiler diperhatikan dalam gambar 3. Untuk lebih memahami konsep gerakan ion-ion atau
molekul netral ke katoda dapat digunakan suatu analogi. Aliran elektroosrnotik dapat
dianalogikan sebagai aliran sungai yang deras. Ion positif (kation) dapat dianalogikan
26
sebagai ikan yang sedang berenang ke hilir sedangkan ion negatif (anion) dapat dianalogikan
sebagai ikan yang sedang berenang ke hulu, dan molekul netral dapat dianalogikan sebagai
ikan mati. Bila air sungai mengalir dengan deras maka semua ikatan yang ada dalam sungai
akan menuju ke hilir.
Kecepatan ion-ion atau molekul bermuatan (solut) menuju katoda dipengaruhi oleh
medan listrik yang dapat di formulasi sebagai berikut
V = μef E + μeo E (persamaan 2.15)
V menyatakan kecepatan solut menuju katoda, μef adalah mobilitas elektroforetik, μeo adalah
mobilitas elektroosmotik, dan E adalah tegangan listrik(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Gambar 2.6 Pengaruh aliran elektroosmotik dalam elektroforesis kapiler
(sumber: L. Thompson, et.al (1997))
Efisiensi Elektroforesis kapiler.
Seperti dalam kromatografi moderen, efisiensi (N) merupakan faktor penentu
keberhasilan pemisahan. Oleh karena itu keluaran elektroforesis kapiler menyerupai
kromatogram maka peak elektroforesis merupakan indikator efisiensi, semakin tajam suatu
peak semakin efisiensi pemisahan tersebut. Selain efisiensi pemisahan elektroforesis dapat
dihitung dengan cara yang sama dengan HPLC, efisiensi pemisahan elektroforesis dapat
dinyatakan dengan formula berikut(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
27
N = (μef +μeo) E2 D (persamaan 2.16)
Seperti dalam persamaan, μef menyatakan mobilitas elektroforetik, μef menyatakan
mobilitas elektroforentik, μeo adalah mobilitas elektroosmotik, E adalah tegangan listrik yang
diberikan, dan D adalah koefisien difusi solut(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Berdasarkan persamaan diatas, efisiensi ditentukan oleh tegangan listrik dan
koefisien difusi. Semakin besar tegangan listrik yang diberikan maka semakin efisien
pemisahan. Oleh karena itu, tegangan listrik yang dialirkan ke dalam sistem elektroforesis
sangat besar (10.000-30.000 V). Molekul kecil akan lebih cepat berdifusi lambat atau D
besar, sebaliknya molekul besar akan terdifusi lambat atau D kecil. Efisiensi pemisahan (N)
dalam elektroforesis kapiler berbanding terbalik dengan koefisien difusi (D). Semakin kecil
koefisien difusi maka semakin besar harga N. Artinya, pemisahan elektroforesis akan
semakin baik untuk molekul-molekul yang besar. Gambar 4 terlihat bahwa harga N naik
tajam dengan kenaikan tegangan listrik hingga mencapai 20 kv dan mencapai puncaknya
pada 30 kv. Pemberian tegangan yang terlalu tinggi (>30 kv) tidak menyebabkan kenaikan
harga N lagi. Hal ini disebabkan sistem tidak dapat lagi menghilangkan panas yang
ditimbulkan oleh tegangan tinggi. Ingat, rendahnya efisiensi dalam elektroforesis
konvensional diaktivkan oleh panas yang ditimbulkan oleh tegangan listrik yang
tinggi(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
C. Instrumentasi Elektroforesis
1. Elektroforesis Gel
Sebuah ruang elektroforesis dengan waduk penyangga dan
thermostat pendingin dan komponen utama yang diperlukan untuk
28
elektroforesis gel. pemisahan dapat dilakukan secara vertikal atau
horizontal. catu daya memberikan tegangan typi xallally 200-500 V
dengan arus listrik cof 400 Artikel Baru 100. elektroda dicelupkan ke
dalam waduk penyangga di setiap sisi gel. untuk sebagian pemisahan
biomolekuler, pH Sochen bahwa analit bermuatan negatif. sehingga analit
bermigrasi ke arah pada anoda. Seluruh instrumen dalam kotak isolasi untuk
melindungi pengguna dari tegangan tinggi .
Ruang elektroforesis mengandung matriks gel direndam dalam buffer elektrolit. gel
vertikal dapat dipolimerisasi dalam tabung kaca atau Perspex dengan 0,5 sampai 1 cm id dan
3 sampai 10 cm panjangnya. alternatif gel dapat berperan sebagai lempengan persegi
panjang tipis di mana beberapa sampel dapat dijalankan secara paralel. gel slab dapat
dipolimerisasi pada foil lembam untuk pemisahan horizontal atau dituangkan ke dalam
tangki vertikal. ketebalan gel slab adalah sekitar 1-3 mm. minigel yang memiliki panjang
dan lebar sekitar 8cm x 8 cm, tapi gel lebih besar hingga 40 x 20 cm juga umumnya
digunakan.
Untuk pemisahan vertical,Sampel dilarutkan dalam gliserol atau sukrosa solusi
kepadatan tinggi untuk mencegah mereka dari pencampuran dengan penyangga di upper
reservoir. sumur sampel dalam gela slab dibuat selama pengecoran dengan menggunakan
sisir atau pembentuk yang tepat. karena bentuk dari sampel sumur, bergerak analit dalam
bentuk pita yang sempit dan lebar
Termostat diperlukan untuk kontrol tempratur. ruang dikontrol temperatrue
memastikan lebih direproduksi separatios Dan karena mereka membantu untuk mengusir
panas dan melindungi analit sensitif dari degradasi termal. Pemisahan dapat memnggunakan
29
waktu beberapa jam. setelah selesai gel dihapus dari pemegangnya. Pita analit daripada
divisualisasikan, biasanya dengan pewarnaan.
Gambar 2.7 Bentuk –bentuk Elektroforesis Gel; a. bentuk tabung; b. bentuk horizontal; c.
bentuk vertical (Andreas Manz, et.al, 2010)
Preparasi Sampel Dan Sistem Buffer
30
Contoh ini dilarutkan dalam larutan kepadatan tinggi, biasanya
mengandung gliserol dan diterapkan pada sumur sampel. untuk
menghindari pemblokiran untuk gel sampel pori-pori harus tidak
mengandung partikel padat. konsentrasi tinggi dan garam dan
penyangga dalam sampel dapat mengganggu pemisahan elektroforesis.
maka harus dijaga agar tetap minimum, biasanya, 50 nm. jumlah sampel
yang diperlukan tergantung pada metode deteksi, jumlah khas di ordee
g. yang volume sampel tergantung pada ukuran sampel juga, yang bisa
berkisar dari L ke Ml
Visualisasi Dan Deteksi
Bentuk Pita dipisahkan yang paling sering divisualisasikan dengan pewarnaan
dengan warna, pewarna fluorescent atau dengan perak. pewarna dan commomly digunakan
adalah coomassie brilian biru. gel direndam dalam larutan alkohol asam ini temperatur tinggi
pewarna dan dibiarkan selama beberapa jam, pewarna Kelebihan ini kemudian dihapus oleh
jumlah mencuci langkah. Deteksi batas untuk protein berkisar sekitar 100 ng ke 1.
pewarnaan perak lebih sensitif dengan batas deteksi, 1 ng. proses pewarnaan ini mirip
dengan protografhy
Metode Gel Elektroforesis
A. Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Elektrforesis (SDS – PAGE)
Prinsip pemisahan SDS_PAGE semata-mata didasarkan pada perbedaan ukuran
protein dan berat molekul. protein yang benar-benar didenaturasi dengan adanya deterjen
anionik natrium dedocyl asetat (SDS). Preparasi sampel biasanya melibatkan pemanasan
31
protein pada temperature 950C. dengan adanya SDS yang berbih dan agen tiol-reducing
seperti ᵝmercapto etanol. Hasilnya lengkap diperoleh terjadi pada struktur sekunder dan
tersier. Molekul melintang melalui jembtan yaitu sulfide dan ikatan SDS dengan asam amino
B. Isoelektrik Focussing (IEF)
Isoelektrik Focussing (IEF) memungkinkan pemisahan analit zwitterionic seperti
protein atau peptida menurut ke titik isoelektrik mereka. ief diterapkan untuk pemisahan dan
pemurnian protein peptida dan asam amino pada analitis serta skala preparatif. Gel agarose
dan PA keduanya digunakan pada metode IEF.
C. Dua Dimensi Gel Elektroforesis (2D-GE)
Pada 2D-GE, dua metode elektroforesis dikombinasikan dengan gel tunggal. Bagian
yang satu akan terpisah yang dibentuk dengan satu dimensi, berikutnya yang lain akan
terpisah sama dengan yang pertama. Dengan metode ini, pencampuran seribu protein atau
asam nukleat dapat dipisahkan dengan resolusi yang tinggi. Hasil fingerprint dapat
dibandingkan dengan database elektronik. Hasilnya bisa, bagaimanapun, sulit untuk
mereproduksi dan metode ini secara teknis menantang membutuhkan pengalaman personil
dalam operasi.
2. Instrumen Elektroforesis Kapiler
Instrumentasi elektroferesis kapiler diperhatikan pada gambar 2.8, yang terdiri dari
beberapa komponen yaitu pipa kapiler, larutan buffer, detektor dan rekorder(Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006).
32
Gambar 2.8 Diagram instrumentasi elektroforesis Kapiler (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Pipa Kapiler.
Media pemisahan kertas atau agar-agar pada elektroforesis konvesional diganti dengan pipa
kapiler yang terbuat dari gelas dengan diameter dalam berkisar antara 25-100 μm dan
panjang antara 50-100 cm. Dimensi pipa kapiler, diameter dan panjang ternyata
mempengaruhi efisiensi (N) pemisahan elektroforesis kapiler. Hal ini dapat diperhatikan
pada gambar 2.9 dan 2.10
33
Gambar 2.9 Pengaruh diameter pipa kapiler terhadap efisiensi (N) elektroforesis kapiler (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Semakin kecil ukuran dimeter pipa kapiler maka semakin besar harga N (pada
gambar 6) oleh karena itu, semakin besar diameter (> 100 m) maka pemisahan semakin tidak
efisien.
Gambar 2.10 pengaruh panjang kapiler terhadap efisiensi (N) elektroforesis
Kapiler((Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
34
Buffer.
Pipa kapiler diisi dengan larutan buffer dan kedua ujung pipa kapiler tersebut
tercelup dalam larutan buffer selain berfungsi sebagai larutan elektrolit untuk menghantarkan
arus listrik juga berfungsi pengontrol muatan molekul. Karena sutu molekul dapat bermuatan
positif, negatif atau netral bergantung pada pH larutan dan sebagaimana fungsi buffer dapat
menahan pH. Dengan kata lain, pH buffer dapat mengontrok selektifitas pemisahan
elektroforesis. Hal ini dapat ditunjukan pada gambar 2.11
Gambar 2.11 Pengaruh pH buffer terhadap selektivitas pemisahan peptide dengan elektroforesis kapiler(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Sumber arus.
Dalam elektroforesis konvensional dialirkan arus searah sekitar 100 Volt tapi dalam
elektroforesis kapiler dialirkan arus searah bertentangan sangat tinggi 10.000-30.000 Volt
seperti pada persamaan, bahwa kecepatan solut menuju katoda berbanding dengan tegangan
listrik. Oleh karena itu tidaklah mengherankan bahwa eksperimen elektroforesis kapiler
dapat dilakukan dalam beberapa menit sementara eksperimen elektroforesis konvesional
35
dilakukan mungkin dalam sehari. Selain itu, tegangan listrik yang tinggi mempengaruhi
efisiensi pemisahan dalam elektroforesis kapiler, seperti pada gambar 4.
Sistem Pemasukan Cuplikan
Cuplikan berupa larutan yang akan dipisahkan dimasukkan melalui ujung pipa
kapiler yang tercelup dalam anoda. Teknik pemasukan cuplikan ke dalam pipa kapiler dapat
dilakukan dengan dua cara yaitu berdasarkan tekanan dan elektrokinetika yang masing-
masing dapat diformasi dengan persamaan.
Q = ∆ pπ 4 tC
8 ηL (persamaan 2.17)
Q = ¿ (persamaan 2.18)
Q adalah jumlah cuplikan yang disuntikan, P adalah beda tekanan di antara kedua ujung pipa
kapiler, r adalah jari-jari pipa kapiler, t adalah lamanya pengaliran tegangan listrik, C adalah
konsentrasi cuplikan, η adalah visikositas, μef dan , μeo, kuata rus, dan L adalah panjangh pipa
kapiler. Bila ujung pipa kapiler dicelupkan ke dalam cuplikan maka dengan gaya kapilaritas
cuplikan akan terisap dengan sendirinnya karena adanya perbedaan tekanan di antara kedua
ujung pipa kapiler. Kemudian ujung pipa kapiler tersebut dicelupkan kembali ke dalam
larutan buffer. Dengan teknik elektrokinetik, tegangan listrik dialirkan beberapa saat ketika
salah satu ujung pipa kapiler tercelup dalam cuplikan. Dengan demikian sejumlah cuplikan
akan masuk kedalam pipa kapiler. Ternyata konsentrasi cuplikan mempengaruhi efisiensi
elektroforesis kapiler pada gambar 2.12 dan 2.13.
36
Gambar 2.12 Pengaruh konsentrasi cuplikan terhadap lebar peak dancyl leucine hasil pemisahan elektroforesis kapiler (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Gambar 2.13 Pengaruh konsentrasi cuplikan terhadap efisiensi (N)(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Detektor.
Semua solut baik yang bermuatan maupun netral bergerak ke satu arah yaitu
kekatoda maka hal ini mempermudah pendeteksian. Dengan demikian detektor dapat
diletakan di salah satu ujung pipa kapiler yaitu didekat katoda. Berbagai detektor telah
digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen hasil pemisahan, antara lain spektrometri
(seperti UV, dan Fluoresen) dan detektor elektrokimia (seperti konduktometri dan
37
amperometri). Detektor UV diperlihatkan dalam gambar 2.14. Keuntungan penggunaan pipa
kapiler yang terbuat dari gelas silika adalah transparan terhadap sinar UV. Hal ini
memungkinkan pendeteksian aliran komponen hasil pemisahan secara online, artinya tidak
perlu mengganggu aliran komponen hasil pemisahan. Detektor flurosen pada gambar 2.15
dapat digunakan dalam elektroforesis kapiler dengan teknik penggunaan yang sama detector
UV, detektor elektrokimia pada gambar 2.16.
Gambar 2. 14 Detektor UV (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).Semua komponen campuran (solut) bergerak ke anoda dan ketika solut melawati sinar UV
maka sinar tersebut akan teradsorbsi yang selanjutnya intensitas cahaya yang diserap oleh
solut-solut dapat diukur sebagai besaran listik.
Gambar 2. 15 Detektor Fluoresen (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
38
Gambar 2.16 Detektor Elektrokimia(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
D. Aplikasi Elektroforesis
1. Elektroforesis Gel (GE)
Sebuah sample pada pemisahan gel dari fragmen DNA bakteri yang ditunjukkan pada
gambar 2.17 . Pada dasarnya label fluorescent digunakan untuk visualisasi asam nukleat.
Pada satu gel , 18 sampel dan satu standar pencampuran dijalankan secara paralel.
Standar pencampuran mengandung molekul dengan dasar berpasangan panjangnya.
Pemisahan pattern dikandung dari standar pencampuran yang juga sebagai ladder.
Jumlah dasar berpasangan dari fragmen DNA dapat diperkirakan oleh perbandingan
pita ke pita dalam barisan DNA.
39
Gambar 2.17 Elekroforesis Gel pada produksi amplikasi PCR dari Genomic
DNA dari jenis strain bakteri Pseudomonas putida
2. Elekroforesis Kapiler (CE)
Analisis Peptida.
Peptida disusun oleh beberapa asam amino , jadi molekul peptide lebih besar daripada
molekul asam amino. Hasil pemisahan sintesis peptide dengan metode CE dan HPLC
diperlihatkan pada gambar 2.17.
Gambar 2.17 Hasil pemisahan sintesis peptide dengan metode ( A) CE dan B (HPLC) (sumber Anal, chem. 61, 1188, 1989)
40
Detektor UV digunakan pada kedua metode pemisahan tersebut. CE dilakukan pada
pipa kapiler dengan panjang 65 cm dan diameter 50 mikrometer dalam buffer citrate.
Sedangkan HPLC dilakukan secara gradien pada kolom C-8 (220 x 2 mm) dengan fas gerak
0.1 % “ (FA dalam air dan 0,08 % TFA dalam acetonitril. Hasilnya, CE memperlihatkan
jumlah peak yang lebih banyak daripada peak HPLC yang berarti CE memberikan resolusi
yang lebih baik daripada HPLC untuk pemisahan peptide.
Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya :
1. Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang
memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam
mengungkap sebuah kasus.
2. Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk
memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.
3. Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.
Kelebihan dan Kekurangan dalam Elektroforesis
Metode pemisahan elektroforesis cukup dengan peralatan sedrhana, digunakan untuk
memisahkan suatu sampel molekul besar seperti protein, asam nukleat, asam amino dan
karbohidrat, dan dalam proses pengerjaan yang mudah dan sederhana. Akan tetapi memiliki
keterbatasan dalam hal yang efisiensi yang rendah , waktu pemisahan yang relative lama,
dan berlaku untuk senyawa yang berwarna saja. Factor penyebabnya biasanya karena kuat
arus searah yang relative rendah, kecepatan pemisahan tergantung pada penamabahan
tegangan listrik yang searah. Selain itu tegangan listrik yang searah dapat menyebabkan
noda hasil pemisahan menjadi tidak jelas akibat kerusakan noda oleh panas yang dihasilkan
41
tegangan listrik searah yang tinggi sehingga noda-noda hasil pemisahan elektroforesis
menjadi tidak terlalu jelas memisah.
42
BAB III
KESIMPULAN
1. Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas analit
menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat diterapkan
untuk pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk protein, asam nukleat,
asam amino dan karbohidrat.
2. Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada interaksi partikel-partikel bermuatan
oleh medan listrik. Partikel bermuatan listrik negatiaf akan bergerak kekutub positif
(anoda). Sebaliknya , partikel bermuatan listrik positif akan bergerak kekutub negative
(katoda). Sementara partikel netral tidak bergerak . Jadi medan listrik menyebabkan
pemisahan pada metode elektroforesis.
3. Jenis-jenis elektroforesis adalah elektroforesis zona (wilayah), elektroforesis kertas,
elektroforesis Gel, dan elektroforesis kapiler
4. Gel media dalam elektroforesis gel (GE) adalah gel agarosa dan Gel poliakrilamida
5. Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya :di
bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki
karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam mengungkap
sebuah kasus.Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu
cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk
PCR.Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.
43
DAFTAR PUSTAKA
Andreas Manz, et.al, 2010, “Bioanalytical Chemistry” published by Imperial College Press, London
Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: nucleid acids. Bios scientific Publisher, Oxford: xvi + 175 hlm.
Richardson, b. J, p. R. Baverstock and m. Adams 1986. Allozyme electro- phoresis. A handbook for animal sys- tematics and population studies. Aca- demic press, inc. San diego : 410 pp. Sambrook, j. & d. W. Russell. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual vol 2. 3rd ed. Cold spring harbour laboratory press, new york: xvii + 3.4--14.53 + 1.44
Rothe, g. M. 1995. Electrophoresis of enzymes. Springer - verlag. Berlin heidelberg: 278 pp. Hlm.
S.M. Kopkar. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. Universitas Indonesia. Jakarta.
Sumar Hendayana , PH.D. 2006, “ Kimia Pemisahan Metode kromatografi dan Elektroforesis Modern “ PT. Remaja Rosdakarya.
Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing Company, Belmont: xvii + 820 hlm.
file:///D:/Kelebihan%20Dan%20Kekurangan%20Elektroforesis.htm. Sumber:Dr.Endang Saepuddin dan Dra. Siswati Setiasih Msi.Apt. 2009.Handout Kuliah Bioteknologi, Diaccess pada tanggal 15 Mei 2013.