UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Laboratorium voor Analytische Chemie Academiejaar 2009-2010 MAGNESIUM – FARMACEUTISCHE CONTEXT, ANALYTISCHE METHODES EN VALIDATIE VAN EEN IONENCHROMATOGRAFISCHE METHODE Renate VAN DE VIJVER Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling Promotor Prof. dr. L. Thienpont Commissarissen Dr. K. Van Uytfanghe Prof. dr. W. Lambert
59
Embed
MAGNESIUM – FARMACEUTISCHE CONTEXT ......CLSI EP Clinical and Laboratory Standards Institute Evaluation Protocols cm³ Kubieke centimeter conc. Concentratie CV Variatiecoëfficiënt
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Farmaceutische Analyse
Laboratorium voor Analytische Chemie
Academiejaar 2009-2010
MAGNESIUM – FARMACEUTISCHE CONTEXT, ANALYTISCHE METHODES EN VALIDATIE VAN EEN
IONENCHROMATOGRAFISCHE METHODE
Renate VAN DE VIJVER
Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling
Promotor Prof. dr. L. Thienpont
Commissarissen Dr. K. Van Uytfanghe Prof. dr. W. Lambert
AUTEURSRECHT
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander
gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met
betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van
de resultaten uit deze masterproef.”
14 mei 2010
Promotor Auteur
Prof. dr. L. Thienpont Renate Van de Vijver
DANKWOORD
Hierbij wil ik mijn uitdrukkelijke dank betuigen aan een aantal personen die hebben
bijgedragen tot het tot stand komen van deze masterproef.
Mijn promotor Prof. dr. L. Thienpont voor de algemene leiding van de
onderzoeksstage en voor het nazicht van de afgeleverde masterproef.
Dr. D. Stöckl voor het bijbrengen van de statistische interpretatie, voor het
beantwoorden van alle mogelijke vragen en voor de begeleiding gedurende de hele
onderzoeksstage.
Dr. K. Van Uytfanghe voor het grondig nalezen van mijn masterproef.
De doctoraatsstudenten Hedwig Stepman en Sofie Van Houcke voor hun bijstand bij
het uitvoeren van de experimenten in het laboratorium.
Verder wil ik ook mijn medestudenten Sofie, Stefanie, Hanne, Elise en Lode
vermelden voor de aangename werksfeer in het labo en de toffe babbels.
Als laatste wil ik nog mijn ouders, mijn broer en mijn vriend Jochen bedanken voor de
verzameld worden aan de hand van validatie-experimenten en de verkregen
validatiegegevens moeten geïnterpreteerd worden (Stöckl et al., 2009).
Voor het uitvoeren van een succesvolle validatie moeten verschillende
stappen ondernomen worden. De stappen die ondernomen worden voor de
methodevalidatie worden beschreven in een validatieplan. In Tabel 1.1 zijn de
stappen weergegeven die het validatieplan ten minste moet bevatten wanneer een
nieuw ontwikkelde analytische methode gevalideerd wordt. In deze masterproef
wordt een methodevalidatie gedaan van een reeds bestaande analysemethode,
enkele stappen van het validatieplan zullen dus niet worden uitgevoerd of zijn reeds
bepaald.
TABEL 1.1: VALIDATIEPLAN GEBRUIKT BIJ DE METHODEVALIDATIE VAN EEN NIEUW
ONTWIKKELDE ANALYSEMETHODE (Stöckl, 2007b).
- Definieer het gebruik, het doel en het bereik van de methode
- Definieer de prestatiekenmerken en de aanvaardbaarheidscriteria
- Ontwikkel een validatieprotocol of werkprocedure voor de validatie
- Bepaal de materialen bv. standaarden, reagentia en stalen
- Voer de validatie-experimenten uit
- Documenteer de validatie-experimenten en de resultaten in een validatierapport
- Interpreteer de validatiegegevens en maak op statistiek gebaseerde beslissingen
De prestatiekenmerken die bij de methodevalidatie kunnen geëvalueerd
worden zijn imprecisie, detectielimiet, werkgebied, lineariteit, terugvinding en
2
interferentie. Naast de evaluatie van deze prestatiekenmerken wordt een
methodevergelijking uitgevoerd waarbij een routinemethode wordt vergeleken met
ionenchromatografie als referentiemethode. Van de prestatiekenmerken die in deze
masterproef onderzocht worden, zijn de definities weergegeven in Tabel 1.2.
TABEL 1.2: DEFINITIES VAN DE PRESTATIEKENMERKEN DIE IN DEZE MASTERPROEF
ONDERZOCHT WORDEN.
Prestatiekenmerk Definitie
Precisie1 Mate van overeenkomst tussen de gemeten
hoeveelheden, verkregen door herhaalde metingen op
dezelfde of soortgelijke stalen onder vastgestelde
condities.
Imprecisie1 Numerieke maat voor de spreiding van de
analyseresultaten bekomen bij de precisie.
Detectielimiet1 Gemeten hoeveelheid, verkregen via een bepaalde
meetprocedure, waarbij de probabiliteit voor het vals
concluderen dat het analyt niet aanwezig is in het staal
β is en de probabiliteit voor het vals concluderen dat het
analyt aanwezig is in het staal α is.
Detectielimiet in analyse2 De detectielimiet, uitgedrukt als concentratie of
hoeveelheid, wordt afgeleid van de laagste meting die
met redelijke zekerheid kan gedetecteerd worden via
een gegeven analytische procedure.
Lineariteit3 Mogelijkheid van een analytische procedure om
resultaten te geven die evenredig zijn met de
concentratie van het analyt.
Juistheid1 Mate van overeenstemming tussen het gemiddelde van
een oneindig aantal herhaalde metingen en een
referentiewaarde. 1: “International vocabulary of metrology” (http://www.bipm.org/en/publications/guides/vim.html) 2: “International Union of Pure and Applied Chemistry” (IUPAC) (http:// goldbook.iupac.org/) 3: (Stöckl, 2007b)
3
De experimenten die gedurende de methodevalidatie uitgevoerd worden zijn
afhankelijk van de prestatiekenmerken die gevalideerd worden. In deze masterproef
worden de in Tabel 1.2 beschreven prestatiekenmerken experimenteel bepaald
volgens de “Clinical and Laboratory Standards Institute Evaluation Protocols” (CLSI
EP).
Om de prestatiekenmerken na de uitgevoerde experimenten te beoordelen
zijn er aanvaardbaarheidscriteria/specificaties nodig. De specificaties kunnen van
statistische, analytische of toepassingsafhankelijke aard zijn.
Toepassingsafhankelijke specificaties worden gedefinieerd in functie van het
specifieke gebruik van de methode. De verkregen testresultaten worden vergeleken
met de specificaties aan de hand van statistische testen of door het opstellen van
betrouwbaarheidsintervallen. Voor het vergelijken met de drie verschillende
specificaties zijn de statistische testen dezelfde, enkel de interpretatie van de
statistische test is verschillend. Bij een statistische specificatie wordt het resultaat
van de test vergeleken met de nulhypothese. Voor een analytische specificatie wordt
er vergeleken met een geschatte waarde voor een stabiel proces (Stöckl, 2007b).
1.2 MAGNESIUM
1.2.1 Structuur en eigenschappen Magnesium (Mg) behoort tot de groep van de aardalkalimetalen en bevat 2
valentie elektronen. Het atoomnummer van magnesium is 12, de atomaire massa
24.305 g/mol. Isotopen van magnesium zijn Mg24 (78.70%), Mg25 (10.13%) en Mg26
(11.17%). Magnesium is een zilverwit metaal met een hexagonale kristalstructuur.
Het oxideert traag in vochtige lucht. Voor de industriële bereiding van magnesium
wordt MgO-houdend materiaal gereduceerd. Magnesium is verkrijgbaar als
metaalstaaf, metaaldraad en als poeder. De reactie met water bij kamertemperatuur
verloopt traag, bij 100°C is magnesium beter oplosbaar in water. Magnesium is goed
oplosbaar in verdunde zuren. In Tabel 1.3 worden enkele andere fysische
eigenschappen van magnesium gegeven (The Merck Index, 2001).
4
TABEL 1.3: FYSISCHE EIGENSCHAPPEN VAN MAGNESIUM.
Smeltpunt 651°C
Kookpunt 1100°C
Specifieke dichtheid bij 20°C 1.738 g/cm³
Specifieke warmte bij 20°C 1020 J/kg.K
Smeltwarmte 8.954 kJ/mol
Standaardelektrodepotentiaal (Mg+2/Mg) -2.37 V
1.2.2 Functie Magnesium is het vierde meest voorkomende kation in het lichaam. De helft
van het totale magnesium komt voor in de beenderen, de andere helft in de spieren
en andere weefsels. Slechts 1% van het totale magnesium is aanwezig in het bloed.
Intracellulair is magnesium het tweede meest voorkomende divalente kation.
Het is betrokken bij meer dan 300 verschillende enzymatische reacties als ofwel een
structurele cofactor of een allosterische activator.
De voornaamste functie van magnesium is het stabiliseren van de structuur
van adenosinetrifosfaat (ATP) in ATP-afhankelijke enzymatische reacties.
Magnesium bindt tussen de fosfaatgroepen van ATP en adenosinedifosfaat (ADP).
Zo neutraliseert het de negatieve lading en vergemakkelijkt het de binding van de
nucleotide fosfaten aan de enzymen die het gebruiken als substraat. Magnesium
interageert dus zelf niet direct met de enzymen, maar is via het nucleotide substraat
verbonden aan het enzymcomplex. Hierdoor speelt magnesium een belangrijke rol in
alle nucleotide tri- of difosfaat afhankelijke enzymatische reacties in het metabolisme.
Binding van magnesium aan sommige enzymen of proteïnen is ook vereist om
hen te stabiliseren in de actieve conformatie of om de vorming van een actieve
bindingsite te activeren.
De enzymatische reacties waarbij magnesium betrokken is maken deel uit van
de cellulaire energieproductie en -opslag, proteïnesynthese, DNA- en RNA-synthese,
celgroei, adenylaatcyclase synthese, onderhouden van de cellulaire elektrolyt
samenstelling en stabilisatie van de mitochondriale membranen. Magnesium speelt
5
een belangrijke rol in de controle van de neuronale activiteit, cardiale prikkelbaarheid,
neuromusculaire geleiding, spiercontractie, vasomotorische tonus en de bloeddruk
(Bohl & Volpe, 2004).
1.2.3. Voorkomen Magnesium is aanwezig in diverse voedingsmiddelen. Groenten en granen
zijn rijk aan magnesium. Vlees en zuivelproducten bevatten minder magnesium.
Behandeling van het voedsel en bereidingstechnieken zorgen ervoor dat de
magnesiuminhoud van bloem, granen, rijst, groenten en suiker vermindert. Mineralen
gaan vaak verloren gedurende de opzuivering en de behandeling van het voedsel.
Ze worden dikwijls niet terug toegevoegd. Voedingsmiddelen rijk aan magnesium zijn
Er wordt veel onderzoek gedaan naar het gebruik van magnesium in de
cardiologie. Meer bepaald bij de behandeling van acuut myocard infarct en van
aritmieën. Over het gebruik van magnesium bij acuut myocard infarct bestaat
discussie. Studies hebben aangetoond dat patiënten met een laag mortaliteitsrisico
en die voordeel ondervinden van therapie met trombolytica en aspirine geen nut
ondervinden van de toediening van magnesium. Bij hoge risico patiënten die niet
geholpen zijn met het gebruik van trombolytica blijkt magnesium wel nuttig te zijn.
(Fawcett et al., 1999). Patiënten met hypomagnesiëmie gerelateerde aritmieën
reageren goed op de behandeling met magnesium. De therapie wordt onderhouden
tot zowel de kalium- als magnesiumspiegels terug genormaliseerd zijn. Behandeling
bestaat er dus in om kalium en magnesium toe te dienen (Fawcett et al., 1999).
Naast aritmiën gerelateerd aan hypomagnesiëmie reageren ook aritmiën waarbij
normale magnesiumspiegels optreden positief op de behandeling met magnesium.
Dit is het geval bij digitalis gerelateerde aritmie (Swain & Kaplan-Machlis, 1999).
Er is ook onderzoek gedaan naar het gebruik van magnesium bij
astmapatiënten. Uit het merendeel van de studies kan besloten worden dat
intraveneuze toediening van magnesiumsulfaat effectief is voor patiënten met
ernstige astma die niet reageren op de standaardtherapie. Ook is aangetoond dat
inhalatie van magnesiumsulfaat de longfunctie verbetert (Guerrera et al., 2009;
Swain & Kaplan-Machlis, 1999).
Als laatste wordt het gebruik van magnesium in de behandeling van hoofdpijn
bij migraine besproken. Een enkele dosis van 600 mg oraal trimagnesium dicitraat
reduceert de frequentie van het optreden van migraine. Bij de acute behandeling van
migraine toont de intraveneuze toediening van magnesiumsulfaat een significante
verbetering in de behandeling van alle symptomen (Guerrera et al., 2009).
Op dit moment zijn er enkel magnesiumpreparaten op de markt die worden
gebruikt als antacidum, laxativum, behandeling van hypomagnesiëmie, preëclampsie
en eclampsie. Magnesium is ook aanwezig in baxteroplossingen voor peritoneale
dialyse. Naar de andere toepassingsdomeinen van magnesium wordt nog steeds
verder onderzoek gedaan.
39
4.9.3 Analysemethoden voor magnesium In deze masterproef wordt een validatie gedaan van
ionenuitwisselingschromatografie als analysemethode voor magnesium. Voor het
literatuuronderzoek wordt op zoek gegaan naar andere analysemethoden voor
magnesium. De verschillende zoekopdrachten die hiervoor gebruikt zijn worden
weergegeven in Tabel 4.8.
TABEL 4.8: OVERZICHT VAN DE VERSCHILLENDE ZOEKOPDRACHTEN BIJ DE
LITERATUURSTUDIE NAAR ANALYSEMETHODEN VOOR MAGNESIUM
Gebruikte
zoekmachine
Ingegeven zoekwoorden Aantal
hits
Opmerkingen
Google “determination” AND
“magnesium”
3.370.0
00
Er werden vooral oude
artikels gevonden.
Van andere artikels kon de
volledige tekst niet
geraadpleegd worden.
Verder gezocht via PubMed
en Web of science.
PubMed (analysis[Title]) AND
magnesium[Title]
208 Levert niet de verwachte
resultaten op
PubMed (determination[Title]) AND
magnesium[Title]
449 Eerste 50 artikels bekeken.
7 artikels gebruikt.
Ook referenties in gevonden
artikels bekeken. Hiervan 4
artikels gebruikt.
Web of
science
determination (title) AND
magnesium (title)
1290 Eerste 50 artikels bekeken.
Levert na PubMed geen
extra informatie op.
Web of
science
“determination” (topic)
AND “divalent cations”
(topic)
195 Eerste 50 artikels bekeken.
Levert niet de verwachte
resultaten op.
PubMed “complexometric titration”
AND magnesium
13 1 artikel gebruikt
40
Als meest frequent gebruikte analysemethode voor de bepaling van
magnesium in verschillende stalen wordt vlam atomaire absorptiespectrometrie
(Flame Atomic Absorption Spectrometry, FAAS) aangewend. Het is een relatief
goedkope techniek en vertoont een hoge analytische performantie. Deze
analysemethode bevat echter enkele nadelen. Het organische materiaal in een staal
kan aanleiding geven tot spectrale interferenties, vandaar dat het organische
materiaal tijdens de staalvoorbereiding moet verwijderd worden. Een ander nadeel
van vlam atomaire absorptiespectrometrie is het smalle lineaire respons bereik van
de atomaire absorptiespectrometer. Dit stelt op zich geen probleem aangezien de
stalen kunnen verdund worden zodat ze toch kunnen geanalyseerd worden. Dit vergt
echter wel extra tijd waardoor de bepaling langer zal duren (López-García et al.,
1999).
Naast atomaire absorptiespectrometrie wordt ook inductief gekoppeld plasma
atomaire emissiespectrometrie (AES) vaak gebruikt als analysemethode voor
magnesium. Deze analysemethode is gevoeliger en heeft een groter lineair
dynamische bereik dan atomaire absorptiespectrometrie (Yang et al., 2002).
Een vaak gebruikte routinemethode voor de analyse van magnesium is UV-
Vis spectrofotometrie. UV-Vis spectrofotometrie is een eenvoudige, snelle en
goedkope techniek voor de bepaling van magnesium. Hierbij zal magnesium
reageren met een kleurreagens waarbij een kleurcomplex wordt gevormd. Dit
kleurcomplex kan gedetecteerd worden bij zijn absorptiemaximum. Er kan geen
onderscheid gemaakt worden in het kleurcomplex gevormd met calcium. Vandaar
moet in stalen waarbij magnesium en calcium samen aanwezig zijn interferentie
vermeden worden door het toevoegen van een “masking agent”. De UV-Vis
spectrofotometrische analyse van magnesium kan worden aangewend voor
verschillende soorten stalen. UV-Vis detectie krijgt de voorkeur boven FAAS detectie
vanwege de lagere kosten en de milieuvriendelijkheid (Tesfaldet et al., 2004).
Manuele spectrofotometrische analysen zijn gevoelig aan fouten. Vandaar
worden methoden ontwikkeld om de spectrofotometrische analysen te
automatiseren. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van flowanalysen. De meest
gebruikte flowanalysemethoden zijn “flow injection” analyse en “sequential injection”
41
analyse. “Sequential injection” analyse krijgt de voorkeur, omdat er minder staal en
reagens verbruikt wordt (Tesfaldet et al., 2004). Deze flowanalysemethoden worden
ook gebruikt bij de fluorimetrische bepalingen (de Armas et al., 2000) van
magnesium.
Zoals hierboven al vermeld worden er ook fluorimetrische analysemethoden
gebruikt. Magnesium aanwezig in het te onderzoeken staal zal een complex vormen
met een fluorescerende stof, in dit geval 8-hydroxychinoline-5-sulfonzuur. De
fluorescentie van het gevormde complex kan worden bepaald via fluorimetrie. Ook
hier kan er geen onderscheid worden gemaakt tussen het complex dat met calcium
gevormd wordt. Vandaar wordt er een “masking agent” voor calcium toegevoegd. (de
Armas et al., 2000).
Andere analysemethoden voor magnesium maken gebruik van
elektroforetische scheidingstechnieken. Hieronder vallen capillaire zone elektroforese
en isotachoforese.
Bij capillaire zone elektroforese is de scheiding gebaseerd op het verschil in
elektroforetische mobiliteit van de analyten. Deze mobiliteit is afhankelijk van de
grootte, lading en de vorm van het ion (Pantsar-Kallio & Manninen, 1995). De
detectie van de analyten kan gebeuren via indirecte meting van de UV-absorptie en
via conductiviteitsmeting. Voor detectie via UV-absorptie moeten er UV-
absorberende additieven worden toegevoegd aan de buffer en zijn er complexere
buffersystemen nodig. Vandaar zal de detectie via conductiviteitsbepaling de
voorkeur krijgen (Nussbaumer et al., 2010) .
Capillaire elektroforese heeft als voordeel ten opzichte van
ionenchromatografie dat de bepaling van magnesium veel sneller en efficiënter zal
verlopen. Ook kan bij capillaire elektroforese de analyse direct gestopt worden nadat
de gewenste component geëlueerd is. Dit heeft als voordeel dat er minder elektrolyt
verbruikt wordt. Een bijkomend voordeel van capillaire elektroforese is dat er een
kleiner volume staal moet geïnjecteerd worden. Hierdoor zijn de kosten voor
capillaire elektroforese in het algemeen lager dan voor ionenchromatografie. Nadelen
van capillaire elektroforese zijn de lagere detectielimiet en de kleinere
42
reproduceerbaarheid van de metingen (Pantsar-Kallio & Manninen, 1995;
Nussbaumer et al., 2010). Capillaire elektroforese kan worden gebruikt voor de
analyse van magnesium in verschillende soorten stalen zoals serum, urine, zeewater
(Prest el al., 2009).
Isotachoforese is een andere vorm van elektroforetische scheiding. Bij
isotachoforese wordt een staal tussen een voorste en achterste elektrolyt geplaatst.
Het voorste elektrolyt bestaat uit ionen met een hoge mobiliteit, dit elektrolyt heeft
een hogere mobiliteit dan de ionen in het staal en dan het achterste elektrolyt. Het
achterste elektrolyt bevat ionen met een lage mobiliteit. Ionen in het staal worden
ingesloten tussen het voorste en achterste elektrolyt. Gedurende de elektroforetische
scheiding worden de analyten in het staal gerangschikt in afzonderlijke zones
volgens mobiliteit. De zone met de hoogste mobiliteit (het voorste elektrolyt) leidt de
andere zones en legt de snelheid op waarmee ze migreren (Chen et al., 2006).
Isotachoforese wordt minder vaak gebruikt dan capillaire elektroforese. Toch
bezit het enkele voordelen ten opzichte van capillaire elektroforese. Bij
isotachoforese worden verdunde stalen aangeconcentreerd en kunnen componenten
met verschillende concentraties bepaald worden. De detectie gebeurt met een
conductiviteitsdetector. Er is een selectieve isotachoforese methode ontwikkeld voor
magnesium die kan toegepast worden voor de analyse op verschillende soorten
stalen. De methode is zowel geschikt voor de analyse van magnesium in water,
bloed en urine (Prest el al., 2009).
Nog een andere analysemethode maakt gebruik van magnesium selectieve
elektroden. Er zijn maar enkele ion selectieve elektroden gerapporteerd voor
magnesium. De meeste van de ontwikkelde magnesium selectieve elektroden
ondergaan interferentie met calcium en hebben een smal concentratie bereik (Gupta
et al., 2002).
Bij Complexometrische titraties wordt magnesium getitreerd tegenover EDTA
(ethyleendiaminetetra-azijnzuur). Het eindpunt van de titratie wordt bepaald via de
kleurverandering van een indicator (Somashekar et al., 2006). De bepaling van het
eindpunt van de titratie via een kleurindicator zorgt voor variabiliteit en fouten in het
43
resultaat. De gebruikte kleurindicators zijn vaak instabiel en kunnen gemaskeerd
worden door proteïnen en andere metaalionen aanwezig in het staal (Jones &
McGuckin, 1964).
Er zijn ook methoden beschreven voor de analyse van magnesium via
nucleaire magnetische resonantie (NMR). Hierbij wordt het 1H-NMR signaal gemeten
van het magnesium-EDTA-complex. De 1H-NMR spectra zijn zeer rijk aan informatie,
maar de analyse van de data is complex door de overlap van de resonanties van
proteïnen, lipoproteïnen en andere metabolieten aanwezig in serum. Vandaar dat
deze analysemethode enkel wordt toegepast op eenvoudige oplossingen
(Somashekar et al., 2006).
Nog andere analysemethoden maken gebruik van enzymatische bepalingen.
Een voorbeeld van zo’n bepaling is deze die gebaseerd is op de activatie van
isocitraatdehydrogenase. In de aanwezigheid van kaliumisocitraat, magnesium en
NADP+ (nicotineamine adenine dinucleotide fosfaat) wordt isocitraatdehydrogenase
geactiveerd. Er wordt NADPH gevormd dat het licht absorbeert bij een golflengte van
340 nm. De hoeveelheid NADPH gevormd is evenredig met de hoeveelheid
magnesium aanwezig in het staal (Stone et al., 1996).
4.9.3 Detectielimiet Er wordt naar informatie gezocht over de verschillende mogelijkheden voor de
bepaling van de detectielimiet. De zoekopdrachten die hiervoor gebruikt zijn, worden
weergegeven in Tabel 4.9.
De bepaling van de detectielimiet is nog steeds één van de meest
controversiële in de analytische chemie. Dit komt doordat er verschillende definities
en methoden voor de berekening van de detectielimiet bestaan. Hierna worden de
verschillende definities en mogelijkheden voor de bepaling van de detectielimiet
besproken.
44
TABEL 4.9: OVERZICHT VAN DE VERSCHILLENDE ZOEKOPDRACHTEN BIJ DE
LITERATUURSTUDIE OVER DE DETECTIELIMIET.
Gebruikte
zoekmachine
Ingegeven zoekwoorden Aantal
hits
Opmerkingen
PubMed “method validation” AND
“limit of detection”
93 Eerste 50 artikels bekeken.
1 artikel gebruikt.
PubMed “method evaluation” AND
“limit of detection”
6 Levert niet het gewenste
resultaat
Web of
science
“method validation” (topic)
AND “limit of detection”
(topic)
211 Eerste 50 artikels bekeken
2 artikels gebruikt, waarvan
1 hetzelfde als bij Pubmed
Web of
science
“method evaluation”
(topic) AND “limit of
detection” (topic)
15 Levert niet het gewenste
resultaat
Web of
science
method validation (topic)
AND limit of detection
(topic)
2323 Gezocht naar reviewartikels
(10). Hiervan 1 artikel
gebruikt.
Web of
science
“limit of detection” (title) 196 Eerste 50 resultaten
bekeken. 1 artikel gebruikt.
In Tabel 4.10 worden de verschillende definities weergegeven voor de
detectielimiet volgens de IUPAC (http://goldbook.iupac.org/), “International
Conference on Harmonisation” (ICH), “Association Of Analytical Communities”
(AOAC), de USP (Chandran & Singh, 2007) en de ISO (Boqué & Vander Heyden,
2009).
Er zijn verschillende mogelijkheden beschreven om de detectielimiet te
bepalen. De meest gebruikte is deze waarbij rekening wordt gehouden met α- en β-
fouten (Stöckl et al., 2009). De detectielimiet wordt gedefinieerd als k keer de
standaarddeviatie van het blanco staal (SDblanco). De k-waarde wordt bepaald door
rekening te houden met de α- en β-fouten. Wanneer de α- en β-fouten gelijk zijn aan
5% is de k-waarde gelijk aan 3.3. Hierna wordt verder uitgelegd hoe deze waarde
van 3.3 x SDblanco wordt bekomen
45
TABEL 4.10: OVERZICHT VAN DE VERSCHILLENDE DEFINITIES VOOR DE
DETECTIELIMIET.
Organisatie Definitie
IUPAC De detectielimiet, uitgedrukt als concentratie of hoeveelheid, wordt
afgeleid van de laagste meting die met redelijke zekerheid kan
gedetecteerd worden via een gegeven analytische procedure.
ICH Laagste hoeveelheid analyt in een staal dat kan gedetecteerd, maar
niet noodzakelijk gekwantificeerd worden onder de gegeven
experimentele condities.
AOAC Laagste gehalte dat kan gemeten worden met redelijke statistische
zekerheid.
USP Laagste hoeveelheid analyt in een staal dat kan gedetecteerd, maar
niet noodzakelijk gekwantificeerd worden onder de gegeven
experimentele condities.
ISO De concentratie of hoeveelheid van de component in het
geanalyseerde staal die met een probabiliteit van (1-β) tot de
conclusie leidt dat de concentratie van de component in het
geanalyseerde staal groter is dan deze van een blancostaal.
De blancolimiet kan geschat worden door enkel het blancostaal te meten. De
meetwaarden vertonen een normale gaussiaanse verdeling rond nul. De limiet is
gelijk aan de eenzijdige z-waarde van de populatie, die overeen komt met de α- fout
waarbij het analyt wordt gedetecteerd wanneer het niet aanwezig is. Een z-waarde
van 1.645 komt overeen met een α- fout van 5%. De blancolimiet is dus gelijk aan
1.65 x SDblanco bij een α- fout van 5%. De z-waarde kan enkel worden gebruikt
wanneer de standaarddeviatie van de blanco wordt bepaald uit meer dan 20
metingen. Wanneer de standaarddeviatie van de blanco wordt bepaald uit minder
metingen wordt er gebruik gemaakt van de t-waarde die overeen komt met een α-
fout van 5%.
Wanneer blancostalen en laag geconcentreerde stalen worden gemeten is de
blancolimiet te laag. Er bestaat een kans op het maken van β-fouten, waarbij het
analyt niet wordt gedetecteerd wanneer het wel aanwezig is in het staal. In Figuur
4.11 zien we dat voor de blancolimiet populatie de kans op β-fouten 50% is. Deze
46
kans is veel te groot, vandaar moet de limiet worden opgeschoven naar rechts. De
detectielimiet wordt gedefinieerd bij 2 x 1.65 = 3.3 x SDblanco. Bij deze concentratie
zijn zowel de α-fout van het blancostaal als de β-fout van het staal met een
gemiddelde concentratie van 3.3 x SDblanco gelijk aan 5% (Stöckl et al., 2009; Boqué
& Vander Heyden, 2009). Dit wordt ook weergegeven in Figuur 4.11. Bij een
concentratie van 3.3 x SDblanco is het mogelijk om te besluiten dat de concentratie of
hoeveelheid analyt in het onderzochte staal groter is dan in het blancostaal met een
statistische power van 95% (1-β).
FIGUUR 4.11: BEPALING VAN DE DETECTIELIMIET REKENINGHOUDEND MET α- EN β-
FOUTEN (Stöckl et al., 2009).
In een ander artikel (Araujo, 2009) wordt de blancolimiet (in dit artikel
beslissingslimiet genoemd) gedefinieerd als 2 x SDblanco. De beslissingslimiet bij het
95% betrouwbaarheidsinterval van de blancoverdeling is de probabiliteit die aangeeft
of een signaal afkomstig is van het staal of van de blanco. In dit voorbeeld wordt de
2-zijdige z-waarde gebruikt die overeen komt met een α-fout van 5%. Het is beter om
de 1-zijdige z-waarde te gebruiken, omdat de limiet enkel moet bekeken worden aan
de rechterkant van de verdeling. Voor de detectielimiet wordt ook hier aangeraden
om stalen te meten met een concentratie van 3 x SDblanco. De probabiliteit voor het
verkrijgen van een vals negatief resultaat is 16%. Het is mogelijk om een besluit te
trekken met 84% statistische power.
47
De hiervoor vermelde parametrische benadering is enkel geldig wanneer de
meetwaarden gaussiaans verdeeld zijn. Voor klinische bepalingen is de verdeling
van de blancometingen gecentraliseerd rond 0. Veel instrumenten zetten de
negatieve signalen om in 0 of in kleine positieve resultaten. De verdeling voor deze
metingen is dus asymmetrisch en niet gaussiaans. In dit geval wordt de niet-
parametrische benadering gebruikt voor de bepaling van de detectielimiet. De
detectielimiet is de concentratie waarvan het 5de percentiel van de verdeling van de
metingen gelijk is aan de blancolimiet. De blancolimiet is het 95ste percentiel van de
verdeling van de blancometingen. Het 95ste percentiel van de blancometingen wordt
bepaald door het rangschikken van de meetwaarden volgens grootte. Het 95ste
percentiel is de waarde van de nB x (95/100)+0.5 (nB is het aantal blancometingen)
gerangschikte meting. Wanneer dit een niet geheel getal is, wordt de waarde
bepaald door interpolatie via de naburige metingen. Het 5de percentiel van de
metingen van de detectielimietstalen kan op dezelfde manier bepaald worden (Linnet
& Kondratovich, 2004).
Voor chromatografische analysen wordt de detectielimiet vaak bepaald als de
concentratie van de component die een signaal-over-ruisverhouding van 3 geeft. Het
chromatografisch signaal van verschillende standaardoplossingen met een dalende
concentratie wordt gemeten tot dat een piek wordt gevonden waarvan de hoogte 3
keer groter is dan de maximum hoogte van de basislijn (gemeten aan beide kanten
van de piek). De concentratie van de standaardoplossing die overeenkomt met die
piek is gelijk aan de detectielimiet (Boqué & Vander Heyden, 2009).
De detectielimiet kan ook visueel bepaald worden in het chromatogram.
Hiervoor worden verdunningen aangemaakt van een staal met gekende concentratie
van het analyt. De stalen worden verdund tot een concentratie waarbij het analyt niet
langer visueel kan waargenomen worden. Wanneer de detectielimiet visueel wordt
bepaald moeten relevante chromatogrammen bij het validatierapport aanwezig zijn
(Araujo, 2009).
Een andere benadering voor de detectielimiet is gebaseerd op de verhouding
3.3 SD/H, waarbij SD de standaarddeviatie van de respons is en H de helling van de
kalibratiecurve. De standaarddeviatie van de respons kan verkregen worden door het
48
bepalen van de standaarddeviatie van de blanco, door het berekenen van de
residuele standaarddeviatie van de regressiecurve of door het berekenen van de
standaarddeviatie van het snijpunt van de regressiecurve (Chandran & Singh, 2007).
De bepaling van de detectielimiet moet gebeuren door verschillende metingen
van de stalen op verschillende dagen. De intra-analyse variatie voor de detectielimiet
is verwaarloosbaar ten opzichte van de inter-analyse variatie, singlicate metingen per
dag volstaan dus. Aanbevelingen over het aantal dagen dat de stalen gemeten
moeten worden zijn verschillend, ze variëren van 6 tot 60 metingen (Stöckl et al.,
2009).
De verkregen detectielimiet wordt vergeleken met de vooropgestelde
specificatie door gebruik te maken van statistische testen of door het bepalen van het
95% betrouwbaarheidsinterval waarvan de bovengrens wordt vergeleken met de
specificatie. In twee artikels wordt een andere manier gegeven voor het opstellen van
het betrouwbaarheidsinterval. Volgens IUPAC (Currie, 1995) wordt het
betrouwbaarheidsinterval berekend uit de verdeling van de standaarddeviaties.
Volgens Linnet & Kondratovich (2004) wordt het betrouwbaarheidsinterval bepaald
door de onzekerheid van het percentiel.
Bij het bepalen van de detectielimiet moet het gevolgde experimentele
protocol en de gevolgde definitie gerapporteerd worden. In Tabel 4.11 volgt een kort
overzicht van de gebruikte definities in de verschillende domeinen (Stöckl et al.,
2009).
TABEL 4.11: OVERZICHT VAN DE GEBRUIKTE DEFINITIES VOOR DE BEPALING VAN
DE DETECTIELIMIET IN VERSCHILLENDE DOMEINEN.
Domein Definitie
Farma 3.3 x SD / Chromatografisch: S/Ra = 2 of 3
Milieu Stalen met lage conc. (7 metingen), 3.143 x SD (1-zijdige t-waarde)
Voeding Gebaseerd op α- en β- fouten (3 x SD) / Chromatografisch: S/Ra = 3
Medisch labo k x SD, k is afhankelijk van de α- en β- fouten a: signaal-over-ruisverhouding
49
5. CONCLUSIE
Uit de validatie-experimenten die bij deze methodevalidatie uitgevoerd zijn kan
besloten worden dat de methode voldoet aan de specificaties voor de lineariteit,
imprecisie, detectielimiet en de juistheid. Het meest adequate kalibratiemodel voor de
berekening van de concentratie van magnesium uit de piekoppervlakte is de OLR
geforceerd door 0.
Bij de methodevergelijking worden verschillende conclusies getrokken uit de
Bland-Altman grafiek en de lineaire regressie analyse. In de Bland-Altman grafiek
wordt de vooropgestelde specificatie voor de systematische fout overschreden.
Hieruit kunnen we besluiten dat de routinemethode significant verschillend is van de
referentiemethode op het 5% significantieniveau. Uit de lineaire regressie analyse
blijkt dat dit enkel geldig is voor hoge concentraties. Bij de Bland-Altman interpretatie
kan er geen onderscheid gemaakt worden tussen de hoge en lage magnesium
serumconcentraties. Er kunnen dus verkeerde conclusies uit volgen. Als algemeen
besluit voor de methodevergelijking geldt dat de routinemethode niet significant
verschillend is van de referentiemethode op het 5% significantieniveau voor lage
magnesiumconcentraties. Voor hoge serumconcentraties kan de
magnesiumconcentratie via de routinemethode niet met voldoende juistheid bepaald
worden.
Uit het literatuuronderzoek kan besloten worden dat magnesium
farmaceutisch wordt gebruikt als antacidum, laxativum, voor de behandeling van
hypomagnesiëmie, preëclampsie en eclampsie. Naar de andere
toepassingsdomeinen van magnesium wordt nog steeds verder onderzoek gedaan.
De meest frequent gebruikte analysemethoden voor magnesium zijn FAAS, inductief
gekoppeld plasma AES en UV-Vis spectrofotometrie. Er zijn ook nog enkele andere
analysemethoden voor magnesium beschreven. Uit de wetenschappelijke informatie
over de detectielimiet kan besloten worden dat de detectielimiet op verschillende
manieren kan bepaald worden. De meest gebruikte mogelijkheid voor de bepaling
van de detectielimiet is deze waarbij rekening gehouden wordt met de α- en β-
fouten. Bij chromatografische analysen wordt de detectielimiet meestal bepaald bij
een signaal-over-ruisverhouding van 3.
50
6. LITERATUURLIJST
Araujo, P. (2009). Key aspects of analytical method validation and linearity
evaluation. Journal of Chromatography B, 877, 2224-2234. Beckman Coulter ® (2009). Package insert Magnesium OSR 6189 assay. Bohl, C. H.; Volpe, S. L. (2004). Magnesium and exercise. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, 42, 533-563. Boqué, R.; Vander Heyden, Y. (2009). The limit of detection. LC GC Europe, 22, 82-
85. Chandran, S.; Singh R. S. P. (2007). Comparison of various international guidelines
for analytical method validation. Pharmazie, 62, 4-14. Chen, L.; Prest, J. E.; Fielden, P. R.; Goddard, N. J.; Manz, A.; Day, P. J. R. (2006).
Miniaturised isotachophoresis analysis. Lab on a Chip, 6, 474-487. Cundy, T.; Dissanayake, A. (2008). Severe hypomagnesaemia in long-term users of
proton-pump inhibitors. Clinical Endocrinology, 69, 338-341. Currie, L. A. (1995). Nomenclature in evaluation of analytical methods including
detection and quantification capabilities. Pure & Appl. Chem., 67, 1699-1723. de Armas, G.; Cladera, A.; Becerra, E.; Estela, J. M.; Cerdà, V. (2000). Fluorimetric
sequential injection determination of magnesium using 8-hydroxiquinoline-5-sulfonic
acid in a micellar medium. Talanta, 52, 77-82. Fawcett, W. J.; Haxby, E. J.; Male, D. A. (1999). Magnesium: physiology and
pharmacology. British Journal of Anaesthesia, 83, 302-320. Guerrera, M. P.; Volpe, S. L.; Mao, J. J. (2009). Therapeutic uses of magnesium.
American Family Physician, 80, 157-162. Gupta, V. K.; Chandra, S.; Mangla, R. (2002). Magnesium-selective electrodes.
Sensors and Actuators B, 86, 235-241. Jones, J. D.; McGuckin, W. F. (1964). Complexometric titration of calcium and
magnesium by a semiautomated procedure. Clinical Chemistry, 10, 767-780.
51
Linnet, K.; Kondratovich, M. (2004). Partly nonparametric approach for determining
the limit of detection. Clinical Chemistry, 50, 732-740. López-García, I.; Viñas, P.; Blanco, C.; Hernández-Córdoba, M. (1999). Fast
determination of calcium, magnesium and zinc in honey using continuous flow flame
Veuthey, J. (2010). Determination of potassium, sodium, calcium and magnesium in
total parenteral nutrition formulations by capillary electrophoresis with contactless
conductivity detection. J. Pharm.Biomed.Anal, published ahead-of-print as
doi:10.1016/j.jpba.2010.01.042. Pantsar-Kallio, M.; Manninen, P. K. G. (1995). Determination of sodium, potassium,
calcium and magnesium cations by capillary electrophoresis compared with ion
chromatography. Analytica Chimica Acta, 314, 67-75. Prest, J. E.; Baldock, S. J.; Fielden, P. R.; Goddard, N. J.; Treves Brown, B. J.
(2009). A miniaturised isotachophoresis method for magnesium determination. Anal.
Bioanal. Chem., 394, 1299-1305. Somashekar, B. S.; Ijare, O. B.; Nagana Gowda, G. A.; Ramesh, V.; Gupta, S.
Khetrapal, C. L. (2006). Simple pulse-acquire NMR methods for the quantitative
analysis of calcium, magnesium and sodium in human serum. Spectrochimica Acta
Part A, 65, 254-260. Stöckl, D. (2007a). Laboratory Statistics & Graphics with EXCEL®. STT consulting,
Horebeke, België, 141p. Stöckl, D. (2007b). Method validation With Confidence. STT consulting, Horebeke,
België, 52 p. Stöckl, D.; D’Hondt, H.; Thienpont, L. M. (2009). Method validation across the
disciplines - Critical investigation of major validation criteria and associated
experimental protocols. Journal of Chromatography B, 877, 2180-2190.
52
Stone, M. J.; Chowdrey, P. E.; Miall, P.; Price, C. P. (1996). Validation of an
enzymatic total magnesium determination based on activation of modified isocitrate
dehydrogenase. Clinical Chemistry, 42, 1474-1477. Swain, R.; Kaplan-Machlis, B. (1999). Magnesium for the next millennium. Southern
Medical Journal, 92, 1040-1047. Tesfaldet, Z. O.; van Staden, J. F.; Stefan, R. I. (2004). Spectrophotometric
determination of magnesium in pharmaceutical preparations by cost-effective
sequential injection analysis. Talanta, 64, 981-988. The Merck Index, an encyclopedia of chemicals, drugs and biologicals, 13e editie
(2001). Merck Research Laboratories, Whithouse Station, NJ, Verenigde Staten.
United States Pharmacopeia (USP). Volume 32, NF 27 (2009). Yang, Z.; Hou, X.; Jones, B. T.; Sane, D. C.; Thomas, M. J.; Schwenke, D. C. (2002).
Determination of calcium, iron and magnesium in rabbit arteries by inductively
coupled plasma atomic emission spectrometry. Microchemical Journal, 72, 49-54. Zaman, F.; Abreo, K. (2003). Severe hypermagnesemia as a result of laxative use in
renal insufficiency. Southern Medical Journal, 96, 102-103. http://goldbook.iupac.org/ (26-4-2010) en (3-5-2010) http://www.baxter.com/downloads/patients_and_caregivers/products/dianeal_ultrapd