République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université d’Oran Es-senia Faculté des Sciences Département de Biologie Laboratoire de Microbiologie appliquée Mémoire en vue de l’obtention du diplôme de magister en Microbiologie fondamentale et appliquée Thème Ecologie et aptitude technologique des bactéries lactiques isolées du beurre traditionnel Présenté par M elle Adjoudj Fatma Membre du jury Président Professeur Sahraoui T. Examinateur Professeur Henni J.E. Examinateur Professeur Kihal M. Examinateur Dr Hadadji M. MCA Rapporteur Dr Guessas B. MCA Année universitaire 2010
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magister beuure 24 11 2010 - theses.univ-oran1.dztheses.univ-oran1.dz/document/TH3252.pdf · Tableau 17: Classification de Bergey’s 1986 des bactéries lactiques Tableau 18 : L’origine
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République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la
Recherche Scientifique
Université d’Oran Es-senia
Faculté des Sciences
Département de Biologie
Laboratoire de Microbiologie appliquée
Mémoire en vue de l’obtention du diplôme de magister en
Microbiologie fondamentale et appliquée
Thème
Ecologie et aptitude technologique des bactéries
lactiques isolées du beurre traditionnel
Présenté par
Melle Adjoudj Fatma
Membre du jury
Président Professeur Sahraoui T.
Examinateur Professeur Henni J.E.
Examinateur Professeur Kihal M.
Examinateur Dr Hadadji M. MCA
Rapporteur Dr Guessas B. MCA
Année universitaire 2010
Dédicace
« Louange à Dieu de nous avoir éclairé sur le droit chemin de nous avoir accordé la
connaissance de la science »
Je dédie ce modeste travail
A mes très chers, respectables et honorables parents qui m’ont inculqué le sérieux
Mes frères : Missoum – Bilal – Nouh – M’hamed
Mes sœurs et leurs maris sans oublier Wafaa et mes neveux Aresslane et wassim
Melle MATTALAH Maghnia et sa famille, salma bente Moulay lahcéne
Etudiants de ma promotion de Magister : Mourad, Zineddine, Halima, Kenza et Wafaa
pour leurs aides.
Etudiants de Magister, Option : Phytopathologie : Abdessalam, Younes, Amina,
Wassim, Fouzia et Mohamed.
A tous mes amis(es) et mes intimes avec qui j’ai partagé d’agréables moments.
« Notre ennemi dans l’étude, c’est la suffisance ; quiconque veut
réellement apprendre droit commencer par s’en débarrasser ;
s’instruire sans jamais s’estimer satisfait et enseigner sans
jamais se lasser »telle doit être notre attitude.
Remerciements
Je rends grâce au dieu tout puissant qui par sa volonté guide mes pas vers les portes de la réussite et
m’a permis de réaliser ce modeste travail.
Ce modeste travail qui a fait l’objet de ce mémoire a été réalisé au laboratoire de Microbiologie
fondamentale et appliqué, Département de Biologie, Faculté des Sciences, Université d’Oran, Es-
sénia ; sous la direction de Monsieur B.GUESSAS, à qui j’exprime mes sincères remerciements pour
ses connaissances, sa compétence, sa rigueur scientifique et ses conseils. Qu’il trouve ici mes sincères
remerciements et mon entière reconnaissance. Aussi je tiens à exprimer ma profonde gratitude ainsi
que mes plus vifs remerciements à Monsieur kihal, Professeur et responsable du laboratoire.
J’exprime mes respectueux remerciements à :
Professeur Sahraoui .T ; qui nous a fait un grand honneur en acceptant de présider le jury.
Professeur KIHAL.M ; d’avoir honoré notre sollicitation et d’avoir accepté d’examiner ce travail et
pour son attention et son aide. qu’il veuille bien accepter l’expression de mon profond respect.
Professeur Henni J.E ; pour m’avoir fait l’honneur d’examiner ce travail. Qu’il veuille bien accepter
l’expression de mon profond respect.
Docteur Hadadji .M ; pour m’avoir fait l’honneur d’examiner ce travail. Qu’il veuille bien accepter
l’expression de mon profond respect.
Je tiens à remercier profondément Monsieur Zoulai. S, qui m’a encouragée et soutenue dans les
moments difficiles.
Mes remerciements les plus chaleureux vont directement à Tahar et Zoubida pour leur aide précieuse.
Cependant, je n’aurais pu réussir mes études sans ma famille et je tiens ici à remercier mes parents qui
depuis mon plus jeune âge ont toujours fait leur maximum, en consacrant temps et argent, pour
m’éveiller et m’encourager dans mes passions. Sans eux je n’aurais jamais pu arriver jusque-là et ils
m’ont permis de réaliser ce rêve qui me tenait tant à cœur. Tous les remerciements du monde ne seront
jamais à la hauteur de leurs sacrifices.
Finalement, je voudrai terminer cette liste qui ne se veut en aucun cas exhaustive, par tous mes
collègues et amis(es). Ils sont nombreux et je risque d’en oublier.
Bien heureusement, la période la plus difficile est maintenant passée et que tous ceux qui m’ont permis
de la surmonter soient ici remerciés.
A toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin pour la réalisation de ce travail.
1.1. Le lait de vache ...................................................................................................................................... 11
1.2.2. Crèmes de consommation............................................................................................................. 38
1.2.3. Crèmes de transformation et crèmes de beurrerie ...................................................................... 39
1.2.4. Méthode du Nizo (Pays-Bas) ......................................................................................................... 41
1.3. Fabrication du beurre............................................................................................................................ 41
1.3.3. Méthode continue au butyrateur.................................................................................................. 44
1.3.4. Salage du beurre............................................................................................................................ 44
1.3.5. Composition du beurre.................................................................................................................. 44
1.4. Procédés de fabrication.............................................................................................................................. 45
1.4.1. La conservation du beurre traditionnel............................................................................................... 45
1.4.2. Altération des composés lipidiques :................................................................................................... 46
1.5. Les microorganismes d’altération et la flore indigène du beurre ......................................................... 47
1.5.1. Bactéries aérobies mésophiles à 30° C............................................................................................... 47
1.6 Les bactéries lactiques................................................................................................................................. 49
1.7. Principales caractéristiques des bactéries lactiques .................................................................................. 51
1.8. Les différents genres des bactéries lactiques :........................................................................................... 52
1.9. La classification des bactéries lactiques : ................................................................................................... 53
1.9.1. La classification classique .................................................................................................................... 53
1.9.2. La Classification moderne.................................................................................................................... 54
2. Matériels et méthodes ..................................................................................................................................... 55
2.1. Provenance des échantillons de beurre ..................................................................................................... 55
2.2. Préparation des échantillons...................................................................................................................... 55
2.3. Identification des bactéries lactiques......................................................................................................... 56
2.3.1. Purification et conservation des souches............................................................................................ 56
2.3.2. Identification des bactéries lactiques selon le genre .......................................................................... 56
2.3.3. Identification des bactéries lactiques selon l’espèce .......................................................................... 57
Cependant, elle résiste bien à la chaleur et la stérilisation classique du lait provoque une perte
ne dépassant pas même 10 pour cent de l'activité initiale.
La vitamine PP (vitamine antipellagreuse ou niacine) ne se trouve qu'en faibles quantités dans le lait de
vache et entièrement à l'état libre. Par contre, on y trouve en abondance du tryptophane, un précurseur
de la niacine. Cette vitamine est stable à l'air et à la lumière et peu sensible à la chaleur.
Le lait de vache est riche en acide pantothénique. Cette vitamine s'y trouve presque totalement à l'état
libre et est un facteur de croissance pour divers micro-organismes, dont les lactobacilles. Elle est stable
à l'air et à la lumière mais, par contre, très sensible à la chaleur et aux modifications du pH.
La teneur en vitamine B6 est de cinq à dix fois plus élevée dans le lait bovin que dans le lait humain;
elle s'y trouve essentiellement à l'état libre. La pasteurisation et la stérilisation UHT du lait la laissent
intacte, mais la stérilisation classique en détruit 50 pour cent. Une carence prolongée peut être la cause
de convulsions chez le nourrisson.
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L'acide tolique se trouve dans le lait de vache à des concentrations fort variables (allant de 1 à 25 ) et
est lié aux protéines. Facteur de croissance pour divers micro-organismes, il est sensible à la lumière et
à l'oxygène, mais stable à la chaleur et à des pH supérieurs à 4.
La biotine se trouve totalement à l'état libre, mais en faibles quantités dans le lait. Elle est stable à la
chaleur et à la lumière, mais sensible à l'air.
Le lait contient peu de vitamine B12, (cyanocobalamine), mais son activité est considérable. Elle est liée
au lactosérum (95 pour cent) et est stable à l'air, mais sensible à la lumière et au chauffage, surtout
lorsqu'il n'est pas effectué à l'abri de l'air. La pasteurisation HTST n'en détruit que 10 pour cent, mais la
stérilisation classique 90 pour cent.
En comparaison des fruits ou légumes qui en fournissent jusqu'à 100 fois plus, le lait ne représente pas
une bonne source de vitamine C. Celle-ci existe sous forme libre uniquement; elle est très fragile et
sensible à l'air, à la lumière et au chauffage (perte de 50 pour cent au cours de la stérilisation classique,
de 10 pour cent seulement au cours de la pasteurisation). Le stockage et l'agitation du lait en tanks
réfrigérés (2 à 4 °C) pendant 36 heures détruit plus de la moitié et jusqu'aux trois quarts de l'acide
ascorbique.
Vitamines liposolubles. Les taux de vitamines A, D, E et K du lait dépendent de nombreux facteurs.
Comme ces vitamines sont dissoutes dans la matière grasse, elles passent lors de l'écrémage dans la
crème et le beurre. Le lait contient beaucoup de vitamine A (et de précurseurs caroténoïdes: 30 pour
cent de l'activité vitaminique A totale) lorsque la nourriture des animaux est riche en herbes fraîches
(fourrage vert) et en carotène. De ce fait, il contient, en été, d’une fois et demie à deux fois plus de
carotène et de rétinol qu'en hiver. Le carotène est le colorant de la matière grasse du lait. Certaines
races convertissent moins le carotène et l'absorbent intact avant de l'éliminer en partie dans le lait, lui
donnant une couleur caractéristique.
Le lait de vache ne contient de la vitamine D (vitamine D3 ou cholécalciférol, essentiellement en tant
que sulfate) qu'en faibles quantités (de 1 à 50 ng/litre). La vitamine D existerait aussi sous forme
hydrosoluble à des concentrations parfois importantes (de 3 à 4 µg/litre), mais seulement en relation
étroite avec les protéines solubles, et ceci avant de gagner la membrane des globules gras. La teneur
lactée varie en fonction du temps d'exposition de l'animal à la lumière solaire et aussi de l'alimentation
consommée, en d'autres termes selon les régions et les saisons.
Le lait est parfois artificiellement enrichi en vitamine D et les procédés de stérilisation par ultraviolet
empêchent un contrôle précis de l'enrichissement. En cas de surdosage, le lait prend une saveur oxydée.
Revue bibliographique
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La vitamine E (de 2 à 5 mg par 100 g de matières grasses) est un antioxydant qui protège les lipides des
altérations oxydatives. Plus de 95 pour cent de la vitamine E est de l'a-tocophérol, le composé
biologique le plus actif, le reste étant composé de gamma-tocophérol uniquement.
La vitamine K (synthétisée dans le rumen) se trouve toujours dans le lait en quantités faibles, mais
suffisantes pour l'homme (de 0,1 à 0,5 mg par 100 g de lipides).
1.1.9. Enzymes
Une soixantaine d'enzymes ont été répertoriées dans le lait, mais leur rôle n'est pas toujours
clairement établi. Certaines de ces enzymes n'existent d'ailleurs pas (ou à peine) dans le lait humain,
comme la lactoperoxydase, la xanthine oxydase ou la ribonucléase.
Certaines sont des facteurs de dégradation (utiles ou nuisibles), comme les protéases qui facilitent
l'hydrolyse de la caséine et les lipases, facteurs de rancissement. D'autres possèdent une activité
bactéricide ou bactériostatique. La lactoperoxydase, 1 'enzyme la plus abondante du lait de vache, agit
contre les bactéries en présence de H2O2 et de thiocyanate (SCN-) lorsque ces substances sont
présentes en concentrations suffisantes. Ce système protège aussi les muqueuses de l'animal contre les
radicaux libres' Les taux de thiocyanate du lait de vache semblent sans danger pour la fonction
thyroïdienne.
La xanthine oxydase contribue comme la lactoperoxydase, au rancissement du lait. Enfin, la quantité de
certaines enzymes du lait (catalane) constitue un indicateur de son niveau d'hygiène. Ce taux, qui
dépend du nombre de bactéries (contamination), est élevé dans le colostrum et augmente en cas de
mammite.
1.1.10. Hormones
Le lait de vache contient des hormones dont l'activité biologique est connue, mais dont le rôle
est beaucoup moins certain. Il semble que la plupart de ces hormones soient détruites dans le tube
digestif, du moins chez l'homme.
Les taux des oestrogènes (de 60 à 200 ng/litre) et de la prolactine (environ 50 µg/litre) diminuent au fur
et à mesure que la lactation progresse. La progestérone (environ 13 µg/litre) existe en proportion
directe avec le taux de lipides; elle est pratiquement absente du lait écrémé (< 2 µg/litre) et lorsqu'on l'y
trouve en quantité supérieure à 6 µg/litre, une nouvelle gestation doit être suspectée. On trouve
également des corticostéroïdes dans le lait (de 8 à 18 µg/litre) et diverses prostaglandines, ainsi que de
la somatotropine, des gonadotropines, de la thyrotropine et des polyamines (Sanguansermsri, Gyorgi et
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Zilliken, 1974). L'activité biologique sur l'homme des hormones naturelles du lait de vache est
considérée comme nulle. Certaines hormones de synthèse, administrées à l'animal pour augmenter la
production lactée' se retrouvent dans les laits. Cette pratique est donc à proscrire et souvent interdite.
1.1.11. Acides organiques
De nombreux acides organiques ont été détectés dans le lait. Les principaux sont cités ci-après.
Acide citrique. Sa concentration est en moyenne de 1,7 g/litre. Cet acide représente à lui seul plus de
90 pour cent des acides organiques du lait. Il se trouve en solution, moins de 10 pour cent étant associé
à la caséine et au calcium dans la phase colloïdale. Son rôle est de réduire l'excrétion urinaire du
calcium ionisé du plasma sanguin et d'éviter ainsi une déminéralisation de l'os. L'acide citrique est dans
les produits laitiers fermentés le point de départ de substances aromatisantes.
Acide neuraminique. Cet acide se trouve dans le lait à un taux moyen de 150 mg/litre et sous forme
acétylée (acide N-acétyl-neuraminique ou acide sialique). Il est pour 80 pour cent environ lié à la
caséine (kappa), dont il assure une part de la stabilité.
Acides nucléiques. Les acides ribonucléiques (50 mg/litre), désoxyribonucléiques (12 mg/litre) et les
nucléotides (dont 80 pour cent d'acide orotique: 1 00 mg/litre) sont présents dans le lactosérum; ils sont
également associés, en faibles quantités, à la caséine. Un avantage de ces quantités modestes est que la
formation d'acide urique au cours du catabolisme alimentaire est très faible, à l'opposé de ce qui se
produit après consommation de viande.
L'acide orotique s'est vu attribuer des rôles multiples, dont un effet favorable sur la croissance du
Lactobifidus bulgaricus.
1.1.12. Substances indésirables
La mamelle est un émonctoire et le lait peut contenir des substances ingérées ou inhalées par
l'animal, sous la forme soit du constituant original, soit de composés dérivés métabolisés. Les
substances étrangères peuvent provenir des aliments (engrais et produits phytosanitaires), de
l'environnement (pesticides), de traitements prescrits à l'animal (produits pharmaceutiques,
antibiotiques, hormones) (Mahieu et a/., 1977).
Ces contaminations posent des problèmes particuliers, parce qu'il est souvent difficile d'en apprécier les
conséquences à long terme sur la santé (Mueller et Schroeder, 1978). Les mesures de prévention restent
la pratique la plus logique et la plus efficace, que l'anxiété des médecins ou du public soit justifiée ou
non.
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Pesticides. Ces produits sont destinés à détruire les insectes qui attaquent le bétail, les cultures et les
récoltes. Tous présentent un degré de toxicité pour l'homme; seulement se retrouvent dans le lait quand
la vache les a consommés.
Les phosphates (très toxiques) sont ainsi très rapidement métabolisés, les organophosphorés sont très
peu rémanents et les organochlorés (stables et lipophiles) sont éliminés à concurrence de 30 à 40 pour
cent dans le lait. Même le chauffage du lait ne les détruit pas (DDT et son métabolite essentiel, le DDE)
(Renterghem, 1976; Renterghem, Moennans et Brack, 1 979).
Antibiotiques. Leur usage chez l'animal en fait des constituants sporadiques du lait, et donc une source
de sélection de souches résistantes et d'accidents allergiques pour le consommateur.
Eléments radioactifs. Suite à l'incendie d'une usine nucléaire en avril 1986 à Tchernobyl (Ukraine),
l'environnement a été contaminé. Des nuages de radioactivité ont sillonné l'Europe dans les 2 à 3 jours
suivant l'accident (Bruce et Slorach, 1987). En apparence, l'Autriche a été parmi les pays les plus
touchés par les retombées. Le taux d'iode 131 a été élevé pendant 2 à 3 semaines dans le lait de vache.
Cette radioactivité s'est estompée au rythme de la demi-vie brève de cet élément.
Les taux de césium radioactif ont augmenté plus lentement pour culminer 2 mois environ après la
contamination. Quatre mois plus tard, ces taux étaient encore nettement plus élevés que ceux mesurés
en routine, préalablement à la destruction de l'usine nucléaire. Au cours de l'hiver, la consommation de
fourrage (foin ramassé en juin) s'est accompagnée d'une remontée passagère mais notable de la
radioactivité du lait.
Une réglementation stricte (tableau 15) et une surveillance des laits de consommation ont suffi à
maîtriser le problème. Le lait contaminé (voir normes européennes) a été déclaré impropre à la
consommation et retiré des circuits de distribution. En outre, un contrôle a été exercé sur les laits
importés, notamment sur ceux utilisés pour la fabrication des laits en poudre destinés aux nourrissons.
Tableau 15: Niveau de contamination radioactive pour un ensemble de radionucléides: seuils à ne pas
dépasser pour le lait et les aliments pour nourrissons (Valeurs proposées par la FAO/OMS et adoptées
par la commission du Codex Alimentarius (juillet 1989) et/ou par le règlement Euratom)
Radionucléides Seuils
Am 241 Pu 239 1 Bq/kg
1131 Ae 90 100 Bq/kg
Os 134 Cs 137 1 000 Bq/kg
Note: En cas d'accident nucléaire le règlement Euratom exige de ne plus dépasser 400 Bg/kg pour le césium
(134 et 137).
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Nitrates et nitrosamines. La fabrication de certains produits laitiers s'accompagne d'une addition de
nitrate de potassium ou de sodium dans le lait à cailler. Ceux-ci s'accumulent surtout dans le
lactosérum. De fait, on peut trouver dans les produits secs, des nitrates en concentrations très élevées.
Les nitrates peuvent former des liaisons avec divers composants du lait. Les nitrites qui découlent de la
conversion des nitrates peuvent former des nitrosamines, dont certaines sont cancérigènes.
Métaux. A leur propos, il convient de distinguer entre la découverte d'un antagoniste naturellement
présent dans le lait et une contamination par cette même substance en quantités inutiles, voire
dangereuses. Par exemple, on accepte dans les crustacés un taux d'arsenic de 50 ppm, mais on
s'inquiète d'en trouver plus de 0,05 ppm dans du lait.
Parmi les métaux susceptibles de contaminer le lait à des taux inquiétants pour la santé, on peut citer le
sélénium, l'arsenic, le plomb, le mercure et le cadmium.
Polychlorodrphényles. Certains produits chimiques, comme les phtalates, les esters de l'acide
sébacique et certains polychlorobiphényles (PCB), présentent un degré certain de toxicité pour
l'homme, d'autant plus que ces substances sont stables dans l'organisme où elles s'accumulent dans le
tissu adipeux ( Murata, Zabik et Zabik, 1977; Luquet et al., 1979).
1.1.13. Variations dans la composition
La quantité de lait produit par un animal et sa composition subissent des fluctuations d'origine
physiologique (nombre de vêlages, époque de lactation, état de santé, activité de l'animal) et des
variations d'origine génétique (espèce, race), zootechnique (mode, moment de la traite), alimentaire
(foin, fourrage) et, enfin, climatique.
Les modifications de composition non directement ou indirectement imputables à l'animal, comme les
conditions de conservation ou les contaminations postérieures à la traite, sont la conséquence
d'altérations du lait.
Sa nature biologique, la complexité de sa structure physique et la grande diversité de ses constituants
chimiques en font un produit fragile, très facilement altérable. Les dégradations peuvent être dues à des
facteurs intrinsèques du lait (leucocytes, enzymes, micro-organismes) ou à des agents extrinsèques
(oxygène de l'air, lumière, poussières, contaminants chimiques et, surtout, micro-organismes). Les
modifications contrôlées ou non de composition physico-chimique qui en découlent se répercutent
directement en technologie laitière (voir chapitres suivants).
Fluctuations physiologiques intra-individuelles. Peu avant le vêlage et pendant les 6 à 9 jours
suivants, la mamelle produit le colostrum (liquide jaunâtre, visqueux et amer), riche en protéines et en
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minéraux, mais pauvre en lactose. Il apporte aux jeunes veaux des anticorps indispensables et des
éléments purgatifs. Après cette période colostrale, la quantité de lait augmente progressivement
(pendant environ 1 mois), se stabilise pendant 2 à 3 mois pour diminuer ensuite jusqu'au tarissement 6
mois plus tard.
La concentration en matière sèche diminue pendant le mois qui suit le vêlage, puis augmente
régulièrement en raison de l'accroissement des matières azotée et grasse. L'écart entre la teneur
minimale ( 1 mois) et la teneur maximale (10 mois) en lipides ou en protéines peut atteindre facilement
de 5 à 1 O g/litre, voire davantage. La courbe de concentration en lactose varie au cours de la lactation;
celle-ci après une augmentation rapide au cours du premier mois, reste ensuite constante.
Vers la fin de la lactation, lorsque la teneur azotée s'élève rapidement, un déséquilibre s'installe entre
les composants du lait (avec augmentation concomitante en chlorure de sodium) et le rend, comme le
colostrum, impropre aux fabrications. On observe également une évolution individuelle normale du
début à la fin de la traite (augmentation régulière de la teneur en matière grasse et baisse de la teneur en
protéines). Si le lait n'est pas évacué, les molécules de synthèse (lactose, caséine et graisse) subissent
une résorption et le lait obtenu (dit de <<rétention») est de composition anormale.
Variabilité interindividuelle. L'influence propre de chacun des paramètres de variabilité est difficile à
identifier. Ce sont les facteurs raciaux, liés aux effets de la sélection, et les facteurs alimentaires qui ont
les conséquences les plus importantes sur le lait au plan nutritionnel, technologique et économique.
Ainsi, les laits des vaches frisonnes sont moins riches en matières grasses et en protéines que ceux des
vaches anglo-normandes. Les Jersiaises fournissent un lait riche qui rappelle celui des vaches zébus de
l'Inde.
De même, la vache au pâturage produit plus d'acides longs (stéarique et oléique) et moins de chaînes
moyennes (laurique, myristique et palmitique), tandis que la vache en étable produit plus d'acides gras
polyinsaturés, surtout parce que son alimentation en contient.
Variabilité spatio-temporelle. En raison de l'importance de certaines variations saisonnières
notamment, tous les laits n'ont pas la même aptitude à être transformés en fromage ou en beurre.
Dans les pays tempérés, la collecte quantitative du lait peut présenter entre l'hiver et l'été des écarts de 1
à 1,5, alors que, dans d'autres pays, ces écarts peuvent varier de 1 à 8 ou 10. Dans les pays tropicaux, il
est courant de voir une production abondante en saison humide totalement arrêtée en saison sèche.
Les courbes de production et de composition du lait peuvent varier dans leurs niveaux (minima,
maxima) et leurs pentes. Les fluctuations sont plus importantes pour des laits individuels et s'estompent
à mesure que le lait est de plus grand mélange.
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D'une façon générale, il est toujours économiquement préférable de réduire le plus possible les
variations de composition qualitatives et quantitatives, ce qui justifie un ensemble de pratiques
(régularisation des vêlages et de l'alimentation, sélection des races, mélange des laits et incitations
économiques).
1.2. Matière grassePendant longtemps, l'utilisation de la matière grasse butyrique est restée limitée à la fabrication
de la crème, du beurre et de quelques produits dérivés. Vers le milieu du XXe siècle, sous l'évolution
des besoins, des techniques et des réglementations, de nouveaux produits sont apparus: huile de beurre,
beurre allégé, spécialités à tartiner additionnées ou non de matière grasse d'origine non laitière, etc.
1.2.1. Écrémage
Quelle que soit l'utilisation de la matière grasse, celle-ci est d'abord séparée du lait au cours de
l'opération d'écrémage qui donne deux produits: le lait écrémé et la crème. La crème constitue
simplement du lait concentré en matière grasse à environ 1 O fois (lait entier: 35 g/kg; crème: 350
g/kg). Son état physique n'est pas modifié de même que la composition du liquide (lait écrémé) dans
lequel sont dispersés les globules gras. La concentration en matière grasse est obtenue par écrémage
spontané ou centrifuge.
L'écrémage repose sur la différence de masse volumique entre les globules gras (0,93) et la phase
aqueuse ou lait écrémé (1,036). L'écrémage spontané est encore utilisé par les éleveurs ou dans les
petites fromageries artisanales. Il consiste à abandonner le lait dans un récipient large, en couche mince
(de 10 à 15 cm) à une température de 8 à 14 °C. Après un repos de 12 à 24 heures, la crème montée en
surface est ramassée à l'aide d'une louche plate. Ce mode d'écrémage est imparfait; dans les meilleures
conditions la quantité de matière grasse rassemblée dans la crème ne dépasse pas 80 à 85 pour cent de
la matière grasse du lait.
L'écrémage centrifuge est réalisé dans une écrémeuse. L'opération est rapide, continue et assure le
passage dans la crème de la quasi-totalité de la matière grasse. L'écrémeuse comprend un récipient
appelé bol, généralement de forme cylindro-conique, tournant à grande vitesse. Le lait entier, porté à la
température de 30 à 40 °C, est introduit à la base au centre du bol rotatif. Sous l'action de la force
centrifuge, les globules gras se dirigent vers l'axe de rotation et sont entraînés avec une petite quantité
de lait vers la sortie de crème; le lait séparé des globules gras, plus lourd, se dirige vers la périphérie du
bol d'où il est entraîné vers la sortie du lait écrémé. L'écrémage est facilité par la répartition du lait en
couches minces à l'intérieur du bol grâce à la présence d'un empilement de plateaux ou assiettes
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tronconiques solidaires de l'axe de rotation. La teneur en matière grasse de la crème est réglée en
laissant dans celle-ci une quantité de lait écrémé plus ou moins importante. L'écrémage centrifuge
provoque une épuration du lait en entraînant les impuretés lourdes sur les parois du bol où elles forment
les «boues» d'écrémeuse. Il existe plusieurs modèles d'écrémeuse. Les machines modernes permettent
un écrémage très poussé (matière grasse du lait écrémé <0,5 g/kg), limitent les chocs endommageant
les globules gras et évitent la formation de mousses.
On distingue généralement deux catégories de crème:
crème de consommation, utilisée directement, notamment en cuisine, en pâtisserie, dans la
préparation des crèmes glacées, etc.;
crème de transformation, destinée à la fabrication du beurre et autres produits.
1.2.2. Crèmes de consommation
Il en existe plusieurs formes, variant selon leur teneur en matière grasse, le traitement subi, le mode de
conservation et la réglementation propre à chaque pays. On peut cependant distinguer:
la crème légère ou crème allégée: contenant entre 10 et 20 pour cent de matière grasse: elle est
notamment utilisée avec le café, le thé, les fruits en compotes, etc.;
la crème (normale), contenant au moins 30 pour cent de matière grasse: elle est surtout utilisée
dans les préparations culinaires et les pâtisseries. Elle peut être fluide ou épaisse, douce ou
maturée. L'épaississement augmente avec la teneur en matière grasse et avec l'acidification. La
maturation due au développement de bactéries lactiques acidifiantes et aromatisants fait baisser
le pH et, à partir de 5,2, provoque la floculation de la caséine. L'acidité d'une crème douce,
exprimée en acide lactique pour 1 000 de sa partie non grasse est de l'ordre de 1,5 (15 °Dornic)
alors que celle d'une crème maturée est voisine de 8 à 10 (80 à 100 °Dornic);
les crèmes fouettées: ce sont des crèmes foisonnées par incorporation d'air. Le taux de
foisonnement, c'est-à-dire le rapport entre le volume de la crème fouettée et le volume initial ne
doit généralement pas dépasser 3,5. Seules les crèmes non maturées conviennent au
foisonnement. La crème Chantilly est une crème fouettée sucrée avec au moins 15 pour cent de
saccharose;
les crèmes sous pression: elles sont conditionnées dans des récipients métalliques étanches avec
du protoxyde d'azote qui assure leur foisonnement. Les crèmes fouettées ou sous pression
Revue bibliographique
39
peuvent être légères ou contenir plus de 30 pour cent de matière grasse. Leur conservation est
assurée par pasteurisation, stérilisation ou congélation.
Le problème de la qualité microbiologique des crèmes se pose comme pour le lait de consommation. Il
convient de mettre en œuvre des laits frais et peu pollués et de procéder aux opérations de production
de la crème dans d'excellentes conditions d'hygiène. Certains pays ont rendu obligatoire
l'assainissement des crèmes par la pasteurisation, qui doit être immédiatement suivie de la réfrigération
du produit. On peut aussi stériliser la crème douce par un procédé classique ou par UHT.
1.2.3. Crèmes de transformation et crèmes de beurrerie
Les crèmes destinées à la transformation, notamment à la fabrication du beurre, subissent divers
traitements de préparation (cités ci-après). Certains sont facultatifs, mais tous sont destinés à améliorer
les conditions technologiques et économiques et la qualité des produits fabriqués.
Normalisation Elle consiste à régler le taux de matière grasse de la crème selon sa destination. Pour la
fabrication traditionnelle du beurre, ce taux est de 35 à 40 pour cent; pour la fabrication continue, il est
de 40 à 50 pour cent.
Désacidification. Une crème acide est visqueuse; elle coagule au cours de la pasteurisation provoquant
le «gratinage» de l'appareil et un goût de cuit dans le beurre. Les crèmes fermières collectées par la
laiterie ayant souvent fermenté de façon anarchique sont de mauvaise qualité microbiologique et
doivent être pasteurisées. Il est alors nécessaire, avant pasteurisation, de ramener l'acidité dans le non-
gras entre 15 et 20°Dornic. On utilise généralement la soude caustique.
Pasteurisation. Ce traitement tend à se généraliser. Il a pour but la destruction des germes pathogènes et
de la plus grande partie de la flore banale susceptible de gêner la maturation de la crème par les
bactéries lactiques sélectionnées et de nuire à la qualité du beurre; il permet aussi l'inhibition des
lipases (facteurs de rancissement) et la formation de produits sulfurés réducteurs (facteurs
antioxydants). Il faut mettre en œuvre des températures de 92 à 95 °C pendant 20 à 30 secondes. La
pasteurisation est souvent accompagnée d'un dégazage qui permet d'éliminer les saveurs et odeurs dues
à des substances volatiles d'origine alimentaire (choux, ail, etc.), fermentaires ou autres. Cette opération
se fait par évaporation à chaud sous vide ou à l'air libre en même temps que la réfrigération.
Réfrigération. La crème sortant du pasteurisateur doit être immédiatement refroidie afin d'éviter le
développement des germes thermorésistants et l'apparition de défauts de goûts et de mettre celle-ci
dans les conditions les plus favorables à sa maturation physique et à sa maturation biologique.
Revue bibliographique
40
Maturation. Elle a pour but de faire prendre à la crème des caractères physicochimiques permettant un
barattage facile, avec le minimum de pertes en matière grasse et l'obtention d'un beurre de bonne
qualité organoleptique concernant notamment sa consistance et sa flaveur.
Maturation physique. Les propriétés de la matière grasse butyrique et, par suite, celles du beurre
(notamment sa consistance) dépendent à la fois de la composition des glycérides et des conditions
thermiques. La maturation physique a pour but d'amener la matière grasse, compte tenu de sa
composition et de l'état de fusion et de solidification de ses constituants, dans un état de cristallisation
partielle permettant de conférer au bourre la consistance voulue. Cette maturation est particulièrement
importante lorsque la matière grasse a été rendue liquide au cours de la pasteurisation ou de l'écrémage
à chaud. Dans ce cas, sa cristallisation n'est complète qu'après un refroidissement vers 6-7 °C. A 13 °C,
la matière grasse est partiellement en surfusion. La température de maturation physique et sa durée
demeurent assez empiriques; elles sont à adapter selon la composition glycéridique.
Lorsque la matière grasse est riche en glycérides à haut point de fusion, ce qui donne des beurres durs
et cassants, il convient de refroidir rapidement la crème à basse température de façon à obtenir une
cristallisation en fins cristaux (par exemple, de 5 à 7 °C pendant 3 à 4 heures). Si, au contraire, elle est
riche en glycérides à bas point de fusion (oléine), c'est-à-dire liquide à température ordinaire, ce qui
donne des beurres mous, on s'efforcera de provoquer la cristallisation des glycérides à point de fusion
élevé (palmitine) sous la forme de gros cristaux de façon à conférer au bourre de la fermeté (par
exemple, de 12 à 15 °C pendant quelques heures).
Le souci, dans la maturation, est de parvenir à ajuster le rapport matière grasse solide/matière grasse
liquide de sorte que le bourre atteigne la consistance souhaitée. On peut considérer que, dans le cas des
beurres ayant une consistance satisfaisante pour être étalés sur du pain, ce rapport est généralement
compris entre 22 à 35 pour cent/65 à 78 pour cent.
Maturation biologique. Elle a pour but, d'une part, d'acidifier la crème, ce qui facilite le barattage et
limite les pertes de matière grasse dans le babeurre et, d'autre part, de permettre la production de
substances aromatiques (diacétyle). Dans le cas des crèmes pasteurisées, elle nécessite
l'ensemencement des crèmes avec des ferments lactiques mésophiles acidifiants et aromatisants
sélectionnés. Dans le cas des crèmes crues, l'ensemencement en ferments sélectionnés est fortement
recommandé de façon à éviter ou à limiter le développement des micro-organismes indésirables. Le
taux d'ensemencement est de 1 à 5 pour cent. Il varie, comme la température (de 11 à 20 °C) et la durée
de maturation (de 6 à 24 heures), selon l'acidité et l'aromatisation recherchées. Selon les pays, la
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maturation est plus ou moins poussée; d'une façon générale, on a tendance à la réduire, car une forte
acidité (pH du beurre inférieur à 5) favorise l'oxydation et limite ainsi la durée de stockage du beurre.
On classe les beurres en deux catégories:
beurres de crème maturée, dont le pH est égal ou inférieur à 5;
beurres de crème douce, dont le pH est supérieur à 5, souvent compris entre 5,5 et 6 et pouvant
atteindre 6,7-6,8.
Si un pH bas augmente les risques d'oxydation, un pH élevé, en diminuant la protection acide, accroît
les risques d'altérations microbiennes, notamment la lipolyse (rancissement). En conséquence, dans le
cas d'une crème pour la fabrication d'un beurre de crème fermentée, destiné à être consommé
rapidement, son acidité ou barattage doit se situer entre 65 et 70 °Dornic dans son non-gras alors que,
dans le cas d'un beurre destiné au stockage, il faut réduire l'acidité qui ne doit pas dépasser 35 à 50
°Dornic dans le non gras.
1.2.4. Méthode du Nizo (Pays-Bas)
Cette méthode permet de produire un bourre acide à partir d'une crème douce n'ayant subi qu'une
maturation physique (par exemple, 5 heures à 6 °C). Elle consiste à injecter, lors du malaxage du
beurre, un mélange de ferments lactiques et d'un concentré de culture lactique. Le pH est
instantanément abaissé à 5,1-5,2 en même temps que se fait un apport de diacétyle. Cette méthode
connaît un intéressant développement.
1.3. Fabrication du beurre
1.3.1. Principes
Dans le lait comme dans la crème, la matière grasse se trouve à l'état de globules. Dans le
beurre, la matière grasse forme une phase continue emprisonnant à la fois les globules gras restés plus
ou moins intacts et des gouttelettes aqueuses. La proportion de matière grasse restée à l'état globulaire
varie avec le procédé de fabrication. Elle est d'environ 50 pour cent dans le barattage classique et de 30
à 40 pour cent dans le procédé continu Fritz.
La fabrication du beurre consiste en la destruction de la suspension globulaire et une inversion de
phase, accompagnées d'une séparation de la plus grande partie de la phase non grasse (babeurre). Alors
que le lait constitue une émulsion du type graisse dans eau, le beurre est une émulsion du type eau dans
graisse dont la composition est donnée au tableau 16. Cette opération dite barattage nécessite deux
phases distinctes:
Revue bibliographique
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rapprochement des globules gras, obtenu par agitation de la crème;
mise en liberté de la matière grasse à bas point de fusion (fluide à température ambiante) et
répartition dans sa masse des glycérides à point de fusion plus élevé (concrets à température
ambiantes) et des gouttes de babeurre émulsionnées; cette deuxième phase peut être réalisée par
refroidissement ou par agitation.
Tableau 16: Composition du beurre (pour 100 g)
Composants Valeurs
Eau 16 % maximum
Matière sèche dégraissée (lactose, protéines, minéraux) 2 % maximum
Protéines 0,6 %
Glucides 0,4 %
Lipides 82 %
Cholestérol 220-280 mg
Calcium 16 mg
Carotène 0,3-0,9 mg
Vitamine A 0,4-1,05 mg
Energie 755 kcal = 3 150 kJ
Le procédé classique repose sur l'agitation de la crème refroidie dans la baratte classique discontinue -
dont les formes peuvent être variées (tonneau, cube, etc.), de même que le matériau constitutif (bois,
acier inoxydable) - ou dans la baratte continue (système Fritz). L'agitation provoque d'abord la
formation de mousse où s'accumulent les globules; elle permet ensuite la libération de la graisse
liquide. Lorsqu'il y a soudure entre les globules gras plus ou moins éclatés et que la graisse est libérée,
la mousse tombe brusquement avec formation de grains de beurre qui grossissent sous l'action de
l'agitation baignant dans un liquide, le babeurre.
1.3.2. Méthode traditionnelle
Les principales conditions du barattage discontinu sont les suivantes:
Agitation: elle est fonction de la vitesse de rotation de la baratte (de 20 à 50 tours/minute), de
son agencement intérieur' de sa forme, et de son taux de remplissage qui doit être voisin de 40
pour cent de son volume total sans jamais dépasser 50 pour cent.
Température: elle est habituellement comprise entre 8 et 13 °C. Trop basse, elle risque de
donner un beurre qui a tendance à avoir une teneur en eau insuffisante (< 16 pour cent). Trop
élevée, elle risque de provoquer des pertes excessives de matière grasse dans le babeurre et de
donner un beurre mou et trop humide.
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Acidité: elle favorise le barattage en modifiant la couche lécithino protéique de la membrane
globulaire.
Teneur en matière grasse de la crème: elle est habituellement comprise entre 35 et 40 pour cent.
Après remplissage de la baratte et quelques rotations de celle-ci, on l'ouvre afin d'évacuer les gaz puis
on la fait tourner jusqu'au moment où se forment les grains de beurre. L'opération nécessite de 35 à 45
minutes. Dès que le grain commence à se former, la vitre du hublot de la baratte s'éclaircit très
rapidement. On arrête le barattage lorsque le grain a atteint approximativement la grosseur d'un grain
de blé. On élimine alors le babeurre qui ne doit pas contenir plus de 3 à 4 g de matière grasse par litre.
On procède alors au lavage du beurre à l'aide d'eau fraîche à température égale ou un peu inférieure à
celle du grain de façon à le raffermir si nécessaire. Le volume d'eau représente environ les deux tiers du
volume de la baratte. L'eau doit être d'excellente qualité microbiologique et chimique et être exempte
de fer. Le lavage a pour but de diluer les gouttes de babeurre émulsionnées dans la matière grasse de
façon à réduire leur teneur en lactose et protéines; ces substances permettraient le développement de
microorganismes défavorables à la qualité du beurre. Si la crème utilisée est de bonne qualité, il suffit
de procéder à un ou deux lavages de 10 minutes environ chacun. On procède ensuite au «ramassage»
du grain en présence d'un peu d'eau jusqu'à l'obtention de morceaux de beurre de la dimension du
poing. Pour terminer, on effectue le malaxage, qui a pour but de rassembler les morceaux de beurre en
Figure 1: Barattage traditionnel du beurre à l’aide d’une baratte classique (outre). (Samet-Bali et al,
2008).
une masse homogène, de disperser la phase aqueuse au sein de la phase grasse sous forme de très fines
gouttelettes et de régler l'humidité finale du beurre qui, dans la plupart des pays, doit être au maximum
de 16 pour cent. Le malaxage se fait par pétrissage ou par laminage, soit à l'intérieur, soit à l'extérieur
de la baratte.
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1.3.3. Méthode continue au butyrateur
Lorsque les quantités de beurre à fabriquer sont importantes, on utilise de plus en plus le barattage en
continu. Le procédé le plus utilisé dérivé du système Fritz repose sur le même principe que dans la
fabrication classique. 1 l admet les crèmes douces et maturées d'une teneur en matière grasse de 40 à 50
pour cent et met en œuvre une machine (butyrateur) constituée de deux cylindres:
un cylindre de barattage maintenu vers 9-10 °C à l'intérieur duquel tourne à grande vitesse (de 2
000 à 3 000 tours/minute) un batteur; la formation du grain de beurre se fait instantanément;
un cylindre de malaxage incliné dans lequel tombe le mélange de grains de beurre et de
babeurre; dans ce cylindre tournent lentement et en sens inverse deux vis d'Archimède qui
compriment le beurre et le conduisent au travers de filières d'où il sort sous forme d'un ruban
pouvant immédiatement aller à l'empaqueteuse. Au cours du malaxage, le beurre peut être salé
au sel sec ou en saumure.
1.3.4. Salage du beurre
Le salage est le plus ancien procédé de conservation du beurre. Le sel possède un pouvoir
antiseptique qui varie selon sa concentration et les espèces microbiennes. Etant soluble dans la phase
aqueuse, il y forme une saumure plus ou moins concentrée. Ainsi, dans un beurre salé à 1 pour cent, le
taux de sel dans le non-gras est de 6 pour cent, ce qui limite le développement de la flore fongique. Il
faut atteindre un salage à 2,5 pour cent, soit 12,5 pour cent dans le non-gras, pour assurer une inhibition
quasi totale des micro-organismes.
Le salage atteint parfois des taux très élevés allant jusqu'à 5 pour cent soit 24,7 pour cent dans le non-
gras, voire davantage, ce qui est excessif mais masque certaines altérations. A partir de 4 à 5 pour cent,
le beurre est pratiquement inconsommable à l'état frais; il est utilisé dans les préparations culinaires.
Dans certains pays, en raison du rôle du sel sur le goût, on procède généralement au salage du beurre à
la dose de 0,5 à 1,5 pour cent.
1.3.5. Composition du beurre
Cent grammes de beurre contiennent de 82 à 84 g de matières grasses, de 14 à 16 g d'eau et de 0,4 à
1,8 g de matière sèche dégraissée. La phase grasse est essentiellement constituée de triglycérides (82
pour cent). On trouve en outre des phosphatides (de 0,2 à 1 pour cent), du carotène (de 3 à 9 ppm), de
la vitamine A (de 9 à 30 ppm), de la vitamine D (de 0,002 à 0,040 ppm) et de la vitamine E (de 8 à 40
ppm).
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L'eau et la matière sèche forment le non-gras. L'eau provient du plasma de la crème et en partie de l'eau
ajoutée lors du lavage du beurre. La matière sèche est composée de lactose (de 0,1 à 0,3 pour cent),
d'acide lactique (0,15 pour cent dans le beurre de crème acide), de matières azotées (de 0,2 à 0,8 pour
cent) dont la caséine (de 0,2 à 0,6 pour cent), la lactalbumine (de 0,1 à 0,05 pour cent), les protéines
membranaires, les peptides, les acides aminés (traces). On trouve aussi des sels, autres que le NaCI
d'apport (0,1 pour cent), des métaux lourds, dont le cuivre (40 à 300 µg/kg), ainsi que de la vitamine C
(3 ppm) et B2 (0,8 ppm). La teneur en air du beurre varie de 0,5 à 10 ml pour 100 g selon le procédé de
fabrication.
1.4. Procédés de fabricationLa fabrication du beurre traditionnel comprend principalement quatre étapes.
- Écrémage de lait : directement après la traite le lait passe dans l’écrémeuse centrifuge à fin de
séparer la crème du lait (lait écrémer)
- La maturation de la crème : la crème obtenue est placée au frais, dans un récipient inoxydable,
pendant 3à6 jours, durant cette période la crème mûrit, elle s’acidifie naturellement sous l’effet des
bactéries lactiques (ferment lactiques) qui leur donnent son goût et son bon arôme .pendant cette
maturation la crème cristallise aussi partiellement.
- Barattage : c’est la transformation de la crème en beurre, est un procédé purement physique consiste
à battre vigoureusement la crème du lait pour rassembler et souder entre eux les globules gras, pour
former une masse solide flottant dans un liquide laiteux appelé ‘babeurre’ ou lait battu (la partie non
grasse de la crème), ce procédé dure de 15 à 20 min
-Lavage et malaxage : l’eau fraîche permet d’extraire au maximum les résidus de babeurre (le beurre
salé est obtenu on ajoutant du sel à l’eau de lavage).
Le malaxage assure une répartition homogène et optimale de l’eau dans le beurre, ce dernier devient
alors onctueux et lisse.
1.4.1. La conservation du beurre traditionnel
Le beurre de ferme étant préparé à base de crème crue, il est impératif de le conserver dans les
10 jours qui suivent sa fabrication. Au congélateur, sa conservation n’excède pas 3 à 4 mois. En outre,
comme toute matière grasse, le beurre est altérable à la chaleur et à la lumière, il prend vite le goût des
produits qui l’entourent. Tous ces risques d’altération ont poussé les fermiers à utiliser la méthode de
conservation par salage afin de prolonger la durée de stockage de ce produit périssable.
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L’addition de sel au beurre permet la libération d’eau c’est à dire la diminution de l’activité d’eau
(Aw); l’eau libérée forme une phase aqueuse créant un obstacle devant certains microorganismes non
halophiles, aussi des conditions d’anaérobioses favorable aux bactéries lactiques vont êtres crées, ces
bactérie lactiques contribuent à la conservation du beurre de fait qu’elles produisent des métabolites
jouant le rôle d’un conservateur alimentaire.
1.4.2. Altération des composés lipidiques :
L’altération des matières grasse ou rancissement qui se manifeste par une modification de leur
goût et de leur odeur, est d’origine oxydative ou enzymatique.
1.4.2.1. Le rancissement oxydatif
Le rancissement oxydatif est l’oxydation des doubles liaisons des polyinsaturés elle se produit par
abandon de la matière grasse à l’air , les graisses animales rancissent très vite en revanche les huiles
végétales sont plus stable , bien que contenant une plus grande quantité d’insaturés ;ceci est dû à la
présence de substances de nature phénolique dites ‘anti-oxygène’ ou inhibitols qui freinent
momentanément la fixation d’oxygène sur les chaines insaturées comme le tocophérol ou vitamine E.
1.4.2.2. L’oxydation enzymatique
L’oxydation enzymatique effectue une lipolyse des triglycérides c'est-à-dire hydrolyse des
liaisons ester des triglycérides en donnant des mono-glycérides, des di glycérides, du glycérol et acide
gras.
1.4.2.3. L’activité lipasique
Elle peut s’exercer de façon préférentielle soit sur l’acide gras située en α -ά : Candida lipolytica,
Pseudomonas fluarescens, Pseudomonas fragi, Penicillium roquefortii, soit libérer l’acide gras situé
en position β : Aspergills flavus, Staphylococcus aureus, Geotrichum candidum
La lipase peut entraîner une simple acidification sans altération du goût ou de l’odeur si les acides gras
libérés ont un nombre d’atome de carbone >12 oy un rancissement s’il y a libération d’acide gras de
faible poids moléculaire tel que, acide butyrique.
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1.5. Les microorganismes d’altération et la flore indigène du beurreAfin de connaitre l’état hygiénique des deux produits beurre traditionnel et margarine sol qui
ont fait l’objet de notre travail on a procédé à la recherche et le dénombrement des microorganismes
d’altération puis on a isolé, purifié et pré identifié les bactéries lactique présente dans le même
échantillon du beurre traditionnel,
Les groupes des microorganismes recherchés sont les suivants :
1.5.1. Bactéries aérobies mésophiles à 30° C
La microflore aérobie mésophile est l'ensemble des microorganismes aptes à se multiplier à l'air
et aux températures moyennes (entre 25° et 40°C). Ce sont des bactéries pathogènes pour l'homme
d'une part, et des microorganismes d'altération d'autre part. Le dénombrement de la flore mésophile
totale est un test très important. Sur le plan technologique, une flore mésophile nombreuse indique que
le processus d'altération microbienne est fortement engagé bien qu'en fait il n'y ait pas de corrélation
précise entre l'importance quantitative de la flore mésophile totale et le temps qui s'écoule avant que
l'altération soit perceptible organoleptiquement, car l'altération peut être le fait d'un groupe spécialisé
ne représentant au départ qu'une faible proportion de la population.
Sur le plan hygiénique, il n'y a pas non plus de corrélation étroite entre l'importance de la flore
totale et la présence de microorganismes pathogènes dans le produit. On peut cependant dire que le
dénombrement de la flore totale reste la meilleure méthode d'appréciation de la qualité microbiologique
générale des aliments (Bourgeois, 1980).
1.5.1.1. Coliformes totaux
Ce groupe contient toutes les bactéries aérobies ou anaérobies facultatifs, Gram négatif,
asporulées, en forme de bâtonnets, mobiles ou non (Cardinal et al, 2003). Selon les mêmes auteurs,
ces bactéries disposent d'un métabolisme respiratoire et fermentaire les rendant capables de fermenter
le lactose en produisant de l'acide et du CO2 à 35°C. La présence de coliformes totaux dans les
aliments indique un traitement thermique inefficace ou une contamination subséquente au traitement.
Ils peuvent aussi démontrer un mauvais nettoyage et une mauvaise désinfection des matériels de
transformation.
1.5.2.1. Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus appartient à la famille des Micrococcaceae qui comprend deux genres :
le genre Staphylococcus et le genre Micrococcus dont les bactéries se caractérisent par une
morphologie en cocci, sont Gram positives et possèdent une catalase (de Buyser, 1980). Ces deux
Revue bibliographique
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genres se distinguent aussi par le fait que les Staphylocoques sont des aéro-anaérobies facultatifs alors
que les Microcoques sont des aérobies stricts. Le genre Staphylococcus est divisé en trois espèces :
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis et Staphylococcus saprophyticus.
Parmi ces trois espèces, seule Staphylococcus aureus possède un pouvoir pathogène à cause de
la présence d'une enzyme, la coagulase, qui peut transformer le fibrinogène en fibrine. S. aureus peut
être retrouvé notamment chez de nombreuses espèces animales, sur la peau ou encore sur la muqueuse
du rhinopharynx.
L'importance du rôle des porteurs de germes (plaies cutanées suppuratives ou rhinopharynx)
dans la contamination des aliments par S. aureus n'est plus à souligner (30% des sujets seraient
porteurs). DE BUYSER affirme que S. aureus dispose d'un équipement enzymatique important
(hyaluronidase, fibrinolysine) et secrète diverses toxines (hémolysines, leucocidines, entérotoxines).
C'est son aptitude à élaborer des entérotoxines extrêmement actives qui retient l'attention des
hygiénistes alimentaires, car ce sont elles qui provoquent l'apparition des toxi-infections alimentaires
dites « à staphylocoques ».
1.5.2.2. Levures
Les levures sont des champignons microscopiques se présentant sous forme unicellulaire au
moins à un stade de leur cycle biologique (Bouix et Leveau, 1980). Selon ces mêmes auteurs, compte
tenu des possibilités métaboliques des levures, elles sont très utilisées dans les industries agricoles et
alimentaires. Les applications les plus connues sont sans doute la fabrication de boisson alcoolisée,
ainsi que la production d'alcool industriel à partir de jus de mélasse de betterave ou de canne à sucre.
Par ailleurs, les levures sont directement utilisées en panification. Elles participent également à
l'affinage de certains fromages. Enfin, elles peuvent être utilisées à la fabrication de produits plus
nobles comme les enzymes, les vitamines, les nucléotides, ...
Malgré leur importance, (Bouix et Leveau, 1980). affirment que la présence des levures n'est
pas souhaitée dans les produits alimentaires. Les levures n'étant pas pathogènes (à l'exception de
Candida albicans et Cryptococcus neoformans), elles ne causeront pas d'exception alimentaire mais
peuvent produire, par leur développement dans les produits alimentaires finis des altérations de leur
qualité marchande par formation de troubles (cellules de levure), d'odeurs ou de goûts annexes
anormaux (éthanol, augmentation du pH due à la dégradation d'acides organiques) ou par gonflement
des produits ou (et) de leur emballage (CO2).
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1.5.2.3. Moisissures
Les moisissures sont des champignons microscopiques se développant sur des substrats morts
(ce sont des saprophytes) et se caractérisent par un thalle filamenteux : le mycélium. Ce dernier se
bouture aisément par fragmentation, mais différencie aussi des organes variés de multiplication : les
spores (Moreau, 1980). Selon les espèces, les spores sont aisément dispersées par l'air (xérospores) ou
par l'eau (myxospores).
Pour le même auteur, la plupart des denrées alimentaires, au cours de leur préparation mais
surtout de leur entreposage, sont susceptibles d'être détériorées par des moisissures. Les pertes qui leur
incombent sont considérables. Parfois l'altération des denrées aboutit à une modification de la valeur
nutritionnelle du produit, à l'apparition de flaveurs indésirables, à d'autres cas, c'est la santé du
consommateur qui est en jeu. Certaines moisissures élaborent des substances toxiques, les
mycotoxines; ces dernières diffusent dans l'aliment et, si elles sont en quantité suffisante, elles peuvent
provoquer des intoxications aiguës ou chroniques.
1.6 Les bactéries lactiques
Les bactéries lactiques sont des micro-organismes utiles à l'homme lui permettant de fabriquer
et de conserver un grand nombre de ses aliments. Les bactéries lactiques ont été isolées pour la
première fois à partir du lait (Metchnikoff, 1908; Sandine et al., 1972; et Carr et al., 2002). Les
bactéries lactiques sont Gram positive, immobiles, asporulées, de formes coccoide ou bâtonnet,
fermentant toutes les carbohydrates en acide lactique principalement.
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Figure 2. Schéma montrant l’arbre phylogénique basé sur la comparaison du gène de l’ARN16 S, en groupant les bactéries lactiques à faible pourcentage CG et la relation lointaine avec lesgermes à gram positif de haut pourcentage CG du genre Bifidobacterium et propionibacterium(Holzapfel et al., 2001).
Les bactéries lactiques appartiennent aux genres suivants: Carnobacterium, Enterococcus,
Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella (Vandamme et al., 1996; Stiles et Holzapfel,
1997,Axelson, 2004)(Figure 1).
D’autres bactéries gram positive non sporulées et productrices d’acide lactique appartenant à la
famille des actinobacteriacée et au genre, Aerococcus, Microbacterium, et Propionibacterium (Sneath
et Holt, 2001) ainsi que le genre Bifidobacterium (Gibson et Fuller, 2000; Holzapfel et al., 2001) sont
aussi impliquées dans l’industrie agro-alimentaire.
Les travaux récents sur la taxonomie effectuée sur la caractérisation des bactéries lactiques
basée l’étude de la comparaison de l’ARN ribosomal 16S ont révélé une différence dans les relations
entre les la caractérisation phénotypique et la caractérisation phylogénique.
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Les techniques de biologie moléculaire spécialement la PCR (réaction de la chaine
polymerase), RFLP (Restriction Fragment Long Polymorphisme), DGGE (Electrophorèse en Gradient
Gel Dénaturé) et TGGE (Gèl Eléctrophorèse en Gradient de Température) sont utilisées pour confirmer
l’identification précise des espèces bactériennes.
1.7. Principales caractéristiques des bactéries lactiques
Malgré la diversité des variétés des bactéries lactiques, il a été possible de ranger dans une
classification bactérienne suivant leurs caractères morphologiques, structuraux et physiologiques.
1.7.1. Morphologie
Classiquement, on distingue deux aspes principaux :
Une forme arrondie : leur diamètre mesurant environ 1µm, se sont des coques
(diplocoques, tétrades, en amas ou en chainette).
D’autre plus allonges, se sont des bacilles, de nombreuses formes peuvent être
observé, bacilles très fins ou épais, formes cortes ou longues
( diplobacilles, en chainettes, accolées en palissade ou en paquets).( Stiles et
Holzapfel ;1997)
1.7.2. Structure
Se sont des unicellulaires, donc constitues d’une seule cellule composée obligatoirement d’une
paroi, un cytoplasme renfermant les acides nucléiques, principalement l’ADN chromosomique et
parfois des plasmides. Le cytoplasme et entouré d’une membrane cytoplasmique. (Stiles et Holzapfel ;
1997).
1.7.3. Physiologie
Les bactéries lactiques sont immobiles, jamais sporulés, anaérobie facultatives mais
aérotilérantes. Si l’oxygène peut parfois être leur substrat, il conduit comme produit final au peroxyde
d’hydrogène (H2O2) qui est toujours un produit toxique. Du fait que dans la plupart des cas, ces
bactéries ne peuvent pas normalement le décomposer car elles ne possèdent pas de catalase
Revue bibliographique
52
fonctionnelle ; ni de nitrate réductase, ni de cytochrome oxydase, quelques souches possèdent que
activité caséinolytiques. (Prescott et al ; 1999).
Elles sont uniques car elles sont de croitre en anaérobiose, par le fait qu’elles sont incapables de
synthétiser et donc des cytochromes. Elles ne réduisent pas les nitrites. (Prescott et al ; 1999).
Elles sont Gram+ et elles ont comme principale caractéristique la production des quantités
abondantes d’acide lactique par fermentation des substances hydrocarbonées. Elles peuvent tolérer des
PH acides et généralement elles ne peuvent pas pousser dans un milieu contenant du Na Cl 6.5
%.(Vandamme et al ; 1996).
En effet, ces espèces sont douées d’un phénomène de fermentation aboutissent à la formation
d’alcool et d’acide organiques, qui traduit la destruction des sucres. Ces micro-organismes ont besoin
d’oxygène pour subvenir à leurs besoins mais ne pouvant capter celui de l’air, ils vont emprunter à une
matière organique. Un sucre par exemple, la substance organique sera alors fermentée et un nouveau
produit apparaitra. ( Kandler et Weiss ; 1986) .
1.8. Les différents genres des bactéries lactiques :
Les bactéries lactiques sont représentées par plusieurs genres d’importation d’ailleurs
différentes, selon la morphologie, ce groupe peut être divisé en deux :
Coques : c’est le cas de streptococcus mais aussi de Lactococcus,
Enterococcus, Leuconostoc et Pediococcus.
Bacilles : Lactobacillus.
Ils se distinguent en plus par leur type fermentaire : homolactiques ou hétérolactiques. Aces genres a
été ajouté récemment le genre Bifidobacteruim ( Kandler et weisse, 1986).
D’autres caractéristiques peuvent être rajoutés et par les quels on peut differencier les espéces :
La nature de peptidoglycane (Scheifer et Kandler ; 1972).
Les propriétés antigéniques.
La nature d’acide techoique.
La mobilité électrophorétique de LDH ( Garvie ;1984).
La composition chimique des protéines qui peuvent être séparés par la technique PAGE-
SDS.
La composition saccharidique et lipidique.
Revue bibliographique
53
1.9. La classification des bactéries lactiques :La classification des bactéries lactiques à été le souci de plusieurs chercheurs (Sneath et al, 1986 ;
Novel ; 1993 ; Leclerst, al ; 1995).
La classification classique complète par la classification a permis de distinguer genres.
1.9.1. La classification classique
a. La classification selon Orla-Jensen 1919
Orla-Jensen 1919 a établi une classification des bactéries lactiques basée sur la morphologie et le
comportement en culture des bactéries , sur la nature de la source d’énergie et des élément nutritifs
utilisés, sur le mode d’utilisation de éléments nutritifs, sur le comportement à différentes températures,
sur les propriétés d’agglutination autres qualités spécifiques.
Le premier groupe caractérisé les bactéries des forme cocoide ou cocci ; ce groupe engendre la
tribu des stréptococcaceae qui appartient à la famille des Micrococcaceae. Cette famille renformie les
principaux genres de bactéries de la flore lactique : Streptococcus, Leuconostoc, et Pédiococcus. Les
deux premiers genres sont homo fermentaires alors que le troisième est hétéro fermentaires.
Le second groupe comprend les bactéries de forme bacilloum et renferme la tribu des
Lactobacillaceae, appartenant à la famille des Bacillaceae. Ce groupe ne comprend que le genre
Lactobacillus, lui-même subdivisé en trois sous groupe :
Les Streptobacterium ou homofermentaire
Les Thermobactérium ou thermophiles ou homofermentaires
Les Betabactérium : sont hétérofermentaires.
b. La classification selon le Bergey’s 1986 :
Dans le Bergey’s annuel « Sneath et al, 1986 » les bactéries lactiques sont regroupées suivant une
taxonomie basée sur (tableau 17):
Les caractères morphologies :
Forùe coques ou bâtonnets, le mode d’association des cellules, diamètre cellulaire et l’absence de
spores.
Les caractères biochimiques et physiques :
Revue bibliographique
54
Quantité et configuration de l’acide produit, T de croissance (minimales, optimales et maximales),
tolérance à l’oxygène et au chlorure de sodium, production du gaz et de l’arome, hydrolyse de l’exuline
st de l’arginine, résistance aux sels biliaires et différent pH.
-L’étude des relations immunologiques des lactates déshydrogénases et des enzymes des voies
glycolytiques.
-L’étude du taux d’homologie en G-C de l’ADN (Sneath et al, 1986).
Tableau 17: Classification de Bergey’s 1986 des bactéries lactiques
Coccis Gram+
Asporulale
Bacilles Gram+
Asporulale
Peptococcaceae Streptococcaceae Aérobie ou anaérobifacultatif
Peptococcus
Peptostréptococcus
Rumùiococcus
Sarcina
Lactobacillus :
Homo fermentaire strict.
Hétéro fermentaire facultatif.
Hétéro fermentaire strict.
1.9.2. La Classification moderne
La composition de l’ADN des bactéries lactiques permet de connaitre l’homogénéité des espèces
constituants ces genres, le coefficient de chargaf qui est le rapport A+T/G+C que l’on exprime par
GC% montre une composition assez proche pour les genres Streptococcus, leuconostoc et
pediococcus.
Par contre le genre Latobacillus est caractérisé par l’hétérogénéité de ces espèces. A
présent, la séquence de l’ARN ribosomal «16S » est devenue une aide important dans la classification
de nouveaux genres (Novel ; 1993, Leclers et al ; 1995, Miyake ; 1998).
Les genres Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc et Streptococcus dont le GC% de
l’ADN est inférieur à 50% peuvent etre regroupé dans la branche des Clostridium avec Bacillus et
séparés de la branche des Actinomycétale au GC% supérieur à 50% et comprenant le genre
Bifidobacterium (Velasquez et al ; 1997).
La nouvelle taxonomie repose sur la stabilité du génome sur la possibilité de définir les relations
physiques entre des groupes lactiques.
Matériel et méthodes
55
2. Matériels et méthodes
2.1. Provenance des échantillons de beurre
Six échantillons de beurre traditionnel ont été collectés des régions rurales (Tissemsilt, Djelfa,
Oran, Maghnia). Ce beurre est de fabrication traditionnelle. Les prélèvements ont été mis dans des
flacons préalablement stérilisés puis transportés dans des conditions environnantes. Le beurre
traditionnel, chez le fermier ou le consommateur, est conservé à température ambiante. Le beurre
prélevé est soit salé ou non (Tableau 18)
Tableau 18: L’origine des échantillons collectés et leur nature.
Origine Région
Dehan salé
Dehan non salé
Dehan salé
Dehan non salé
Semen
Dehan non salé
Tissemsilt
Tissemsilt
Djelfa
Maghnia
Oran
Oran
2.2. Préparation des échantillonsDans les conditions d’asepsie, Un gramme de beurre est introduit dans 9ml de solution à 2% de
phosphate dipotassique, pH 7,5 ± 0,1 stérile. Le tout est fondu dans un bain-marie n'excédant pas
45C puis homogénéisé par agitation. A partir de la solution mère, des dilutions décimales (10-1 è 10-
8) sont réalisées et 1 ml de la dilution appropriée est ensemencé en profondeur dans les milieux
suivants:
- Le milieu PCA (Plate Count Agar) pour le dénombrement de la flore microbienne totale aérobie. Le
nombre de colonie par gramme est déterminé selon la référence de l’IDF (International Dairy
Federation) (IDF, 1991)
- Le milieu MRS solide, pH6,8 (De Man et al., 1960) incubé en anaérobiose à 45 °C pendant 48h pour
l'isolement des lactobacilles et les streptocoques thermophiles.
Matériel et méthodes
56
- Le milieu Mayeux, Sandine, Elliker (MSE) (Mayeux et al., 1962) est utilisé pour l'isolement des
leuconostoques après incubation à 30°C pendant 3 jours.
- Le milieu MRS acidifié, pH 5,4 (MRSA) est utilisé pour l'isolement des lactobacilles.
- Le milieu M17 (Terzaghi et Sandine, 1975) est incubé à 30°C pour l'isolement des lactocoques
- Le milieu Chapman est utilisé pour la recherche des staphylocoques dorée. L’incubation se fait à
37°C pendant 24 h.
- Le milieu Bouillon lactosé au Pourpre de Bromocresol BLBCP est utilisé pour le dénombrement des
coliformes totaux et les coliformes fécaux. Le milieu est incubé à 37°C et 44°C respectivement.
Cinq colonies sont prises d’une manière aléatoire de la dilution la plus grande et d’une boite
dénombrable
2.3. Identification des bactéries lactiques
2.3.1. Purification et conservation des souches.
Les bactéries à Gram positif et à catalase négative sont présumées des bactéries lactiques. Les
souches sont purifiées par une série de repiquage par strie sur milieu MRS puis conservées dans du
MRS solide incliné et à 4°C. La culture est renouvelée chaque mois
2.3.2. Identification des bactéries lactiques selon le genre
Les souches de bactéries lactiques gram positif et catalase négative sont appariées aux genres
appropriés selon des caractères macroscopiques et des tests indiqués dans le tableau 19.
L’aspect microscopique des souches retenues est réalisée par la coloration de Gram à partir d’une
culture âgée de 24h (Gerhardt et al., 1981). La croissance à différentes températures, 15°C, 30°C et
45°C, a été évaluée visuellement sur milieu MRS liquide après 48 h d’incubation. Le test de la présence
de la catalase est conduit par l’action des souches lactiques sur du peroxyde d’hydrogène à 10 volumes.
La production de CO2 est évaluée sur milieu MRS contenant comme source de carbone du glucose et
sans l’extrait de viande. La cloche de Durham permet la collecte du CO2 qui pourra être produits.
Matériel et méthodes
57
Tableau 19:Caractéres différentiels des bactéries lactiques (Harrigan and McCance, 1976; Garvie,1984; Hammes et al., 1992; Holzapfel and a Schillinger, 1992; Teuber et al., 1992; Weiss, 1992;Axelsson, 1993)
2.3.3. Identification des bactéries lactiques selon l’espèce
a- Hydrolyse de l’arginine
La recherche de l’arginine déhydrolase (ADH) est étudiée sur le milieu M16BCP (Thomas,
1973). Ce milieu contient du lactose (2 mg / ml) et de l’arginine (4 mg / ml) et un indicateur de pH le
pourpre de bromocrésol (0,05 mg / ml). Les bactéries lactiques utilisent le lactose en acidifiant le
milieu, les colonies donnant ainsi une coloration jaunâtre. D’autres bactéries lactiques sont capables
d’utiliser l’arginine et ré-alcalinisent le milieu, leurs colonies apparaissent blanchâtres. La couleur de
l’indicateur de pH demeure inchangée.
b. Test du pH et la tolérance au sel
Le test du pH et la tolérance à l’NaCl, nous permettent de différencier les lactocoques des
entérocoques. La détermination des isolats appartenant au genre Streptococcus et Lactococcus est
effectuée selon des tests physiologiques cités par plusieurs recherches (Schleifer et al., 1985; Samelis et
al., 1994 et Carr et al., 2002). Etant donné que les lactocoques et le Streptococcus thermophilus ne
Matériel et méthodes
58
poussent pas à 6,5% d’NaCl. Les souches bactériennes de forme cocci, sont testées pour leur capacité à
croître dans le bouillon hypersalé (MRS auquel est ajouté 4,5% et 6,5% d'NaCl). L’incubation se fait
pendant 5 jours.
c- Profile fermentaire
La fermentation des carbohydrates a été menée sur milieu MRS sans extrait de viande et
additionné de pourpre de bromocrésol (BCP) comme indicateur de pH (MRSBCP-EV). La source de
carbone est représentée par l'un des sucres suivant : arabinose, glucose, fructose, galactose, lactose,
maltose, mannitol, rhamnose, saccharose, xylose, esculine, sorbitol . Les solutions sucres sont préparée
à 3% et stérilisées par autoclavage. Un millilitre de la solution sucrée est additionné à 10 ml de MRS
BCP-EV. Vu le nombre important de souches étudiées ainsi que le nombre de tubes à essai à utiliser
avec chaque souche, une mini préparation est réalisé au laboratoire. Une plaque d'Elisa est utilisée pour
ses puits. Les puits de chaque ligne contiendront une source de carbone qui sera utilisée par différentes
souches. Une solution bactérienne servant à ensemencer les puits contenant la différente source de
carbone a été préparée. Une culture de 18 heures de la souche appropriée est centrifugée à 8000 tr/mn
pendant 15 min. Le culot ainsi récupéré est additionné de 2 ml de tampon phosphate puis centrifugé
une deuxième fois aux mêmes conditions pour le débarrasser des restes du milieu de culture et obtenir
un culot cellulaire pur. A ce culot, 5 ml de milieu MRSBCP-EV est additionné pour former la solution
cellulaire servant à ensemencer les puits contenant différentes source de carbone; 100 μl de cette
solution bactérienne est déposée dans chaque puits on utilise des 0,1 ml d’huile pour créer des
conditions d’anaérobioses et on incube a 30°C.. La lecture des résultats sa fait après 24 et 48 heures
d’incubation.
Sucres utilisés
Souches
Figure 4 : schéma représentant la mini préparation pour le test de la fermentation des sucres
Matériel et méthodes
59
d- l’étude des interactions
Après avoir incube les cultures jeunes des bactéries lactiques choisis souches inhibitrice a 30°C
pendant 24 heures on les ensemence par touche sur MRS solide et on les laisse diffuser. Le lendemain,
et sur chaque boite on coule du MRS semi-solide contenant 200 microlitre de culture jeune de chaque
bactérie lactique ….souche indicatrice.. et on incube à 30°C. et on incube.
e-Evaluation de la substance antimicrobienne
A partir d’une culture de 18h en milieu MRS liquide, 2 ml de chaque culture bactérienne est
introduite dans un tube epindorf et on centrifuge à 4000 tr/mn pendant 10 min. Le surnageant est
récupéré. Dans une boite de Pétri de la gélose nutritive est coulée en fine couche et laisser se solidifier
pour 24 h. Sur cette dernière, le milieu Muller Hinton est coulé en boite puis laisser se solidifier. La
souche indicatrice est ensemence par écouvillonnage a la surface du milieu MH. A l’emporte-pièce, des
puits sont réalisés sur milieu MH solidifié. La couche de GN préalablement coulée nous permet de
seller le puits et d’empêcher le surnagent de diffuser sous le milieu MH. Chaque puits recevra 100
microlitre du surnagent de la souche productrice. Les boites ainsi préparées sont mise au frigo pour
1h30 afin de permettre au surnagent de diffuser dans la masse du milieu. Après cela les boites sont
incubées et la lecture se fait après 24 et 48 h d’incubation. Le résultat se traduit par une zone clair
autour du puits. Une zone de 2mm est considérée comme résultat positif.
h-Recherche de l’activite lipolytique sur Agar au tween80
Le milieu est préparé par ajout de: 10 g de peptone, NaCl, 5.0g, CaCl2·2H2O 0.1g et 20 g
d’agar dans 1 litre d’eau distillée. Le milieu est autoclavé pendant 20 minutes. 2,5 ml de Tween80 est
stérilisé séparément puis ajouté au milieu. Le pH est ajusté à 6. 20 ml du milieu est coulée en boite et
après solidification les souches lactiques sont ensemencées par un multi-ensemenceur. L’activité
lipolytique est indiquée par l’apparition d’un précipitât visible, résultant du dépôt des cristaux du sel de
calcium formé par la libération des acides gras libérés par les enzymes ou un précipitât autour de la
colonie dû à la dégradation complète des sels des acides gras. A intervalle régulier de 24 h
d’incubation, les boites sont examinées pour un monitoring d’une activité lipolytique (Sierra, 1957;
Guiraud et Galzy, 1980; Gopinath et al., 2005)
Matériel et méthodes
60
i-Recharche de l’activite proteolytique:
L’activite proteolytique est recherchée en milieu MRS additionné de lait écrémé à 10%
la methode de Van Den Berg et al.(1993) et sur PCA additionnée de lait écrémé à 10%. L’activité est
évaluée à 1% (v/v) et 2 % (v/v) de lait écrémé. Les souches lactiques lactiques sont ensemencées par
un multi-ensemenceur. L’activité protéolytique se traduit par la formation d’un halo d’éclaircissement
autour de la colonie.
j- antibiobiogramme
L’antibiogramme de nos souches lactiques a été évalué par la méthode de diffusion en milieu
solide. Le milieu utilisé est le Muller Hinton. Les antibiotiques utilisés sont sous forme de disque. La
nomenclature des antibiotiques et leur concentration utilisée dans nos expériences sont représentées
dans le tableau 20.
Matériel et méthodes
61
Tableau 20: Liste des antibiotiques utilise pour l’étude de l’antibiogramme des souches de bactéries
lactiques isolées
Antibiotiques Charge du disque symbole C C1’ 2 CH11’
Amikacin 30 µg AN 16 14 20 18
Amoxycillin +Clavulanic Acid
20 µg + 10 µg AMC 29 28 17 24
Ampicillin 10 µg AM R 28 27 24
Bacitracin 0,02 à 0,04 IU BAC 15 14 14 14
Cefazolin 30 µg CZ 18 15 18 13
Cefotaxime 30 µg CTX 19 23 25 19
Cefoxitin 30 µg FOX 22 23 16 18
Cefsulodin 30 µg CFS 12 12 11 10
Ceftazidime 30 µg CAZ 10 9 R R
Cephalothin 30 µg CF 24 27 32 28
Ciprofloxacin 5 µg CIP 12 14 19 14
Clindamycin 2 µg CM 25 22 34 26
Colistin 50 µg CS 50 9 10 13 12
Erythromycin 15 µg E 26 25 31 25
Fusidic Acid 10 µg FA 17 16 18 18
Imipenem 10 µg IPM 27 24 24 23
Lincomycin 15 µg L 29 27 36 27
Nalidixic Acid 30 µg NA R R R R
Netilmicin 30 µg NET 18 18 21 20
Nitrofurantoin 300µg FT R 18 27 25
Ofloxacin 5 µg OFX 13 16 21 14
Oxacillin 1 µg OX1 R R R R
Pefloxacin 5 µg PEF R R 14 10
Penicillin 6 µg / 10 IU P 28 28 36 28
Piperacillin 75 µg PIP 75 22 26 28 25
Pristinamycin 15 µg PT 31 25 40 27
Rifampin 30 µg RA 30 31 34 40 30
Spiramycin 100 µg SP 20 20 26 18
Tetracycline 30 µg TE 28 30 40 26
Ticarcillin 75 µg TIC 30 30 40 33
Tobramycin 10 µg TM 12 12 16 14
Trimethoprim-Sulfamethoxazol
e (co-trimoxazole)
1.25 µg + 23.75 µg SXT R R R R
Vancomycin 30 µg VA R R R R
Résultats et discussion
3. Résultats
3.1. Qualité sanitaireL’analyse microbiologique des échantillons de beurre concernés par cette étude, montre une
qualité hygiénique et sanitaire satisfaisante. Ainsi trois de nos échantillons étaient salubre des points de
vue coliformes totaux et fécaux. En revanche, les échantillons provenant d’Oran et Maghnia
contenaient ces même population mais a des concentrations acceptables selon les normes en vigueur
(Figure 5) applicable pour les beurre industriels. Ces concentrations faible peuvent s’agir d’une
souillure des échantillons lors des prélèvements. Ces mêmes échantillons ont fait l’objet du même test
six mois après leur collecte et aucune flore fécale n’a été décelée. Aucun Staphylococcus aureus n’a été
décelé dans nos échantillons
Figure 5: recherc
.a :témoin
3.2. Isolement
Les résult
permis de distingu
de couleur blanch
purifiées et une co
a
he des
b :r
et id
ats d’
er de
âtre e
lorati
b
62
coliformes sur buoillon lactosé au pourpre de bromo crésol
ésultat positif
entification des bactéries lactiques
isolement, à partir de plusieurs dilutions sur milieux MRS, MSE, M17 ont
s colonies de différentes tailles, bien isolées, de forme circulaire et lenticulaire
t crémeuse (Figure 6 et 7 ). Les souches sont repiquer dans le milieu MRS et
on de Gram est réalisée (Figure 8,9 et 10)
Résultats et discussion
63
Figure 6 : Aspect des colonies en profondeur sur milieu M17.
Figure 7: Aspect des colonies en profondeur sur milieu MSE.
Résultats et discussion
64
Figure 8 : Aspect des colonies après purification sur milieu MRS
Figure 9 : Aspect microscopique des souches de bactéries lactiques au Grossissement X100. A droite
forme bacille et à gauche forme diplocoque (forme typique des leuconostoques)
10 mµ10 mµ
Résultats et discussion
65
Figure 10: Aspect des colonies pures en milieu MRS liquide
La dégradation de l’arginine joue un rôle primordial dans la répartition des bactéries lactiques isolées
en groupe selon différents travaux sur l’écologie des bactéries lactiques de différents produits laitiers.
Figure 11 : test de l’hydrolyse de l’arginine sur milieu M16BCP. Le changement de couleur indique un
résultat négatif.
Résultats et discussion
66
Sur les 107 souches de bactéries lactiques retenues sur la base de leur coloration gram positif et
catalase négative 52,34% sont des bacilles et 47,66 sont des cocci. La distribution des différents genres
sont représentés dans la figure 12
Figure 12 : Répartition des différents groupes de bactéries lactiques des souches de bactéries lactiques
isolées du beurre traditionnel
L’identification des souches de bactéries lactiques passent par différents tests comme la production de
CO2 à partir du glucose et l’action de la température sur la croissance de nos souches. Le profil
fermenteur est le test essentiel, permettant d’identifier les espèces des bactéries lactiques. Pour ce
dernier une mini-préparation, en utilisant les plaques d’Elisa, a été utilisée. Elle facilite et réduit
énormément le travail (Figure 13)
Figure 13 : La mini préparation en plaque d’Elisa pour l’étude du profil fermentaire
Résultats et discussion
67
Tableau 21a: caractères biochimique des souches de bactéries lactique isolées du beurre.
CAZ R S+ S+ S+ R S+ S+ S+ R S+ RPIP S+ S+ nd S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+
FOX S+ R S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+
TE S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+
VA30 R R R S+ R R S+ S+ R R RL S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+
RA S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+
4. DiscussionLa qualité sanitaire des échantillons de beurre étaient de qualité satisfaisante. Dans le temps, le
rancissement s’installe lentement et progressivement. Ce phénomène élimine ainsi la flore indésirable
qui a été vérifiée par la recherche des coliformes totaux et fécaux après 6 mois de l’échantillonnage. Le
salage est un autre atout pour ce beurre qui va dans le même sens et augmente ainsi la salubrité de ce
produit. On signale aussi que la flore lactique est toujours présente dans le même intervalle de temps.
Ce produit fini conserve ainsi sa qualité organoleptique recherché par la ménagère avec une flore
lactique toujours présente. Le sel n’est pas toujours présent ; c'est-à-dire qu’il représente le plus
souvent une étape de conservation courte puis il sera éliminé pour laisser un produit sans sel. La
méthode et la manière d’enlever le sel est purement traditionnel montrant ainsi l’héritage traditionnel
du savoir faire.
La flore lactique présente dans ce beurre est constituée principalement de lactobacilles qui dominent la
totalité de la flore lactique. La dominance de ce genre est du à leur propriétés acidifiantes. Il faut savoir
que la fabrication du beurre traditionnelle passe obligatoirement par une acidification marquée du lait
Résultats et discussion
76
avant la phase de récupération des globules gras. Les lactobacilles constituent selon plusieurs travaux la
flore dominante de presque tous les produits laitiers de fermentation traditionnelle. On citera les
travaux de Beukes et al., (2001) qui trouvent que les lactobacilles représente 23% de la population
lactique dans un lait fermenté en Afrique du sud. Missotten et al., (2009) isolant des bactéries lactiques
a partir du porc trouve sur 145 souches de bactéries lactiques 131 lactobacilles. Le lait de chamelle par
les travaux de Khedid et al., (2009) contient 37,5% de lactobacilles de l’ensemble des bactéries
lactiques isolées, ceci montre que la flore initiale du lait cru contribue énormément à celle résiduelle
dans le produit final quelle que soit la méthode de transformation traditionnelle tout en soulignant
qu’aucune pasteurisation n’est réalisé dans ces méthodes. Les lactobacilles représente 54.4% de la flore
lactique d’un produit de fermentation traditionnelle à base de manioc (Kostinek et al., 2007). L’espèce
la plus dominante pour ce groupe est Lactobacillus plantarum. Cette espèce est largement connue pour
sa dominance pour le genre Lactobacillus dans presque l’ensemble des produits traditionnels et
spécialement à partir du lait. Cette dominance est du à un grand nombre de propriétés, on citera
l’acidification et la production de substances antimicrobienne. Lactobacillus delbruekii est aussi très
représenté parmi les souches isolées. Cette dernière présente trois sous espèces lactis avec 3 souche,
delbruekii avec 4 souche et enfin bulgaricus avec 5 souches. Lactobacillus casei est représentée par 8
souches devisées entre la sous espèce casei et rhamnosus.
La présence des lactobacilles dans ce produit traditionnel est surement du à la méthodologie utilisée qui
consiste à acidifier le lait pour une période de 24 heures avant d’entamer la séparation de la matière
grasse. Le lait ainsi acidifié contribue à la sélection de la flore acidifiante. L’étape suivante, séparation
de la matière grasse, se fait dans une enceinte en cuire qui favorise les conditions d’anaérobiose au
néanmoins diminuer largement l’apport en oxygène facilite le développement des bactéries lactiques
productrice de CO2 comme les Leuconostoc qui sont présent avec les sous espèce Leuconostoc
mesenteroides subsp. dextranicum, la souches productrice de dextran et Leuconostoc mesenteroides
subsp. mesenteroides.
Les lactocoques sont représentés par une seule espèce qui est Lactococcus lactis subsp. cremoris. On
signalera que la classification phynotypique de cette espèce donne des résultats ambigus. Il a été
confirmé par plusieurs recherches que les souches qui étaient identifiées comme cremoris,
génotypiquement étaient lactis et vis-versa (Godon et al.,1992; Salama et al., 1993; Charteris et al.,
2001)
Résultats et discussion
77
Les souches de bactéries lactiques testées pour leur pouvoir inhibiteur vis-à-vis de Staphylococcus
aureus et Escherichia coli ont montré leur capacité antagoniste envers ces deux souches par la
production de substances dans le milieu de culture. Cette production a été confirmée par l’utilisation du
filtrat de culture dans l’expérience de confrontation. Les bactéries lactiques isolées et identifiée
montrent une capacité à inhiber les souches de Staphylococcus aureus, Escherichia coli. Ces deux
souches indésirables sont connues comme contaminant des produits laitier acidifiés.
L’étude de l’antibioresistances des bactéries lactiques montre une résistance a deux type d’antibiotique
à savoir l’oxaciline et la vancomycine. Essid et al., (2009) travaillant sur les lactobacilles, trouves que
presque la totalité des souches sont sensible à l’amikacin (30 lg), la cefuroxime (30 lg), la gentamicin
(10 lg), la norfloxacine (10 lg) et la streptomycin (10 lg). Ces meme autheurs trouvent 88.2% et 82.3%
des souches resistante à l’erythromycin et la rifampicin respectivement. 70.5% de leur souches étaient
résistantes à l’ampicillin et la penicillin G. Nguyen et al., (2007) trouvent que Lactobacillus plantarum
resistante à la tetracycline, la gentamicin et la penicillin et sensible à l’erythromicine et l’ampicillin.
Gevers et al., (2003) trouvent que 100%, 79% et 64% des bactéries lactiques isolées du saucisse
fermenté et séché sont résistantes à la tetracycline, la gentamicin et la penicillin respectivement. Il faut
savoir qu’avant d’utiliser un ferment lactique, il est important de vérifier que les souches bactériennes
ne peuvent transférer les gènes de résistance (Mathur & Singh, 2005).
L’activité protéolytique et lipolytique sont des activités très recherchées dans la sélection des ferments
lactiques pour l’industrie de plusieurs produits laitier et surtout celle des fromages comme rapporte
plusieurs autheurs (Essid et al., 2009 ; Nieto-Arribas et al., 2010). Les lactobacilles isolés du beurre
traditionnel n’ont pas exprimés une activité lipolytique comparés aux lactocoques. Deux souches de
Leuconostoc représentée par la souche B et M5 ont exprimée une activité lipolytique. A ces deux
souches s’ajoute Lactococcus lactis subsp. cremoris A20. Des études faites par Ammor et al., (2005)
confirme nos résultats en trouvant la plupart de leur souches de lactobacilles incapable d’exprimer une
activité lipolytique. De même d’autre travaux arrive à la même conclusion (Kenneally et al., 1998;
Papamaloni et al., 2003)
Conclusion
78
ConclusionLe beurre traditionnel est un produit alimentaire de première nécessité culinaire l’étude de
l’écologie des bactéries lactiques , nous a permis d’isoler, d’identifier et de caractériser 107 souches
dont 52,34% sont des bacilles et 47,66 sont des cocci. La flore la plus dominante est représentée par
les lactobacilles qui trouve dans le produit un environnement acide. Lactobacillus plantarum est
l’espèce la plus dominante avec 28,57% des lactobacilles isolés. Lactobacillus casei subsp.casei est
représenté par 3 souches. Cette souche a été trouvé protéolytique et sa présence dans le beurre
contribue largement à l’élaboration des caractéristiques organoleptiques du beurre comme produit fini.
La méthode traditionnelle est pour grand-chose dans la présélection de ces souches. Les Leuconostoc
sont aussi présente et surtout la sous espèce dextranicum connue pour la production du dextran.
Les bactéries lactiques isolées et identifiée montrent une capacité à inhiber les souches de
Staphylococcus aureus, Escherichia coli. Ces deux souches indésirables sont connues comme
contaminant des produits laitier acidifiés. Deux souches de Leuconostoc représentée par la souche B et
M5 ont exprimée une activité lipolytique. A ces deux souches s’ajoute Lactococcus lactis subsp.
cremoris A20. L’antibiogramme des bactéries lactique, nous montre une sensibilité presque totale de
toutes les souches testées.
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Annexe
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AnnexeLes résultats des interactions bactériennes des souches de bactéries lactiques isolées.