LC/MS/MSを用いた畜水産物中の残留動物用医薬品 …LC/MS/MSを用いた畜水産物中の残留動物用医薬品の一 斉分析法 誌名 食品衛生学雑誌 ISSN

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LC/MS/MSを用いた畜水産物中の残留動物用医薬品の一斉分析法

誌名誌名 食品衛生学雑誌

ISSNISSN 00156426

巻/号巻/号 493

掲載ページ掲載ページ p. 177-188

発行年月発行年月 2008年6月

農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波産学連携支援センターTsukuba Business-Academia Cooperation Support Center, Agriculture, Forestry and Fisheries Research CouncilSecretariat

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]une 2008

報文

LCjMSjMSを用いた畜水産物中の残留動物用医薬品の一斉分析法

(平成 20年 1月21日受理)

野口昭一郎* 寺田久屋 田村征男

Simultaneous Determination of Veterinary Drugs in Livestock Foods and

Seafoods Using Liquid Chromatography jTandem Mass Spectrometry

Shoichiro NOGUCHl*， Hisaya TERADA and Yukio TAMURA

Nagoya City Public Health Research Institute: 1-11 Hagiyama-cho， Mizuho-ku，

Nagoya 467-8615， Japan; * Corresponding author

A simultaneous determination of veterinary drugs in livestock food and seafood using liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LCjMSjMS) was developed. Veterinary drugs were extracted with 95% acetonitrile. The solution was passed through a Florisil column， and the solvent was replaced with phosphate bu仔er. The extract was charged on a Sep-Pak Plus CI8

mini-column and divided into 40% methanol eluate fraction and 70% acetonitrile eluate fraction. Test solutions were analyzed by LCjMSjMS with gradient elution. By using this method， 37 kinds of veterinary drugs were obtained with over 60% recovery， and quantitation was possible in cattle muscle， egg and fish. This method was inapplicable to 28 kinds of veterinary drugs. Although quantitation was not achieved， 42 other kinds of veterinary drugs can be screened. Since the limit of quantitation for this method is less than the provisional limit in general， it is useful as a screening m巴thodin residual analysis of veterinary drugs.

(Received January 21， 2008)

Key words: 動物用医薬品 veterinarydrug;一斉分析 simultaneousdetermination;畜産物 live-stock food;水産物 seafood;固相抽出 solidphase extraction;液体クロマトグラフィー/タンデム

質量分析法 LCjMSjMS

177

緒言

平成 18年 5月29日より施行されたポジティブリス卜

制度により，対象となる農薬，飼料添加物または動物用医

薬品は 800品目を超え，このうち動物用医薬品について

は従来の 33品目から約 250品目に拡大され，簡便かっ高

精度な一斉分析法の開発が求められている.食品中に残留

する動物用医薬品の一斉分析法は，これまでに HPLCを

用いた報告1)-6)が多数ある. しかし， HPLC-UV法では検

出できる感度が低く，ポジティブリスト制度の基準レベル

の対象物を検出することが困難である.試料由来のマト

リックス成分の影響も分析を困難にし，さらなる精製が必

要となる場合がある.また，分離度に問題があり，一度の

分析であまり多くの化合物を分析することができなかっ

た近年の液体クロマトグラフィー/質量分析法 (LC/MS)

および液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法 (LCj

MSjMS)の普及に伴い，高感度かっ高精度な残留分析が

可能となった.また，残留基準値および暫定基準値などが

設定されている動物用医薬品は比較的高極性の化合物が多

く，さらに一律基準よりも低い濃度で基準が設定された品

目もあり，それらの動物用医薬品の効率の良い定量試験お

よび確認試験には， HPLCとMSjMSの使用が不可欠と

言える.

*連絡先

名古屋市衛生研究所:干467-8615名古屋市瑞穂区萩山町

1-11

今回，著者らは畜水産物(牛筋肉，牛脂肪，牛肝臓，豚

筋肉，豚脂肪，豚肝臓，牛乳，鶏卵，魚介類(サケ)およ

びハチミツ)を対象として，前処理にフロリジルオープン

カラムおよびオクタデシルシリカミニカラムにより精製し

てLCjMSjMSを用いて定量する一斉分析法を検討した.

また，同法を用いて市販品の残留実態調査を行ったので併

せて報告する.

実験方法

1.試料

名古屋市内で市販されている牛肉，牛肝臓，牛脂肪，豚

肉，豚脂肪，豚肝臓，牛乳，鶏卵，魚肉(サケ)およびハ

チミツを用いた.試料はミキサーを用いて均一化した.

2. 対象動物用医薬品

Table 1に示したサルファ剤 20品目，キノロン系抗菌

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178 食衛誌 Vol. 49， NO.3

Tab1e 1. Lineup of standard mixture solutions

Mixture Conc.

ID μg/mL Veterinary drugs

Sulfabenzamide， Sulfacetamide， Sulfachlorpyridazine， Sulfadiazine， Sulfadimethoxine， Sulfadimidine， 5.0 Sulfadoxine， Sulfaguanidine， Sulfamerazine， Sulfamethoxazole， Sulfamethoxypyridazine， Sulfamono-

methoxine， Sulfanilamide， Sulfanitran， Sulfapyridine， Sulfaquinoxaline， Sulfathiazole

2 5.0 Albendazole metabolite， Benzocaine， Carprofen， Clopidol， Dinitolmide， Ethopabate， Florfenicol， Lincomycin， Meloxicam， Thiabendazole， Thiabendazole metabolite， Thiamphenicol， Trimethoprim

3 5.0

Bithionol. Famphur， Mebendazole， Melengestrol acetate， Novobiocin， Oleandomycin， Ormetoprim， Oxibendazole， Praziquantel， Pyrimethamine， Tolfenamic acid， Triclabendazole， Triclabendazole metabolite

4 5.0 Diclazuril. Flubendazole， Levamisole， Nicarbazin

5 5.0 2-Acetylamido-5-nitrothiazole， Aklomide， Azaperone， Clorsulon， Ketoprofen， Nifurstyrenic acid， Phoxim， Rifaximin， Robenidine， Tiopronin， Toltrazuril， Xylazine

6 5.0 Amoxicillin， Ampicillin， Benzylpenicillin， Cefapirin， Cefazolin， Cefoperazone， Cefquinome， Cefroxime， Cloxacillin， Dicloxacillin， Nafcillin， Oxacillin， Phenoxymethylpenicillin

7 5.0

Danofloxacin， Difloxacin， Enrofloxacin， Flumequine， Metclopramide， Morantel. Nalidixic acid， Nor日oxacin，Ofloxacin， Olaquindox， Orbifloxacin， Oxolinic acid， Pyrantel， Sarafloxacin， Tiamulin， Tripelennamine

8 5.0 Lasalocid， Mafoprazine， Mirosamicin， Ractopamine， Sulfabromomethazine， Sulfamoyldapsone， Sulfatroxazole， Sulfisozole， Tyrosin

9 5.0

Altrenogest， Brotizolam， Carazolol， Chloramphenicol， Chlormadinone acetate， ClenbuteroI. Dimetridazole， Metronidazole， Norgestomet， Ronidazole， Trenbolone acetate， α-Tren bolone， βーTanbolone，Warfarin， Zeranol

剤 10品目，ホルモン剤 8品目 00種類)， βーラクタム系

抗菌剤 8品目，セフェム系抗菌剤 5品目，寄生虫駆除剤

25品目 (27種類)およびその他の動物用医薬品 32品目

を対象とした.

3. 試薬等

標準品:林純薬工業(株)， Riedel-de Haen社， Sigma-

Aldrich社，和光純薬工業(株)，関東化学(株)製および畜

水産品残留安全協議会頒布品の残留動物薬用もしくは特級

を用いた.

標準原液および混合標準溶液:標準品をメタノール，ア

セトニトリル，エタノールあるいはジメチルホルムアミド

を用いて溶解し，溶解度に応じて 50-1，000μg/mLの濃

度に調製した.混合標準溶液は各標準原液をメタノールで

希釈して Table1に示した9種類の混合標準原液 (各 5.0

μg/mL)を作製した.NO.lから NO.8の混合標準原液

1.0 mLおよび NO.9の混合標準原液 0.1mLを混合し，

メタノールで全量 10.0mLとした溶液を総混合標準液

(各 0.5μg/mL，No. 9は 0.05μg/mL) とし，添加回収試

験および検量線の作成に用いた.

試薬および試液:アセトニトリル，メタノール，ギ酸は

関東化学(株)製高速液体クロマトグラフィー用，ヘキサン

は和光純薬工業(株)製残留農薬 ・PCB試験用ヘキサン

300， リン酸， リン酸ーカリウム， リン酸二カリウムは和

光純薬工業(株)製特級，水は MILLIPORE社製 Milli-Q

超純水製造装置で、精製した水を用いた.

0.2 moljLリン酸緩衝液 (pH5.0): 0.2 moljLリン酸一

カリウム溶液に 0.2moljLリン酸二カリウム溶液を加え，

pHメーターで pH5.0に合わせた.

0.02 moljLリン酸緩衝液 (pH5.0): 0.2 moljLリン酸

緩衝液 (pH5.0)を水で 10倍希釈した.

フロリジル:和光純薬工業(株)製フロリジール PRを加

熱処理による活性化を行わずに用いた.

フロリジルカラム:内径 15mm，長さ 30cmのコック

付きクロマトグラフ管にフロリジール PR8gを活性化処

理を行わずにアセトニトリルに懸濁しながら加え，気泡を

生じないように充てんした.さらに，溶出液が濁らなくな

るまでアセトニトリルを・流して作製した.

Cl8 ミニカラム Waters社製 Sep-PakPlus Cl8を用

いた.使用前に 10mL注射筒に接続し，メタノール 10

mL，水 10mL， 0.2 mol/L リン酸緩衝液 (pH5.0) 2 mL

の順に流して活性化させた.

4.装置

高速液体クロマトグラフ Agilent社製 Agilent1100

シリー ズ，タンデム型質量分析装置 AppliedBiosys-

tems社製 API-3000，超音波洗浄器:BRANSON社製

B42JH-2，遠心分離機: (株)佐久間製作所製 SL-05A，振

とう機:大洋科学工業(株)製 SR-IIw.

5. 測定条件

カラムは Waters社製 AtlantisdCl8 (粒子径 3μm，内

径 2.1mmX 150 mm)を 400

Cで用いた.移動相は A液

にアセトニトリルー水ーギ酸=100:1899:1を， B液にア

セトニトリルー水ーギ酸=1，800 : 199: 1を用いた.グラジ

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June 2008 LC;MS;MSを用いた畜水産物中の残留動物用医薬品の一斉分析法 179

Table 2. LC;MS;MS conditions

Positive

Nebulizer gas (Value) 12 Curtain gas (Value) 10 Collision gas (Value) 5 Ionspray voltage (V) 4.500 Ionspray temperature (OC) 500

Negative

15 8 3

-3，000 500

エン卜条件 B液濃度 o→ 90%(25 min)→ 90% (25→ 35

min)→ 0% (35→ 45 min)→ Stop.流速 0.2mL/min，試

験溶液注入量 10μL，その他の条件を Table2および

Table 3に示した.

6. 添加回収試験

ミキサーで均一に混和した試料 5.0gを 50mLの遠沈

管にひょう量し，総混合標準溶液 100μLを添加してボル

テックスミキサーを用いて均一に混和した.各試料につき

添加試料 5検体および無添加試料 1検体を調製した.調

製試料は分析開始時まで冷凍庫(一200C)で保管した.

7. 試験溶液の調製

通知法*1に準じ， Scheme 1に従い行った.

脂肪以外の試料:試料 5gを 50mLの遠沈管中に精密

に量り， 95%アセトニトリル 30mLを加えてボルテッ

クスミキサーで激しく混和した後，超音波洗浄器中で 10

分間静置して抽出した.遠心分離機に移し， 2，500 rpm

の速度で 5分間遠心分離した.上澄液をフロリジル PRカ

ラムに加え毎分約 10mLの速度で流し，溶出液を集め

た.遠沈管中の残留物に 95%アセトニトリル 30mLを

加え，再度，超音波洗浄器中に 10分間静置後， 2，500

rpmで5分間遠心分離を行い，上澄液を同じフロリジル

カラムに加え，毎分約 10mLの速度で流し，さらにアセ

卜ニトリノレ 30mLを加え同じ速度で流した.溶出液を合

わせて分液漏斗に移し，ヘキサン 100mLを加えて 3分

間振とうしアセ卜ニトリル層を採り， 400Cに加温しな

がら減圧下で溶媒を留去した.残留物に 0.2mol/L リン

酸緩衝液 (pH5.0)を 4mL加え，超音波洗浄器中でかく

はんしながら溶解し，さらに水 6mLを加えてかくはん

した. この溶液を活性化した Sep-PakPlus C18 に加え，

毎分約 2mLの速度で流した.使用した容器を 0.02mol/

L リン酸緩衝液 (pH5.0) 5 mLで洗浄し，洗液を閉じ速

度で Sep-PakPlus C18 に加えた.溶出液を捨てた後，同

じく使用した容器を 40%メタノール 5mLで2回洗浄

し，洗液を閉じ Sep-PakPlus C18 に加え，毎分約 2mL

の速度で流し，溶出液を集めた. 400Cに加温しながら減

圧下で溶媒を留去し，残留物に 5%メタノール 2mLを

加え超音波洗浄器中で溶解し，これを試験溶液A とした.

つづいて，先の容器を 70%アセトニトリル 5mLで2

*1厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知“食品に残留する農薬，飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法について(一部改正)"平成 17年 11月29日，食安発第1129002号 (2005)

回洗浄し，洗液を同じ Sep-PakPlus C18 に加え，毎分約

2 mLの速度で流し，溶出液を集めた. 400

Cに加温しな

がら減圧下で溶媒を留去し，残留物に 35%アセトニトリ

ル 2mLを加え超音波洗浄器中で溶解し，これを試験溶

液 Bとした.

脂肪の試料:試料 5gを共栓付三角フラス コ中に精密

に量り，ヘキサン 30mLを加えて脂肪がほとんど溶解す

るまで振とうした.この液に 95%アセトニトリル 30

mLを加えて 15分間振とうした.アセトニトリル層をフ

ロリジノレカラムに加え毎分約 10mLの速度で流し，溶出

液を集めた.残ったヘキサン層に 95%アセトニトリル

30 mLを加えて 15分間振とうし，アセトニトリル層を

同じフロリジルカラムに加え毎分約 10mLの速度で流し

た.さらにアセ卜ニトリル 30mLをフロリジルカラムに

流し，溶出液を合わせて分液漏斗に移し，ヘキサン 100

mLを加えて 3分間振とうし，アセトニトリル層を採り，

400Cに加温しながら減圧下で溶媒を留去した.以下脂肪

以外の試料と同様な操作を行い試験溶液 Aおよび Bを調

製した.

8. 検量線の作成

総混合標準溶液を 5%メタノールおよび 35%アセト

ニトリルで希釈し， 0.1-100ng/mLに希釈した.それ

ぞれ 10μLを LC/MS/MSに注入し，得られたクロマト

グラムのピーク面積から絶対検量線法により検量線を作成

した.

9. 定 量

試験溶液 Aおよび Bについて，それぞれポジティブ

モードとネガティブモードで測定した.試験溶液 Aおよ

び試験溶液Bそれぞれ 10μLをLC/MS/MSに注入し，

標準品と一致した保持時間に認められたクロマトグラムの

ピーク面積から検量線により定量した.試験溶液 Aに含

まれる動物用医薬品は試験溶液A定量用検量線により，

試験溶液Bに含まれる動物用医薬品は試験溶液B定量用

検量線により定量し， Aおよび B両試験溶液に含まれる

動物用医薬品は各検量線で得られた値の合計を定量値とし

た.

結果および考察

1. LC/MS/MS条件の検討

LC/MS/MSにはエレクトロスプレーイオン化 (ESI)の

インターフェースを用い，標準溶液を 0.05%ギ酸含有

30%アセトニトリルで希釈して MS内にインフュージョ

ンして，ポジティブモードにおいては水素付加イオン [M

+H]+を，ネガティブモードでは脱水素イオン [M-H]ー

をプリカーサーイオンとして設定した.プロダクトイオン

は，感度が高く，爽雑成分による妨害の少ないイオンを 2

つ選択し感度の高いほうのイオンを定量用に，また他方

のイオンを定性用イオンとして設定した.各標準品の

MRM条件を Table3に示した.今回検討した動物用医

薬品のうち，スルファドキシンとスルファジメトキシン，

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180

Table 3. LC/MS/MS parameters of 112 veterinary drugs

食衛誌 Vol. 49， NO.3

(ESI Positive) FP*2

(V)

MRM for quantitation MRM for con自rmation

MRM trace CE判 CXP判 MRMtrace CE判 CXP判

(mlz) (V) (V) (mlz) (V) (V)

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RT (min)

Mol.

wt.

DP本l

(V) Analyte

Sulfaguanidine Sulfanilamide

Amoxicillin

Metronidazole

Sulfacetamide

Olaquindox

Ronidazole Cefapirin

Dimetridazole

Toltrazuril Levamisole

Lincomycin

Sulfadiazine Thiabendazole metabolite

Albendazole metabolite Clopidol

Ampicillin

Thiabendazole

Sulfathiazole Sulfapyridine

Trimethoprim

Pyrantel

Ormetoprim

Sulfamerazine Cefquinome

Norfloxacin Ofloxacin

Danofloxacin Metoclopramide

Azaperone

Enrofloxacin

Ractopamine Xylazin巴

Clen bu terol

Orbifloxacin Sulfadimidine

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1

Morantel

Sarafloxacin

Sulfamethoxypyridazine

Sulfisozole

Aklomide

Difloxacin

Cefazolin Tripelennamine

Cefroxim巴

Sulfamoyldapsone

Pyrimethamine Sulfamonomethoxine

Carazolol

Sulfachlorpyridazine Oxibendazole

Cefoperazone

Sulfadoxine Sulfamethoxazole

Mafoprazine

Oleandomycin Sulfatroxazole

Ceftiofur

Mirosamicin

Oxolinic acid

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1

Page 6

June 2008 LC/MS/MSを用いた畜水産物中の残留動物用医薬品の一斉分析法 181

Table 3. Continued

(ESI Positive)

Analyte RT (min)

DP*l

(V)

FP*2

(V)

MRM for quantitation MRM for confirmation

MRM trace CE判 CXP料 MRMtrace CE*3 CXP制

(m/z) (V) (V) (m/z) (V) (V)

Sulfabenzamide

Ethopabate

Sulfadimethoxine Sulfaquinoxaline

Tiamulin Tyrosin

Benzocaine

Mebendazole

Benzylpenicillin

Flubendazole Nalidixic acid

Robenidine

Flumequine

Phenox ymeth y Ipenici l1i n

Sulfanitran

Sulfabromomethazine

Oxacillin

Fen bendazole βーTrenbolone

α-Tr巴nbolone

Brotizolam

Cloxacillin

Ketoprofen

Nafcillin

Praziquantel

Meloxicam Dic10xacillin

Warfarin

Famphur

Tric1abendazole metabolite Carprof巴n

Rifaximin

Altrenogest

Norgestomet

Trenbolone acetate

Tric1abendazole

Novobiocin

Tolfenamic acid

Chlormadinone acetate

Melengestrol acetate Phoxim

Lasalocid

Mol

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370 311→ 156

320 301→ 156

330 494→ 192

330 917→ 174

330 166→ 138

370 296→264

370 335→ 91 360 314→282

240 233→ 187

350 334→155

250 262→202 310 351→ 160

370 336→ 65

370 357→ 92

300 402→ 160 370 300→ 268

350 271→ 115

370 271→ 115

230 395→ 314

360 437→ 160 220 255→ 105

230 415→ 199

370 313→203

360 352→ 115 370 471→ 160

150 309→ 163

370 326→ 93 370 329→ 168

370 274→ 193

290 786→ 754 220 311→ 227

320 373→313

360 313→253

370 359→274

320 613→189

190 262→209

360 406→346

330 397→337

370 299→129

230 592→337

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14 301 → 108

16 494→ 119 3 917→ 101

12 166→ 77

16 296→ 105

8 335→160 10 314→ 123

16 233→ 159

14 334→ 138

18 262→ 100

14 351→114

6 336→108

8 357→108

12 402→243

16 300→159

10 271→165

10 271 →165 10 395→316

14 437→ 278

8 255→209 16 415→ 171

12 313→ 83

8 352→ 141 14 471→ 161

12 309→251

16 326→299 14 329→105

16 274→228

24 786→ 151 14 311→ 269

10 373→ 271

16 313→ 91

16 359→199

16 613→133

14 262→180

12 406→310

10 397→279

10 299→ 97

10 592→237

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11

8 20

(ESI Negative)

Analyte

RT (min)

DP*l

(V)

FP*2

(V)

MRM for quantitation MRM for confirmation

MRM trace CE判 CXP料 MRMtrace CE判 CXP判

(m/z) (V) (V) (m/z) (V) (V)

Tiopronin

Thiamphenicol Dinitolmide

Florfenicol

2-Acetylamido-5・nitroth iazole Chloramphenicol

Clorsulon

Zeranol

Nifurstyrenic acid

Nicarbazin Dic1azuri1

Bithionol

恥101

wt.

3.2 163.2 -31 -50 162→105 -14

12.4 356.2 -66 -330 354→185 -26 14.7 225.2 -41 -320 224→181 ー 16

15.1 358.2 -46 -320 358→185 -26 15.2 187.2 -36 -310 186→139 -22 15.9 323.1 -56 -250 321→ 152 -26

16.3 380.7 -56 -280 380→344 -16

20.4 322.4 -61 -320 321→277 -32

20.7 259.2 -31 -230 258→ 184 -18

22.6 302.2 -36 -240 301→ 137 -22

23.6 407.6 -31 -150 405→334 -30

26.6 356.1 -56 -180 355→161 -32

7 162→ 87 -18

11 354→ 79 -48 -11 224→181 ー 16

-11 358→119 -42

-7 286→ 96 -32 -5 321→ 257 -16

-7 380→342 -16

7 321→ 175 -20

11 258→ 114 -28

7 301→ 187 -20

15 405→ 334 -26

9 355→ 163 -36

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*1 Dec1ustering potentia1叫 Focusingpotentia1 *3 Col1ision potentia1 料 Col1isioncell exit potentia1

Page 7

182 食衛誌 Vol. 49， NO.3

(A)

Samp1e 5 g

95% Acetonitri1e 30 mL U1trasonication for 10 min Centrifuge at 2，500 rpm for 5 min

A

Residue

95% Acetonitri1e 30 mL U1trasonication for 10 min Centrifuge at 2，500 rpm for 5 min

Acetonitri1e phas巴

F10r吋is剖i1PR co1umn

I Ace印倒toni仙 伽l

Acetoni比tr吋i1ephase

|山xane1∞mL

Acetonitri1e phase

IE叩 rationat 400

C

Residue

0.2 mo1/L Phosphate buffer (pH 5.0) 4 mL

U1trasonication Water 6 mL

Sep-Pak P1us C18* 0.02 mol/L Phosphate buffer (pH 5.0) 5 mL 40% Methano1 10 mL柿

70% Acetonitri1e 10 mL料

70% Acetonitri1e e1uate 40% Methano1 e1uate

|山orationat 400

C I Evaporat…t 400

C

Residue Residue

| … e抗伽山叫tω伽toni…iu1比trasoni比ca抗tiぬon I U1trasoni民cation1

HPLC 10μL (Test solution B) HPLC 10 μL (Test solution A)

(B)

Samp1e 5 g

n-Hexane 30 mL

95% Acetonitri1e 30 mL Shake for 15 min

A

n-Hexane phase

95% Acetonitri1e 30 mL Shake for 15 min

Acetonitrile phase

F1orisi1 PR co1umn

I Ac批M白凶etoni凶山山叫l比k川itri1廿M凶n凶i1叩 m叫L

Acetoni比tri1怜ephase

|山xane1∞mL

Acetonitri1e phase

| 山 ora剖仙山ti加Iω…OαIResidue

0.2 mol/L Phosphate buffer (pH 5.0) 4 mL U1trasonication Water 6 mL

Sep-Pak P1us C18*

0.02 mol/L Phosphate buffer (pH 5.0) 5 mL 40% Methano1 10 mL料

70% Acetonitri1e 10 mL料

70% Acetonitri1e e1uate 40% Methano1 e1uate

I Evaporat … t 400

C I E 刊W叩 pora剖叫山ti山iぬO叩nat

Residue R巴s針idue

|… u1比trasoni民cation I U1trasoni比cation1

HPLC 10μL (Test solution B) HPLC 10 μL (Test solution A)

Scheme 1. Preparation of test solutions from 1ivestock foods and seafoods

(A) Samp1es other than fat， (B) Fat samples

* Activation with 10 mL of methanol， 10 mL of water and 2 mL of 0.2 mol/L phosphate buffer (pH 5目0)糾 Eluentis added by washing the flask in 2 steps.

スJレファモノメ卜キシンとス Jレファメトキシピリダジン，

αートレ ンボ ロンと βートレ ンボ ロンは MRMのプリカ ー

サーイオン，プロダクトイオンの組み合わせが定量用，定

性用ともに同じとなった.このうち αートレンボロンと βー

トレ ンボロ ンは配座異性体であり，近接してカラムより溶

出するため， HPLC条件は α-トレンボロンと β-卜レ ンボ

ロンのピークを分離し うるグラジエントの設定を用いた.

2. 精製方法の検討

2.1 フロリジルによる前処理

食品中の動物用医薬品の分析において，溶媒留去時にお

ける抽出溶液の突沸は作業効率を低下させる原因となる.

畜水産物のアセトニトリル抽出液を減圧濃縮すると，溶媒

の突沸が発生することが多い.そこで，防止策を検討した

結果，フロリジル PRカラムに通過させることにより突沸

が解消されることが判明した.カラム内径 00mm， 15

mmおよび 20mm)およびフ ロリジル PRの量 (5-20

g)について検討を行った結果，内径は 15mm，フロリジ

ルPRは 8gで突沸の防止効果が最適であった.通常，フ

ロリジル PRは農薬分析においては加熱して活性化させて

行われているが，本法においては，加熱活性化させると一

部の動物用医薬品で回収率が低下するため，フロリジル

PRは活性化させずに用いた.

2.2 固相抽出力一トリッジによる精製

食品中の残留動物用医薬品の分析にはさまざまな固相抽

出カートリッジが用いられており 2)-11)，なかで:もシリカ

系2)-4).11)とポリマー系8)-11)は汎用性が高く，多成分一斉

分析に用いられている.そこで，フロリジルカラム通過液

のクリーンアップに使うミニカラムについて，シリカ系の

Sep-Pak Plus CI8とポリマ一系の OasisHLB (60 mg/3

CC， Waters社製)を比較検討した.添加回収試験におい

て OasisHLBは Sep-PakPlus CI8と同等の回収率を示

したが，試料の違いにより，溶出パターンに影響が認めら

れる場合があったため， シリカ系の Sep-PakPlus CI8を

固相抽出のカートリッジに選んだ.また， リン酸緩衝液は

不揮発性の塩であるため，LC/MS/MSに注入する最終溶

液に高濃度で含まれているとイオンソース中で析出して感

Page 8

183 LC/MS/MSを用いた畜水産物中の残留動物用医薬品の一斉分析法June 2008

Recoveries of veterinary drugs spiked Table 4.

(A)

Recovery

Spike (μg/g)

Swine muscle Ca tt1e li ver Cattle fat Cattle muscle Fraction Veterinary drugs

6.3

3.4

4.5 21.4

7目4

14.2

2.8

5.4 18.1

18.6

3.6

7.2 7.1 2.6

33.3

7.2

5.9

6.8

13.9 10.8

21.9 12.7

9.0 7.8

24.5

10.5

22.3

10.9

54.5

5.2

12.9

25.6 14.4

6.0

5.5

3.7 30.7

3.5

9.8

11.3

13.5

4.4

19.8 19.1

14.4

12.0

8.5

28.1 11.7

11.2

17.5

CV Mean

106.2

83.0

74.8 64.7

60.3

100.2

86.5

108.0 114.3

102.1

96.0

81.0 60.0 109.9

37.0

87.4

92.2

81.7

83.8

64.8

113.3

46.9

99.3

53.1

98.0 102.8

50.0

90.6

71.7 106.0

42.2 77.7

50.1

73.2

129.2 74.5

88.7

76.1 129.5

122.0

89.9

108.0

44.2

11.2

62.2

108.6

130.7

106.1

135.3

106.4 77.3

CV

39.6

4.9

4.6

13.0

60.9 12.7

16.3

6.5

17.1

5.0

49.9 10.8

9.1

11.4

11.8

12.7

38.2

22.1

34.7 23.3

7.8

10.8

15.0

5.7

12.6 21.5

10.2

12.4 9.6

3.8 11.6

7.6

7.5

2.9

17.1

22.5

4.0

19.9

7.6

20.9 72.6

22目6

14.1

3.6

6.3

8.3

2.8 24.1

5.9

18.1

13.3 8.1 2.8

4.2

19.8

8.7

18.4

11.2

Mean

70.0

89.6

46.5

25.8

5.4

48.3

95.6 52.3

4.7

104.6

1.3 89.5

47.4

96.5

49.0

95.3

81.9

66.9

39.4

6.8 50.4

30.3

268.6

54目5

35.7 150.1

72.2

33.3 25.7

112.1

56.7 84.4

58.8 68.6

4.7

15.9

50.9

15.1

57.7

77.6

6.5 60.8

54.8

57.4

73.0

70.2

65.6

63.1 79.2

81.4

69.6 74.5

65.6

85.8

76.8 81.4

49.8

58.0

CV

4855720342D47β50264504783711013715β092β415β8292282.51β77559

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4

N

7

9

8

4

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2

1

1

1

1

1

4

4

1

4

1

4

2

2

1

1

1

1

1

2

1

1

1

1

1

1

2

2

Mean

84.6

96.1

59.4

13.2

19.7

44.6

12.1 71.1 3.8

43.5

N/D 4.9

0.4 8.1

61.4

100.0 22.8

24.6

62.5 72.9

87.2 74.7

33.4

89.5

87.1 44.9

21.8

74.2

59.6 72.7

63.8

16.6

79.2

54.1

0.9 52.6

17.4

54.3

11.1

76.2

32.8 63.9

52.3

38.1

49.2

51.8 58.1

57.7

52.6 52.4

50.2 59.3

58.2

26.4

71.1 56.6 50.8

50.6

CV

19.2

4.6

4.6

64.5

14.9

14.7

4.4 3.8 7.3

10.6

18.7

6.0

8.8 26.2

8.1

4.1 24.1

33.3 5.1

3.3

3.9

7.8 19.6

4.1

9.8 6.6

3.9

8.9

1.7

6.8 6.9

26.3

7.6

2.5

19.7

19.8 21.7 11.6 20.4

10.2

23.2

11.7 4.2

4.3 15.8

14.6

7.4 16.3

11.6

9.1

7.4 14.0

9.4

8.5

3.2

17.3

9.0 12.3

Mean

199.4

99.8

59.6

13.2

48.7

46.5

78.5

119.3 45.6

71.8 34.3

96.0

49.2

78.6

62.7

94.5

33.3 27.1

64.5

100.9

110.5

73.7 137.8

76.0

73.9 77.8 106.6

87.4

64.6

95.8 48.8

52.3

79.0

55.8 49.4

110.6

40.0 67.4

34.5

161.9 41.2 50.8 66.0

89.6 74.0

67.4

89.0 68.3

73.4

58.6 89.0

73.8 67.8

69.3

62.8

52.1 64.6

47.2

A

A B

A A A

A B

B

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0.01

0.01

0.01 0.01

0.01

0.01

Aklomide

Albendazole metabolite

Altrenogest

Ampicillin Azaperone

Benzocaine Benzylpenicillin

Brotizolam

Carazolol

Carprofen

Cefapirin

Cefazolin Cefoperazone

Cefroxime

Chlormadinone acetate Clopidol

Cloxacillin

Dicloxacillin

Dimetridazole Ethopabate

Famphur

Flubendazole Ketoprofen

Lasalocid

Levamisole Lincomycin

Mafoprazine

Mebendazole

Melengestrol acetate Meloxicam

Metronidazole

Nafcillin Norgestomet

Novobiocin

Oleandomycin

Ormetoprim

Oxacillin

Oxibendazole Phenoxymethylpenicillin

Praziq uan tel Pyrimethamine

Ronidazole

Sulfabenzamide

Sulfabromomethazine

Sulfachlorpyridazine

Sulfadiazine

Sulfadimethoxine

Sulfadimidine

Sulfadoxine Sulfamerazine

Sulfamethoxazole Sulfamethoxypyridazine

Sulfamonomethoxine Sulfamoyldapsone

Sulfanitran Sulfapyridine

Sulfaquinoxaline

Sulfathiazole

Page 9

184 食衛誌 Vol. 49， No目 3

in livestocks samples and seafoods

(%)

Mean

Swine fat

197.6

76.2

18.8

37.6

41.3

86.1

78.2

56.2

97.5

79.9

60.5

87.2

74.5

73.5

47.5

35.4

92.4

63.4

78.2

154.8

82.0 81.2

90.8

60.2

77.2

21.0

74.4

66.6

23.7

93.4

83.4

63.4

76.8

31.3 61.2

25.9 74.。94.2

54.3

89.4

82.2

106.2

92.2

86.2 96.6

88.2

37.8

55.9

85.8

71.3

CV

34.7

12.0

28.9

33.5

1.9

13.2

20.4

37.9

16.1

52.5

22.4

15.4

41.8

Swine liver 乱ililk

Mean CV Mean Mean

Egg

1.5

63.7 19.6 102.6

100.6 5.7 126.0

63.5

28.0 22.5 24.5

45.6 17.6 91.5

0.1 117.6 48.4

97.9 15.7 53.8

92.8 5.9 128.9

59.4 18.8 87.0

96.8 37.9 90.1

N/D N/D 0.6

124.0 17.5 102.3

72.6 11.2 106.9

96.3 412 6&0

CV

2

2

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1

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1

1

1

1

ー

YF-ndηL

C一回目

24.3

12.2

20.9

20.3

3.6

6.3

10.5

31.8 23.7

7.2

25.2

3.3

23.8

43.3

44.8

14.2

5.8

4.5

36.3

11.8

20.1

2.4 5.9

2.4 5.1

20.7

13.1

3.1

2.2

9.3

5.3

27.6

8.3

17.8

46.9

30.1

15.8

5.8

10.8

8.8

16.2

11.4

10.8

8.0

13.8

5.1

6.8

11.7

Mean

Salmon

3.3

190.3

97.0

52.6

29.2

59.0

43.3

69.2

113.3

75.8

104.9

64.9

111.4

109.7

95.4

45.0

80.0

47.4

17.3

51.0

94.4

102.3

94.0

74.6

94.2

77.5

83.9

88.1

93.2

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83.6

91.0

79.3

CV

24.0

13.7

18.7

15.8

10.1

9.3

19.4

15.4

14.1

23.4

13.1

12目6

11.5

49.4

14.9

4.5

2.9

4.0

7.7

9.3

3.6

27.2

12.5

6.6

4.9

9.0

12.6

6.1

6.5

11.0

27.9

20.9

10.5

30.5

11.7

12.9

15.5

9.6

8.5

7.6

7.9

14.2

10.5

11.2

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21.8

Honey LOQ

(μg/mL)

Mean

3.2

88.3

85.2

50.5

8.4

cv

11.7

11.2

11.3

14.0

11.9

17.3

38.5

17.9

65.6

10.1

19.5

15.2

12.0

24.3

5.6

11.2

12.5

20.2

6.6

2.6

5.5

12.4

26.5

16.0

15.8

29.3

51.0

11.7

7.6

6.8

0.01

0.0001

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8.9

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35.7

13.7

16.1

66.2

10.7 31.9

14.7

10.5

10.1

24.6

17.8

12.7

24.3

16.4

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25.0

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14.3

11.0

14.4

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11.2

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10.9

N/D

15.9

14.3

7.1

7.0

55.2

12.2

17.2

21.0

13.7

19.6

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10.1

14.8

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17.8

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56.6

N/D

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43.1

57.8

77.7

55.0

51.4

31.9

4.8

4.1

6.3

5.8

8.1

Page 10

LCjMSjMSを用いた畜水産物中の残留動物用医薬品の一斉分析法June 2008 185

Table 4.

(A)

Recovery

Spike (μgjg)

Veterinary drugs Fraction Cattle muscle Cattle fat Cattle liver Swine muscl巴

Mcan CV Mean CV Mean CV Mean CV

A 92.8

A 66.6

A+8 65.2

A 27.3 8 51.4

8 65.5 8 91.1

8 129.7

8 73.5

8 44.2

8 91.1 A+8 98.5

8 63.8

A+8 94.5

Sulfatroxazole Sulfisozole

Thiabendazole

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90.0

102.9

91.4

6.6 2.9

7.7

4.2

2.2 19.9

16.1

Thiabendazole m巴tabolite

Tiamulin

Tolfenamic acid

Tren bolone aceta te α-Trenbolone

βTrenbolone

Tricla bendazole 4.9 Triclabendazole metabolite 18.7 Trimethoprim 6.5 Tyrosin

Warfarin 88.7 4.2

(8)

Recovery

Spike (μgjg)

Veterinary drugs Fraction Cattle muscle Cattle fat Swine muscle Cattle liver

Mean CV Mean CV Mean CV Mean CV

2・Acetylamido-5-nitrothiazole 0.01

8ithionol 0.01

Chloramphenicol 0.001 Clorsulon 0.01

Oiclazuril 0.01

Oinitolmide 0.01

Florfenicol 0.01 Nicarbazin 0.01

Nifurstyrenic acid 0.01

Thiamphenicol 0.01

Zeranol 0.001

8 102.8 3.7

8 84.6 3.6

A 121.7 6.7 A 70.9 5.9

8 85.5 5.6 A 93.2 5.5

A 109.5 6.6

8 75.8 6.1 A 54.8 .26.7

A 118.1 11.4

A+8 83.0 12.7

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91.7

118.6 104.3

104.5

58.5 112.3

82.7

80.6 136.1

91.9

4.3

6.9

10.6 5.2

2.4 12.5

6.6 6.3

9.5

9.8 7.7

(A) ESI positive mode. (8) ESI negative mode

N /0 means not detected

- means not tested

n=5

度の低下の原因となる. Sep-Pak Plus CI8への保持を保

ちつつ，リン酸塩を減少させるため，試料溶液の Sep-

Pak Plus CI8への負荷後の洗浄には 0.02mol/L リン酸

緩衝液 (pH5.0)を用いた.溶出条件はまず 40%メタノー

ルで高極性動物用医薬品を溶出させ，次いで 70%アセト

ニトリルで‘低極性動物用医薬品を溶出させる分割抽出とし

た.第 1フラク ションの溶出溶媒濃度を 40%メタノール

にすることで，フラクション聞にまたがって溶出する動物

用医薬品が一番少なくなった.また，メタノールはアセト

ニトリルに比べて溶出力が弱いため12)，第 lフラクショ

ン溶媒をメタノール水溶液にすることで，高極性動物用医

薬品を効率的に溶出させ，かっ溶出液中に低極性の爽雑成

分が少なくなった.しかし，第 2フラク ションにメタ

ノール水溶液を用いると，酢酸卜レンボロンなど，一部の

低極性動物用医薬品がメタノール濃度を濃くしても完全に

は溶出しないが，アセ卜ニトリル水溶液を用いるとカート

リッジより速やかに溶出 した爽雑成分をカートリ ッジに

保持させた状態で目的の動物用医薬品を完全に溶出させる

ために，第 2フラクションは 70%アセトニトリルとし

た.また，動物用医薬品は，水溶性の高いものから低いも

のまで幅広く，試験溶液の溶出溶媒が単一組成の場合，完

全に溶解しないものやピーク形状がよくないものが存在す

ることがある. したがって，溶媒は動物用医薬品が完全に

溶け，かっ HPLCのピーク形状に影響を及ぼさない組成

を選択しなければならない.そこで，第 lフラクション

で溶出した動物用医薬品は 5%メタノール水溶液で，第

2フラクションで溶出した動物用医薬品は 35%アセ卜ニ

トリル水溶液で、溶解させた.

3. 検量線

検量線は， 1-75 ngjmLの範囲で原点を通る直線性を

Page 11

186 食衛誌 Vol. 49， NO.3

Continued

(%)

Swine fat Swine liver

Mean CV Mean CV Mean

Milk

93.6 13.1 70.1 71.8 5.1 65.4 44.8 19.3 42.7 149.2 15.2 108.8 76.7 11.4 0.9 91.2 13.6 103.4 80.5 14.6 84.8 55.3 12.1 70.1 88.2 25.2 65.4 113.5 16.0 119.9

92.8 12.3 102.3

94.6 78.4

14.4 100.9 15.7 103.5 19.0 65.6 14.4 189.8 46.9 102.4 3.7 107.8 5.1 101.1 14.4 90目315.7 122目68.1 98.8

104.3 4.9 105.3

CV

2.4 3.2

Egg

Mean

84.4 72.5

5.1 105.5 5.3 10.1 79.5 7.3 38.5 63.6 18.9 12.7 173.6 7.8 3.2 97.5 7.0

12.0 116.3 10.6 4.7 98.6 10.4 6.0 89.2 2.4 13.1 91.1 13.5 4.7 100.1 8.2 3.5 109.7 3.6 7.7 116.4 9.1

Salmon

CV

1.2

3.0

恥1ean CV

Honey LOQ

(μg/mL)

43.3 7.5 27.2 34.8

Mean CV

81.1 10.2 0.0003 61.8 10.2 0.001

QU

4

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3

3

7

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2

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5

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1

1

1

1

Swine fat Swine liver

(%)

Mean CV Mean CV

Honey

Mean CV

101.5 1.0 23.9 6~7 17.5 87.4 106.6 6.5 35.4 85.4 7.3 76.8 107.0 13.8 97.0 91.0 5.1 10.6 108.0 6目4 108.6 85.6 13.9 36.2 91.8 16.1 26.2 111.0 7.0 113.9 106.9 10.0 79.0

Milk

Mean CV

8.6 75.3 2.4 31.3 14.2 162.4 3.5 73.9 3.1 99.0 16.5 89.7 4.8 109.8 9.1 87.8 13.9 36.1 7.3 63.3

14.4 110.7

Egg

Mean' CV

4.2 100.6 2.6 14.6 81.4 3.6

2.8 97.4 10.9 3.4 79.0 17.1 2.7 91.6 3.0 3.3 111.6 4.1 3.9 92.2 3.5 2.9 89.0 3.8 10.2 97.1 5.3 8.6 87.9 2.5 2.2 84.2 9.9

Salmon

Mean CV

103.8 2.2 74.2 16.7

97.4 8.7 101.4 10.4

86.3 3.2 109.1 8.1 106.5 4.6 90.0 1.9 107.8 8.3 93.8 8.5 105.5 3.6

LOQ (μg/mL)

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1

1

1

1

示し，決定係数R2は0.9854-0.9998であった.また，

一律基準値(試料濃度として 0.01μg/g)を下回る基準値

が設定された動物用医薬品については 0.1-10ng/mLの

範囲で原点を通る直線性を示し，R2は0.9965-0.9998

であった.

4. 添加回収試験

総混合標準溶液を試料に対して 0.01μg/gとなるよう

に添加(基準値が一律基準より低く設定された動物用医薬

品ならびに不検出基準の動物用医薬品に関しては 0.001

μg/g) して行った回収試験の結果を Table4に示した.

本法を用いて，検査件数の多い牛筋肉，鶏卵，魚介類を対

象にした 0.01μg/g以下の添加回収試験を行ったところ，

回収率 60-120%，相対標準偏差 25%未満を満たした動

物用医薬品は 37品目で，ポジティブモードで 28品目

(A溶液 19品目， B溶液 9品目)，ネガティプモードで 9

品目 (A溶液4品目， B溶液 5品目)の一斉分析が可能

であった.このほかの 42品目の動物用医薬品は， 60%

未満もしくは 120%以上の回収率だが定量下限が十分低

く，定性が可能であるため，スクリ ーニ ング法としての適

用が可能であった.

各動物用医薬品の牛筋肉における定量下限値 (S/N=10)

を Table4に示した.定量下限値はほとんどの動物用医

薬品で基準値を下回り，十分な定量性が得られた.

キノロン系抗菌剤はフロリ ジルに吸着するため，すべて

のキノロ ン系抗菌剤は全く検出できなかった.また，

95%アセトニトリル抽出液をフロリジルカラムに通さず

に精製を行ってもキノロン系抗菌剤は Sep-PakPlus C18

より溶出しなかった.一方，スルファグアニジンをはじめ

一部のサルフ ァ剤は極性が高く ，Sep-Pak Plus C18カー

トリ ッジで保持できずにカー トリッジより漏出するため回

Page 12

]une 2008 LC/MS/MSを用いた畜水産物中の残留動物用医薬品の一斉分析法 187

Table 5. Veterinary drugs which can be analyzed quantitatively and those which can not

Albendazole metabolite. Benzylpenicillin. Brotizolam. Carprofen. Clopidol. Ethopabate. Famphur. Flubendazole. Lasalocid. Levamisole. Mebendazole. Melengestrol acetate. Meloxicam. Norgestomet. Oxibendazole.

Quantitative analysis is possible* in cattle Sulfabenzamide. Sulfachlorpyridazine. Sulfadiazine. Sulfadimethoxine. muscle. egg and fish Sulfadimidine， Sulfadoxine， Sulfamethoxazole， Sulfamethoxypyridazine，

Sulfamonomethoxine， Sulfanitran， Sulfaquinoxaline， Trimethoprim， Tyrosin， 2-Acetylamido-5-nitrothiazole. Bithionol， Clorsulon， Diclazuril， Dinitolmide. Florfenicol， Nicarbazin， Thiamphenicol， Zeranol

Enroftoxacin， Oxolinic acid， Oftoxacin， Olaquindox， Orbiftoxacin， Xylazine，

No recovery Saraftoxacin， Diftoxacin， Danoftoxacin， Tiopronin， Tripelennamine， Nalidixic acid， Norftoxacin， Pyrantel， Flumequine， Metclopramide， Morantel

Leakage from SPE cartridge

Inapplicable I Low recovery or low reproductivity

Sulfaguanidine， Sulfacetamide， Sulfanilamide

Amoxicillin. Mirosamicin， Rifaximin. Robenidine

Low sensitivity Toltrazuril

Spike volume is under LOQ Clenbuterol

High matrix effect Phoxim， Ractopamine

* 60%孟Recovery壬120%and CV三五25%

収できなかった.検討した 107品目の動物用医薬品のう

ち， 28品目が回収できないなどの理由で本法を適用でき

なかった. Table 5に定量可能， もしくは適用不可となっ

た動物用医薬品を示した.

5. 実 態調査

本法を用いて市販品の牛肉，牛肝臓，牛脂肪，豚肉，豚

脂肪，豚肝臓，牛乳，鶏卵，魚肉(サケ)およびハチミツ

をそれぞれ 3検体ずつ購入し，残留実態調査を行った.

その結果，豚肝臓 l検体よりクマリン系殺鼠剤であるワ

ルファリンが 0.037μg/g検出されたため，確認試験とし

て Table3の確認試験用の MRMノfラメーターを用いて

定量し，さらに定量用イオンと確認用イオンのイオン比の

比較を標準品と検体間で行い，ワルファリンであることを

確認した.

6. 本法の選択性

ブランク試料における妨害ピークの確認を行った.本法

で分析したところ，各動物用医薬品の保持時間の近傍に試

料マトリックス由来のピークはシグナルレベルでは確認さ

れなかった.

まと め

107品目の動物用医薬品について一斉分析法を検討し

た.

1. 本法を用いた牛筋肉，鶏卵，魚介類への添加回収試

験で定量可能な動物用医薬品は 37品目であった.

2. 28品目の動物用医薬品は本法を適用できなかった.

また，残りの 42品目の動物用医薬品について，本法はス

クリーニング法として有用である.

3. 検量線は 1-100ngjmLの範囲(低濃度基準およ

び不検出基準の品目については 0.1-10ngjmL)でおお

むね良好な直線性が得られた.定量が可能であった品目の

うち，感度が低い数品目を除き，定量下限が基準値を下回

り，高感度な定量が可能であった.

4. フロリジルオープンカラムを前処理に用いること

で，溶蝶留去時の突沸を防ぐことができ，前処理の効率化

が可能となった.

5. 本法を用いて畜水産物中の残留動物用医薬品の実態

調査を行ったところ，豚肝臓 l検体よりワルファリンが

検出された.

なお，本研究の要旨は日本食品衛生学会第四回学術講

演会および第 94回学術講演会において発表した.

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