LAPORAN RESMI
ISOLASI MIKROORGANISME DARI SUATU CAMPURAN, UJI BIOKIMIA, DAN
UJI HIDROLISAI. Tujuan
I.1 Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mempelajari isolasi
mikroorganisme dari suatu campuran dengan teknik cawan gores dan
cawan tuang.I.2 Uji Biokimia (Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP
Test))Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mempelajari dihasilkan
atau tidaknya asam organik oleh suatu mikroorganisme.I.3 Uji
Hidrolisa (Hidrolisa Gelatin)Tujuan dari percobaan ini adalah untuk
menentukan jenis mikroorganisme yang memiliki enzim gelatinase,
yakni eksoenzim yang mempunyai kemampuan menguraikan gelatin
menjadi asam amino.II. Pengamatan
II.1 Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran
II.1.1 Metode Cawan GoresTabel II.1 Hasil Pengamatan Isolasi
Mikroorganisme dari Suatu Campuran dengan Metode Cawan Gores pada
Media NBA Setelah 24 JamBentuk koloni dilihat dari:Hasil
Pengamatan
Sektor 0Sektor ISektor IISektor III
Atas keseluruhan
Atas tepi
Permukaan (samping)
Keterangan:
Warna
Diameter
KepekatanPutih susu4,5 cmSedikit pekatPutih susu
1,9 cm
Sedikit pekatPutih susu
0,6 cm
Sedikit pekatPutih susu
0,5 cm
Sedikit pekat
Tabel II.2 Hasil Pengamatan Isolasi Mikroorganisme dari Suatu
Campuran dengan Metode Cawan Gores pada Media NBA Setelah 48
Jam
Bentuk koloni dilihat dari:Hasil Pengamatan
Sektor 0Sektor ISektor IISektor III
Atas keseluruhan
Atas tepi
Keterangan:
Warna
Diameter
KepekatanPutih susu4,5 cmPekat putihPutih susu
2,1 cm
Pekat putihPutih susu
0,9 cm
Pekat putihPutih susu
0,8 cm
Pekat putih
II.1.2 Metode Cawan TuangTabel II.3 Hasil Pengamatan Isolasi
Mikroorganisme dari Suatu Campuran dengan Metode Cawan Tuang pada
Media PDA Setelah 24 JamBentuk koloni dilihat dari:Hasil
Pengamatan
Petridish 1Petridish 2Petridish 3
Atas keseluruhan
Keterangan:
Warna
Diameter
KepekatanPutih agak bening4,1 cmTidak pekatPutih agak bening
2,6 cm
Tidak pekatPutih agak bening
2,2 cm
Tidak pekat
Tabel II.4 Hasil Pengamatan Isolasi Mikroorganisme dari Suatu
Campuran dengan Metode Cawan Tuang pada Media PDA Setelah 48
Jam
Bentuk koloni dilihat dari:Hasil Pengamatan
Petridish 1Petridish 2Petridish 3
Atas keseluruhan
Atas tepi
Keterangan:
Warna
Diameter
KepekatanPutih susu8,9 cmAgak pekatPutih
5,6 cm
Agak pekatPutih
4,2 cm
Agak pekat
II.2 Uji Biokimia (Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP
Test))Tabel II.5 Hasil Pengamatan Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer
(MR-VP Test) Setelah 24 JamNama MikroorganismeUji Methyl-RedUji
Voges-Proskauer
Rhyzopus oligosporus
KeteranganPositif (+)
Negatif (-)
Tabel II.6 Hasil Pengamatan Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer
(MR-VP Test) Setelah 48 JamNama MikroorganismeUji Methyl-RedUji
Voges-Proskauer
Rhyzopus oligosporus
KeteranganPositif (+)
Negatif (-)
II.3 Uji Hidrolisa (Hidrolisa Gelatin)Tabel II.8 Hasil
Pengamatan Uji Gelatin pada Media Gelatin Cair Setelah 48 JamJenis
UjiHasil PengamatanKeterangan
Uji Hidrolisa GelatinBlanko (+)
III.1 Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran
Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari isolasi mikroorganisme
dari suatu campuran dengan teknik cawan gores dan cawan tuang.
Dalam percobaan yang telah dilakukan, terdapat 2 jenis biakan
campuran yang digunakan, untuk metode cawan gores digunakan
campuran bakteri Bacillus subtilis dan Zymomonas mobilis dan untuk
metode cawan tuang digunakan campuran jamur Aspergillus niger,
Thiobacillus harzianum dan Rizhopus oligosporus.
Dalam melakukan isolasi, media yang digunakan adalah Potato
Dextrose Agar (PDA) dan Nutrient Broth Agar (NBA). PDA terdiri dari
sari kentang yang sangat mendukung pertumbuhan mikroorganisme jenis
jamur. Bentuk dari PDA yang digunakan sebagai agar awal mulanya
adalah padatan yang kemudian dicairkan, namun ketika dituangkan ke
petridish maka dalam beberapa menit media PDA akan memadat.
(http://www.neogen.com/)
PDA memiliki komposisi dalam pembuatannya, menurut literatur PDA
mengandung(dalam takaran massa) 200 g infusi kentang, 20 g
dextrosa, 20 g agar, dan 1 lt air distilasi. Medium tidak boleh di
lelehkan lebih dari satu kali. Dan diketahui bahwa PDA memiliki pH
pada kisaran 5,6 0,2.
(http://www.fda.gov/)
NBA merupakan media yang sangat cocok untuk budidaya bakteri,
karena bakteri yang memerlukan nutrient yang terdapat dalam NBA.
Oleh sebab itu, media ini banyak digunakan dalam pemeliharaan
kultur bakteri selain itu, media NBA berguna sebagai media
pembelajaran. Komposisi dari NBA terdiri dari bubuk campuran pepton
yang telah di dehidrasi, ekstrak daging sapi, dan natrium klorida.
(http://www.mastgrp.com/)
Penggunaan media agar sebagai media tumbuh mikroorganisme dalam
percobaan ini dikarenakan oleh beberapa hal, yaitu karena agar
tidak dapat diuraikan oleh hampir semua jenis mikroorganisme, agar
tetap berbentuk padat pada kisaran suhu inkubasi yang luas
(0-80oC), dan agar mencair pada titik didih air, tetapi tidak
segera memadat pada suhu pendingan 42oC. Hal ini memungkinkan
pembuatan suspensi biakan pada suhu 45oC untuk tujuan pengenceran
biakan dan isolasi mikroorganisme. (Hendrianie, 2001, hal 5-8)
Proses yang harus dilakukan sebelum memasukkan media agar pada
tabung reaksi dan petridish, merupakan proses sterilisasi. Proses
sterilisasi ini di lakukan dalam alat sterilisasi, yakni autoclave.
Tabung reaksi dan petridish dicuci terlebih dahulu dan dikeringkan
sebelum memasuki autoclave, hal ini dilakukan untuk mengurangi
terdapatnya kontaminan dalam media kultur mikroorganisme. Sebelum
memasuki autoclave, petridish dibungkus dengan kertas warna coklat.
Tujuan membungkus kertas coklat adalah mengurangi potensi
kontaminasi saat melakukan sterilisasi. Bagian kertas yang yang
bertekstur licin diletakkan pada sisi luar, karena bagian yang
licin ini mengandung lapisan lilin yang dapat menghalangi uap air
dari autoclave untuk masuk ke dalam petridish. Sedangkan untuk
tabung reaksi, disumbat dengan menggunakan kapas. Setelah itu,
tabung reaksi dan petridish dimasukan ke dalam autoclave untuk
disterilisasi. Proses sterilisasi ini dilakukan dengan menggunakan
suhu sebesar 121oC selama kurun waktu 15 menit. Yang dimaksud
dengan proses sterilisasi, merupakan suatu usaha untuk membebaskan
alat-alat dan bahan-bahan dari segala macam bentuk kehidupan,
terutama mikroba, sehingga dalam sterilisasi nanti alat-alat tidak
terkontaminasi dengan pihak luar (kontaminan). Kondisi saat
memasukkan petridish ke dalam autoclave selama 15 menit dengan suhu
121oC dan tekanan 15 psi atau 0,01 mPa dapat membunuh semua
organisme sehingga alat dalam keadaan bersih dan steril dan
akhirnya tidak terdapat kontaminan yang berdampak pada
pengamatan.(Tortora, 2010, halaman 188)
Percobaan isolasi mikroorganisme dari suatu campuran ini
dilakukan dengan 2 metode, yakni metoda cawan gores, dan cawan
tuang. Selanjutnya adalah pembahasan tentang metode cawan gores dan
cawang tuang.II.1.1 Metode Cawan Gores
Yang dimaksud dengan metode cawan gores, merupakan metode yang
dilakukan dengan cara mengencerkan biakan campuran hingga setiap
individu spesies dapat dipisahkan, sehingga setiap koloni yang
terbentuk merupakan hasil dari pembelahan satu sel, kemudian
menggoreskan pada permukaan media agar, mulai dari sektor 0 hingga
sektor 3. Hal pertama yang dilakukan untuk melakukan isolasi
mikroorganisme dengan metode cawan gores adalah membagi bagian pada
petridish menjadi empat sektor. Sektor 0 sebagai sektor yang
digores pertama kali dengan sample biakan campuran. Sektor 1
merupakan bagian/sektor goresan mikroorganisme yang berasal dari
goresan sektor 0. Sektor 2 sebagai sektor goresan mikroorganisme
yang berasal dari goresan sektor 1 dan begitu juga sektor 3 sebagai
sektor goresan mikroorganisme yang berasal dari sektor 2. Pembagian
kuadran sektor 0 hingga sektor 3 pada petridish dapat di gambarkan
sebagai berikut:
Gambar III.1 kuadran sektor pada petridish
Petridish yang sudah dibagi menjadi 4 sektor kemudian melalui
proses sterilisasi. Setelah proses sterilisasi dilakukan, maka
langkah selanjutnya adalah memasukan media NBA (Nutrient Broth
Agar) pada petridish. Media NBA digunakan untuk mengisolasi
campuran bakteri Bacillus subtilis dan Zymomonas mobilis.
Selanjutnya melakukan inokulasi mikroorganisme yang dilakukan di
dalam incase. Incase merupakan suatu ruangan yang di design
tertutup untuk melakukan inokulasi sehingga faktor kontaminan dari
lingkungan luar dapat di minimalisir, karena incase bersifat
tertutup dari lingkungan luar. Incase biasa disebut dengan
anaerobic chamber, yang merupakan ruangan tertutup yang hanya bisa
digunakan dengan peng-oprasian menggunakan tangan pada tempat
operasional.(Pelczar, 2007, halaman 111)Di dalam incase terdapat
biakan induk mikroorganisme, api spirtus, kawat ose. Penggunaan
kawat ose memiliki fungsi sebagai alat untuk memindahkan
mikroorganisme dari media lama ke dalam media baru yang lebih
steril, dengan menggunakan teknik aseptik. Fungsi dari penggunaan
teknik aseptik dalam meng-inokulasi mikroorganisme ini adalah untuk
mencegah adanya kontaminasi terhadap mikroorganisme yang akan
menjadi objek penelitian. Selain itu, juga untuk mencegah
kontaminasi terhadap ruang serta para praktikan yang sedang
meneliti.
(htttp://www.biolabs.tmcc.edu/)Sebelum memindahkan biakan yang
akan di inokulasikan, kawat ose dipijarkan terlebih dahulu di atas
api spirtus hingga berwarna merah membara. Tujuan dari pemijaran
kawat ose ini adalah sterilisasi kawat ose yang akan digunakan.
Tetapi jangan memasukkan kawat ose dalam keadaan masih panas
memijar, karena dikhawatirkan akan mengakibatkan mikroorganisme
yang diinokulasikan telah terbunuh akibat panas yang dibawa oleh
kawat ose yang tengah berpijar.
Dalam proses inokulasi, hal pertama yang dilakukan pada media
NBA adalah dengan menggoreskan kawat ose yang telah berisi campuran
biakan bakteri Bacillus subtilis dan Zymomonas mobilis dari sektor
0. Kemudian meneruskan goresan dari sektor 0 dan meneruskan
inokulasi (dengan menggoreskan) hingga ke sektor 1. Begitu
seterusnya, hingga goresan telah sampai ke sektor 3. Dengan
catatan, setiap akan berpindah ke lain sektor, kawat ose harus di
sterilisasi terlebih dahulu dengan menggunakan metode aseptik.
Tujuan dari metode penggoresan secara berkala dan berkesinambungan
ini adalah untuk mengencerkan biakan campuran hingga setiap
individu spesies dapat dipisahkan, dan setiap koloni yang terbentuk
merupakan hasil dari pembelahan satu sel induk. Inokulasi dilakukan
dengan cara menggoreskan kawat ose yang berisi biakan, dengan
menggunakan pola zig-zag agar permukaan yang di gores lebih luas.
Ada beberapa teknik penggoresan, yaitu quadrant streak, radiant
streak, T streak, dan continuous streak. Teknik penggoresan yang
digunakan pada percobaan ini menyerupai teknik T streak. Isolasi
sendiri pada dasarnya dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan
biakan murni dimana isolasi bakteri menggunakan metode media cawan
membentuk koloni pada media padat sehingga mudah diisolasi dengan
cara menyebarkan sel-sel tersebut pada agar cawan sehingga timbul
koloni-koloni yang terpisah. Koloni adalah sejumlah besar sel
bakteri dalam medium solid, yang dapat dilihat secara kasat mata.
Dalam prosedur ini, sebuah asumsi bahwa koloni merupakan keturunan
dari satu sel dan me-representasikan sebuah clone dari biakan
murni. Setelah inkubasi, bentuk umum dari koloni dan bentuk bagian
ujung dari koloni dapat diperoleh dengan cara melihatnya dari
bagian atas. Setelah koloni yang telah terisolasi dengan baik dapat
ditemukan, maka dapat dipindahkan ke dalam media baru untuk
mendapatkan biakan murni(Prescott, 2002, halaman 94)Keuntungan dari
metode cawan gores adalah praktis, hemat biaya dan waktu, serta
hanya membutuhkan keterampilan. Kesalahan-kesalahan yang umum
dilakukan dalam metode ini, antara lain: 1. Tidak memanfaatkan
permukaan medium untuk digores sehingga pengenceran kurang
optimal.2. Penggunaan inokulum yang terlalau banyak sehingga
menyulitkan pemisahan sel waktu
digores.(http://repository.usu.ac.id/)
Langkah berikutnya yaitu melakukan inkubasi di dalam inkubator.
Namun sebelumnya, petridish dibungkus kembali dengan kertas warna
coklat. Kemudian memasukkan semua hasil inokulasi ke dalam
inkubator. Proses inkubasi dilakukan selama 24 jam dan 48 jam pada
suhu kamar karena pada suhu 300 ini merupakan suhu optimum dalam
pertumbuhan mikroorganisme. Di dalam inkubator, petridish
diletakkan dengan posisi terbalik. Hal ini bertujuan untuk mencegah
terjadinya kondensasi dari media di dalam petridish, sehingga dapat
menyebabkan uap air turun ke media dan pada akhirnya mengakibatkan
terbatasnya pergerakan koloni di dalam media mikroorganisme yang
dapat merusak bakteri.(Tortora, 2010, halaman 158)
Pengamatan pertama dilakukan 24 jam setelah proses inkubasi
berlangsung. Dari hasil percobaan yang telah dilakukan, didapatkan
koloni mikroorganisme pada sektor 0, sektor 1, sektor 2, dan sektor
3. Pada sektor 0 terlihat bakteri dengan warna putih susu dan
sedikit pekat dengan diameter sekitar 4,5 cm. Untuk sektor 1,
koloni bakteri yang tumbuh terlihat lebih sedikit bila dibandingkan
dengan sektor 0. Koloni yang tumbuh berwarna putih tulang dan pekat
dengan diameter sekitar 1,9 cm sedangkan pada sektor 2 ditemukan
sedikit koloni bakteri bila dibandingkan dengan sektor 0 dan 1
dengan warna putih susu, sedikit pekat dan diameter sekitar 0,6 cm.
Sedangkan untuk sektor 3 didapatkan sedikit bakteri berwarna putih
susu, sedikit pekat dengan diameter 0,5 cm. Hal ini wajar terjadi,
karena yang diinokulasikan pada sektor 0 adalah berasal dari
campuran suspensi biakan yang diberikan, sedangkan pada sektor 1
merupakan inokulasi berasal dari sektor 0, sektor 2 merupakan hasil
inokukasi dari sektor 1, dan sektor 3 merupakan inokulasi dari
sektor 2.Pada pengamatan kedua yaitu 48 jam menunjukkan adanya
pertumbuhan koloni. Hal ini terlihat dengan semakin bertambahnya
diameter koloni di masing-masing sektor. Pada sektor 0 yang semula
diameternya 4,5 cm tetap menjadi 4,5 cm, dan pada sektor 1 yang
semula 1,9 cm menjadi 2,1 cm, pada sektor 2 yang semula 0,6 cm
menjadi 0,9 cm dan pada sektor 3 yang semula diameternya 0,5 cm
menjadi 0,8 cm. Hal ini sesuai dengan literatur yang menyebutkan
bahwa setelah diinkubasi, sel-sel individu akan tumbuh memperbanyak
diri hingga membentuk koloni. Tetapi untuk ukuran dari bakteri
sendiri tidak membesar, karena pertumbuhan dari bakteri itu sendiri
adalah pertumbuhan secara eksponensial yang membelah semakin banyak
bukan bertumbuh menjadi besar. Hal ini menunjukkan bahwa terjadi
peningkatan populasi bakteri yang cukup signifikan dalam kurun
waktu 48 jam setelah pembiakan. Pada saat dilihat dari permukaan
samping bentuk koloni terlihat seperti lingkaran dan tepinya
berbentuk seperti setengah bola dan hampir di semua sektor bentuk
koloninya seperti yang disebutkan diatas. Terbentuknya massa sel
yang dapat dilihat oleh mata telanjang dinamakan koloni. Setiap
koloni yang berlainan dapat mewakili macam organisme yang
berbeda-beda. Setiap koloni merupakan biakan murni satu macam
mikroorganisme.
(Pelczar, 2008, halaman 135-136)
Berdasarkan pengamatan yang telah dilakukan maka dapat diketahui
bahwa bakteri yang tumbuh pada sektor 3 merupakan sektor yang
ditumbuhi kultur murni. Bila dilihat dari literatur mengenai
morfologi dan ciri-ciri lain dari mikroorganisme suspensi campuran
Bacillus subtilis dan Zymomonas mobilis, maka untuk bakteri yang
terisolasi pada cawan gores di sektor 3 lebih mengarah ke bakteri
Bacillus subtilis. Dimana menyebutkan pada media agar koloni
Bacillus subtilis tumbuh dengan warna putih agak pekat sampai
kekuningan suram sedangkan untuk bakteri Escherichia coli, pada
media agar tumbuh koloni dengan warna putih kekuningan cerah.
Selain itu, Bacillus subtilis memiliki ciri-ciri dapat ditumbuhkan
pada media agar, berbentuk sel batang pendek dan merupakan bakteri
gram positif bersifat aerobik.
(Madigan, 2012, halaman 759)
Gambar III.2 Hasil isolasi Bacillus subtilis
(http://imgkid.com/) Gambar III.3 Hasil isolasi campuran A pada
percobaan
III.1.2 Metode Cawan Tuang
Metode cawan tuang merupakan teknik lain dalam tujuan yang sama
seperti metode cawan gores, yakni mendapatkan koloni murni
mikroorganisme. Kelemahan metode ini adalah membutuhkan waktu dan
bahan yang lama dan banyak, akan tetapi tidak memerlukan
keterampilan tinggi. Biakan campuran diencerkan dengan menggunakan
medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan. Pengenceran
dilakukan dalam beberapa tahap hingga diperoleh koloni
tunggal.(http://repository.usu.ac.id/)Seperti halnya pada metode
cawan gores, dalam cawan tuang ini sebelum melakukan inokulasi,
maka perlu dilakukan proses sterilisasi petridish, tabung reaksi,
serta media terlebih dahulu. Dengan tujuan untuk menghindari
kontaminasi mikroorganisme yang tidak diinginkan, hal ini dilakukan
dengan cara memasukkan ke dalam autoclave pada suhu 1210C selama 15
menit. Selanjutnya memasukkan media PDA kurang lebih 1/2 ml pada
tabung reaksi yang telah ditandai dengan angka 1, 2, dan 3.
Kemudian menginokulasikan biakan suspensi campuran mikroorganisme
Aspergillus niger, Thiobacillus harzianum dan Rizhopus oligosporus
ke dalam tabung reaksi 1, yang dilakukan dengan menggunakan teknik
aseptik di dalam incase. Kemudian mengocok tabung reaksi 1 perlahan
dengan cara memuntir-nya agar campuran biakan mikroorganisme
tersebar merata dalam larutan media (homogen), lalu
menginokulasikan biakan campuran dari tabung reaksi 1 ke tabung
reaksi 2. Sementara itu, sisa inokulasi pada tabung 1 dituangkan ke
dalam petridish 1. Selanjutnya, setelah tabung reaksi 2 tercampur
rata dengan cara mengocok tabung reaksi 2, kemudian
menginokulasikan tabung 2 tersebut ke dalam tabung reaksi 3.
Sementara itu, sisa inokulasi pada tabung 2 dituangkan ke dalam
petridish 2. Kemudian hasil inokulasi pada tabung 3 di kocok agar
tercampur rata lalu dituangkan langsung ke petridish 3. Setiap
menginokulasi, hal yang perlu diperhatikan adalah memijarkan kawat
ose terlebih dahulu untuk mengurangi kontaminasi oleh
mikroorganisme yang tidak diinginkan. Pengocokan tabung reaksi
yaitu dengan cara memutarnya diantara kedua telapak tangan dengan
perlahan, hal ini dimaksudkan agar tidak mengenai kapas penyumbat
karena akan menyebabkan terkontaminasinya biakan mikroorganisme
sehingga dapat mengurangi populasi sesungguhnya dari
mikroorganisme, dan juga agar tidak timbul gelembung-gelembung
udara pada media agar. Sebab beberapa mikroorganisme membutuhkan
oksigen bebas dalam pertumbuhannya, sedangkan yang lain dihambat
oleh oksigen. Karena alasan inilah maka kondisi media tumbuh harus
disesuaikan sedemikian, sehingga menguntungkan bagi kelompok
mikroorganisme yang ingin diamati.
(Pelczar, 2007, halaman 110)
Pada pengamatan 24 jam, hampir seluruh petridish telah ditumbuhi
oleh koloni bakteri. Dalam petridish 1, bakteri tumbuh merata dalam
media, dengan diameter koloni 4,1 cm berwarna putih agak bening.
Pada petridish 2, koloni bakteri ukurannya lebih kecil daripada
pada petridish 1 dengan diameter berkisar 2,6 cm berwarna putih
agak bening. Sedangkan pada petridish 3, terdapat koloni bakteri
dengan diameter 2,2 cm berwarna putih agak bening. Pada pengamatan
dari atas tepi terlihat bentuk koloni mikroba berbentuk bulat
lingkaran sedangkan pada permukaan samping berbentuk seperti
setengah bola. Sedangkan pada pengamatan 48 jam, kita mendapatkan
koloni mikroorganisme yang telah tumbuh menjadi lebih besar dari
petridish 1, 2, dan 3, dengan diameter pada petridish 1 sebesar 8,9
cm, petridish 2 sebesar 5,6 cm, dan pada petridish 3 sebesar 4,2
cm. Pada petridish 3, koloni tersebut telah terisolasi dengan baik
dibandingkan dengan petridish 1 dan 2, yang mikroorganismenya belum
terisolasi dengan sempurna. Hal ini dikarenakan pengaruh
pengenceran, terbukti dengan terlihatnya jarak antar koloni yang
lebih jauh serta hanya terdapat sedikit koloni. Berbeda dengan
petridish yang lain yang koloninya banyak meyebar pada petridish,
sehingga pada petridish 3 ini sudah didapatkan koloni bakteri. Dari
pengamatan mengenai ciri morfologinya, diketahui bentuk bakteri
tersebut adalah bulat lonjong, dengan sebagian ada yang
berlekuk-lekuk tidak beraturan dan berwarna putih kekuningan (putih
tulang). Dengan demikian, bila dibandingkan antara ciri morfologi
bakteri yang didapat dengan literatur, maka bakteri yang terisolasi
pada cawan tuang lebih mengarah pada Thiobacillus harzianum yang
merupakan bakteri gram positif.
(Sri Sumarsih, 2003, halaman 24)
Gambar III.6 Hasil isolasi metode cawan tuang setelah 48
jamIII.2 Uji Biokimia (Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP
Test))Percobaan uji biokimia (uji methyl red Voges Proskauer (MR-VP
Test)) ini adalah untuk mempelajari dihasilkan tidaknya asam
organik atau asam campuran (metilen glikol) oleh suatu
mikroorganisme. Dalam percobaan ini, asam organik yang dihasilkan
adalah asetil metil karbinol (asetolin) yang diproduksi
mikroorganisme. Dalam metode ini, digunakan 2 jenis indikator,
yakni indikator methyl red dan juga indikator barrits
reagen(campuran KOH dan naphtol). Sementara itu, mikroorganisme
yang digunakan dalam uji MR-VP ini adalah jamur Rhizopus
oligosporus. Untuk pengamatan selama 48 jam, sebelumnya larutan
media kultur yang telah diinkubasi selama 24 jam terlebih dahulu
dibagi menjadi 2 bagian(2 tabung reaksi). Sehingga 1 larutan dalam
tabung reaksi dapat disimpan kembali di dalam inkubator untuk
melakukan pengamatan selama selama 48 jam nantinya. Media kultur
mikroorganisme yang digunakan dalam percobaan ini adalah MR-VP
Broth. Media ini juga dikenal dengan media buffered peptone-glucose
broth yang digunakan dalam reaksi uji
MR-VP.(http://catalog.hardydiagnostics.com/)
III.2.1. Methyl Red Test
Methyl red merupakan indikator yang memiliki trayek pH dengan
range 6,3 (kuning) sampai 4,2 (merah). Nama kimiawi dari methyl red
adalah o-Carboxybenzene-azo-dimethylaniline(Svehla, 1979, halaman
54)Pengukuran keasaman yang dideteksi oleh indikator methyl red
biasanya lebih rendah dari pada indikator lainnya (pada media
kultur bakteri). Karena itu, untuk dapat terjadi perubahan warna,
mikroba yang digunakan dalam uji MR-VP ini harus menghasilkan asam
kuat dalam jumlah yang banyak. Asam yang dihasilkan berbentuk asam
organik atau asam campuran (metilen glikol) dari proses fermentasi
glukosa yang terkandung dalam medium MR-VP Broth. Saat indikator
methyl red diberikan, jika muncul warna merah, maka hasil tes
positif. Hal ini menunjukkan bahwa mikroba menghasilkan asam
organik. Pertama-tama, hal yang dilakukan adalah meng-inokulasikan
Rhizopus oligosporus ke dalam 2 tabung reaksi yang telah melalui
proses sterilisasi pada autoclave yang berisikan 1/3 volume tabung
reaksi dengan media kultur MR-VP. Kemudian, diberikan indikator
methyl red setelah melalui proses inkubasi selama 24 jam dan 48
jam. Dari hasil percobaan yang telah dilakukan, didapatkan hasil
negatif untuk uji methyl red yang dilakukan selama 24 jam, dan juga
pada selang waktu 48 jam. Hal ini dapat dilihat dari gambar hasil
pengamatan . Uji akan bersifat positif bila kaldu berwarna merah
setelah penambahan reagensia methy red dan akan bersifat negatif
bila kaldu MR-VP berubah warna menjadi kuning atau jingga setelah
penambahan reagensia.(Direktorat Pembinaan SMK, 2013, halaman
89)
III.1. 2. Voges-Proskauer testPada percobaan ini, indikator yang
digunakan adalah Barrits reagen, yaitu gabungan senyawa naphtol dan
KOH. Jumlah kuantitas dari larutan KOH dan naphtol yang digunakan
pada uji Voges-Proskauer adalah sebanyak 10 tetes untuk larutan KOH
dan 15 tetes untuk larutan naphtol. Pada uji ini, hasil positif
ditunjukkan dengan munculnya warna merah (endapan). Endapan
berwarna merah dihasilkan oleh penambahan H2O2 dan terbentuknya
asetoin (asetil metal karbinol) dari proses fermentasi dextrose.
Karena ada oksigen dari udara dan H2O2, asetoin direduksi menjadi
diasetil, dan alpha-naphtol menjadi katalis untuk menghasilkan
warna merah. Perubahan warna medium ini diperjelas dengan
penambahan larutan alpha-naphtol. Perubahan warna medium biakan
lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara, karena 2,3
butanadiol dioksidasikan kembali menjadi asetoin sehinggal
memperjelas hasil reaksi.(Direktorat Pembinaan SMK, 2013, halaman
91)
Pertama-tama, hal yang dilakukan adalah meng-inokulasikan
Rhizopus oligosporus ke dalam 2 tabung reaksi yang telah melalui
proses sterilisasi pada autoclave yang berisikan 1/3 volume tabung
reaksi dengan media kultur MR-VP. Kemudian, diberikan 10 tetes KOH
dan 15 naphtol (Barrits reagen) setelah melalui proses inkubasi
selama 24 jam dan 48 jam. Dari hasil percobaan uji VP pada jamur
Rhizopus oligosporus adalah sebagai berikut. Pada waktu 24 jam,
sudah . Hal ini menandakan jamur Rhizopus oligosporus menghasilkan
asetoin. Pada waktu 48 jam, Rhizopus oligosporus tetap menghasilkan
endapan berwarna merah yang hampir serupa dengan percobaan pada
waktu 24 jam. Ini menandakan jamur Rhizopus oligosporus tetap
menghasilkan asetoin dalam kurun waktu 48 jam. Hal ini dapat
dilihat pada gambar hasil pengamatan. Hal lainnya yang dapat
membuat kesalahan dalam praktikum uji Voges-Proskauer ini dapat
disebabkan oleh suhu inkubasi yang tidak sesuai dengan
mikroorganisme yang di uji. Selain itu juga urutan dalam penambahan
reagent sangatlah penting, karena jika urutan penambahan reagent
tidak tepat, maka akan menyebabkan hasil positif yang lemah ataupun
hasil negatif yang tidak dapat dipastikan
kebenarannya.(http://catalog.hardydiagnostics.com/)III.3 Uji
Hidrolisa (Hidrolisa Gelatin)Percobaan ini bertujuan untuk
menentukan jenis mikroorganisme yang memiliki gelatinase, yaitu
eksoenzim yang mempunyai kemampuan menguraikan gelatin menjadi asam
amino. Dalam percobaan yang telah dilakukan, mikroorganisme yang
digunakan adalah bakteri Zymomonas mobilis. Bakteri Zymomonas
mobilis mengandung 2 enzim yang memiliki peran berbeda, salah satu
bertanggung jawab terhadap glukosa, dan satu lagi bertanggung jawab
terhadap fruktosa dan fosforilasi. (http://link.springer.com/)Media
yang digunakan dalam praktikum ini adalah nutrient gelatin, yang
memiliki fungsi untuk mendeteksi adanya pencairan gelatin oleh
mikroorganisme proteolytic. Komposisi takaran (dalam satuan Gms /
Litre) dari nutrient gelatin ini adalah 5 Gms/lt jaringan
pencernaan peptisasi hewan (peptone), 3 Gms/lt ekstrak daging sapi,
dan 120 Gms/lt gelatin. Dari literatur, didapatkan hasil pH akhir
(ketika suhu 25C) adalah 6,80,2.(http://himedialabs.com/)Hal
pertama yang dilakukan dalam percobaan ini adalah, memasukkan media
nutrient gelatin cair ke dalam 2 tabung reaksi (1 tabung sebagai
blanko). Kemudian, memasukkan tabung reaksi yang telah berisikan
medai nutrient gelatin cair kedalam autoclave untuk memulai proses
sterilisasi. Setelah proses sterilisasi dalam autoclave berakhir,
maka dilanjutkan dengan proses inkubasi dalam inkubator selama
kurun waktu 48 jam. Setelah selesai kemudian dilakukan pengamatan
dengan cara mendinginkannya di dalam freezer (0-4C) selama 10-15
menit. Kemudian mencatat hasil pengamatan, dengan menandai positif
apabila gelatin mencair setelah di dinginkan, dan menandai dengan
tanda negatif apabila gelatin tidak mencair setelah
didinginkan.(http://www.thermoscientific.com/)
Dari hasil praktikum yang telah dilakukan, ditemukan hasil uji
hidrolisis gelatin terhadap mikroorganisme bakteri Zymomonas
mobilis menghasilkan gelatin yang tidak mencair ketika didinginkan
(selama kurun waktu 48 jam). Sehingga dapat diberi tanda negatif
(-). Hal ini dikarenakan media yang digunakan dalam percobaan ini
adalah nutrient gelatin yang memiliki komposisi (secara teoritis)
peptone, ekstrak daging sapi, dan gelatin. Namun dalam percobaan,
media kultur mikroorganisme yang digunakan diberi tambahan agar,
yakni NBA (Nutrient Broth Agar). Penambahan dari medium NBA,
menjadi salah satu dari penyebab hasil uji hidrolisa gelatin tetap
menjadi padatan ketika didinginkan. Selain itu, suhu dari inkubasi
tidaklah merupakan suhu optimal dalam pendeteksian dari degradasi
gelatin oleh beberapa media, tetapi jika temparture diatas 30-35C,
gelatin dapat berwujud fluid dibandingkan gel. Lalu dari data tabel
pada literatur yang mengambil beberapa sample mikroorganisme,
ditemukan bahwa keadaan konsentrasi nutrient gelatin yang digunakan
lebih optimal (berdasarkan fungsi waktu) pada konsentrasi 4%
dibandingkan dengan konsentrasi 12%. Dan suhu optimal (berdasarkan
fungsi waktu) inkubasi pada beberapa mikroorganisme adalah 30C
dibandingkan dengan suhu 35C.(Greenwood, 1991, halaman 2)Dari tabel
pada literatur, yakni tabel phenotypic characteristic of some new
Zymomonas strains. Dijelaskan bahwa untuk bakteri Zymomonas dengan
sub spesies mobilis memiliki strains negatif (-) untuk uji coba
liquifikasi gelatin, dalam hal ini tidak dapat menguraikan gelatin
karena tidak adanya eksoenzim
gelatinase.(http://ijs.sgmjournals.org/)IV. Jawaban Pertanyaan1.
ISOLASI MIKROORGANISMEa. Bagaimanakah keadaan media pembanding
(blanko)? Apakah kegunaannya?Keadaan media pembanding (blanko)
dalam percobaan isolasi mikroorganisme dari suatu campuran adalah
steril dan tidak ditumbuhi bakteri. Fungsi blanko disini adalah
sebagai pembanding keadaan media sebelum dan sesudah dilakukan
penanaman bakteri.b. Setelah melakukan isolasi bakteri dengan
metode cawan gores, pada daerah manakah bakteri terisolasi?
Bandingkan dengan media pembanding!
Pada isolasi bakteri dengan menggunakan metode cawan gores,
daerah yang terkena isolasi adalah sektor 1, 2, dan 3 namun
mikroorganisme yang terisolasi sempurna terdapat pada sektor 3.
Jika dibandingkan dengan blanko maka sektor 3 terlihat lebih pekat
dan pada media blanko sendiri tetap steril (tidak ada bakteri yang
tumbuh).
c. Apakah pada permukaan agar yang tidak saudara gores tampak
koloni? Jelaskan! (jika terdapat ataupun tidak)
Pada permukaan yang tidak digores (blanko) sedikit terdapat
koloni setelah pengamatan 42 jam, hal ini menunjukkan bahwa media
telah terkontaminasi yang disebabkan waktu membuka media pada
pengamatan pertama terlalu lebar sehingga media terkontaminasi oleh
bakteri di udara meskipun dilakukan didalam incase.d. Apakah
keunggulan dan kekurangan dari dua metode di atas?
Perbandingan kelebihan dan kekurangan metode cawan gores dan
cawan tuangMetodeKelebihanKekurangan
Cawan GoresHanya membutuhkan sedikit media untuk membiakkan
mikroorganisme dan menghemat waktu.Membutuhkan ketelitian dan
ketepatan dalam menggores, agar mikroorganisme dapat terisolasi
dengan sempurna.
Cawan TuangCukup mudah, tidak membutuhkan keterampilan yang
terlalu tinggi untuk menginokulasikan mikroorganisme.Boros dalam
waktu dan penggunaan media.
2. UJI BIOKIMIA
e. Media yang digunakan pada beberapa test
Produksi Butadienol menggunakan media MRVP Hidrolisa kanji
menggunakan media kanji agar Hidrolisa lemak menggunakan nutrient
agar cair dan minyak nabati Hidrolis kasein menggunakan kasein
agar
f. Pasangan reagent dan test
Voges-Proskaeuer test pada Reagen Barrit Katalase test pada
Hidrogen Peroksida Hidrolisa kanji pada Gram Ioding. Enzim yang
terlibat pada reaksi dan produk hasil hidrolisanya
Jenis HidrolisaReaktanEnzimProduk
Hidrolisa KaseinKasein (protein
susu)KaseinaseGlukosa+glukosa
Hidrolisa KanjiPolysakaridaAmilaseDisakarida/monosakarida
Hidrolisa LemakLemakLipaseAsam lemak + gliserol
Hidrolisa GelatinGelatingelatinaseAsam amino
h. Perbedaan Methyl Red test dan Voges Proskauer Test
No.VariabelMethyl-RedVoges-Proskaeuer
1
2
3Indikator
Test positif
Test negatifMethyl-Red
Warna merah
Warna kuning setelah 15 menitBarrit Reagent (KOH + Reagent)
Warna merah muda, merah, orangeTidak berwarna merah muda, merah,
orange setelah 30 menit
i. Manfaat enzim
Untuk mengurangi hambatan energi aktivasi pada suatu reaksi
sehingga proses terjadinya reaksi lebih cepat.
V. Kesimpulan
V.1 Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran
V.1.1 Metode Cawan GoresHasil isolasi dengan metode cawan gores
menghasilkan koloni Bacillus subtilis dari campuran mikroorganisme
Bacillus subtilis dan Zymomonas mobilis.V.1.2 Metode Cawan
Tuang
Hasil isolasi dengan metode tuang menghasilkan koloni dari
Trichoderma harzianum dari campuran mikroorganisme Rhizopus
oligosprorus, Trichoderma harzianum, dan Aspergillus niger.V.2 Uji
Biokimia (Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP Test))
Dari hasil percobaan dan pengamatan dapat diperoleh kesimpulan
bahwa jamur Rhizopus oligosporus tidak dapat membentuk asetil
methyl carbinol sebagai asam organik.V.3 Uji Hidrolisa (Hidrolisa
Gelatin)Dari hasil percobaan dan pengamatan dapat disimpulkan bahwa
jamur Rhizopus oligosporus tidak memiliki enzim gelatinase, yakni
suatu enzim yang memiliki kemampuan menghidrolisis gelatin menjadi
asam amino yang ditunjukkan dengan tidak adanya perubahan menjadi
fase cair setelah didinginkan pada suhu 0-5C.Daftar
PustakaDirektorat Pembinaan Sekolah Menengah Kejuruan. 2013.
Mikrobiologi. Jakarta : Kementrian Pendidikan dan
KebudayaanGreenwood, J.R. dkk. 1991. Test for Detecting Degradation
of Gelatin : Comparison of Five Methods. California : American
Society for Microbiology.Hendrianie, Nunik. 2001. Diktat Kuliah
Mikrobiologi Industri. Surabaya: Institut Teknologi Sepuluh
Nopember.Madigan, Michael dkk. 2012. Biology of Microorganism.
Wageningen : Pearson Education Inc.Pelczar, Michael dan Chan .
2007. DASAR-DASAR MIKROBIOLOGI. Jakarta : Universitas
Indonesia.Prescott, Harley. 2002. Laboratory Exercises in
Microbiology. New York : The Mc Graw-Hill Company.
Sumarsih, Sri. 2003. MIKROBIOLOGI DASAR. Yogyakarta :
Universitas Pembangunan Nasional Veteran Yogyakarta.
Svehla, G. 1979. TEXTBOOK OF MACRO AND SEMIMICRO QUALITATIVE
INORGANIC ANALYSIS. Belfast : Queens University.Tortora, G. dkk.
2010. Microbiology : An Introduction, 10th edition. San Francisco :
Pearson Education Inc.http://www.neogen.com/ Diakses pada tanggal
28 Maret 2015 pada pukul 19.10 WIB.http://www.fda.gov/ Diakses pada
tanggal 28 Maret 2015 pada pukul 22.01 WIB.http://www.mastgpr.com/
Diakses pada tanggal 28 Maret 2015 pada pukul 19.20
WIB.http://www.biolabs.tmcc.edu/ Diakses pada tanggal 28 Maret 2015
pada pukul 22.30 WIB.http://www.repository.usu.ac.id/ Diakses pada
tanggal 28 Maret 2015 pada pukul 23.40
WIB.http://www.catalog.hardydiagnostics.com/ Diakses pada tanggal
29 Maret 2015 pada pukul 09.03
WIB.http://www.catalog.hardydiagnostics.com/ Diakses pada tanggal
29 Maret 2015 pada pukul 10.26 WIB.http://www.link.springer.com/
Diakses pada tanggal 29 Maret 2015 pada pukul 11.18 WIB.
http://www.himedialabs.com/ Diakses pada tanggal 29 Maret 2015
pada pukul 11.40 WIB.http://www.thermoscientific.com/ Diakses pada
tanggal 29 Maret 2015 pada pukul 12.26
WIBhttp://www.ijs.sgmjournals.org/ Diakses pada tanggal 29 Maret
2015 pada pukul 22.30 WIB http://www.imgkid.com/ Diakses pada
tanggal 29 Maret 2015 pada pukul 23.04 WIBNegatif (-)
21