BAB I. PENDAHULUAN1.1 Latar Belakang
Rekayasa genetika merupakan salah satu ilmu terapan dalam
merekayasa materi genetik untuk kepentingan manusia. Obyek rekayasa
genetika mencakup hampir semua golongan organisme, mulai dari
bakteri, fungi, hewan tingkat rendah, hewan tingkat tinggi, hingga
tumbuh-tumbuhan. Rekayasa genetika sudah digunakan dalam berbagai
bidang kehidupan yaitu bidang kedokteran dan farmasi, ilmu pangan,
kedokteran hewan, pertanian (termasuk peternakan dan perikanan),
serta teknik lingkungan juga telah melibatkan ilmu ini untuk
mengembangkan bidang masing-masing. Rekayasa genetika sendiri
merupakan teknikn untuk memodifikasi DNA (sebagai substansi kimiawi
dalam kromosom yang bertanggung jawab atas pewarisan sifat) untuk
menghasilkan produk-produk baru yang memiliki kombinas sifat yang
diinginkan (Chang, 2009).
Mempelajari DNA bukanlah hal yang mudah karena DNA itu terlalu
kecil (tidak mungkin bisa dilihat dengan mata telanjang) dan
konsep-konsep mengenai DNA cukup abstrak. Kerja laboratorium
berikut ini memungkinkan anda untuk bekerja dengan DNA secara
kongrit dengan mengisolasi DNA total dengan menggunakan peralatan
dasar dan juga metode yang sama dengan yang digunakan para Ilmuwan
(Campbell, 2002).
Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi
pada akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi
molekuler. Beberapa bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam
tanaman padi, kapas, dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk
perkembangan keanekaragaman hayati dimasa mendatang memerlukan
sebuah keterampilan dan pemikiran. Melalui isolasi DNA tersebut
paling tidak akan menjadi pembelajaran bagi mahasiswa mengenai cara
pengumpulan DNA.
Elektroforesis merupakan teknik pemisahan suatu molekul dalam
suatu campuran di bawah pengaruh medan listrik. Molekul terlarut
dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang
ditentukan aleh rasio muatan dan massa. Sebagai contoh, jika dua
molekul mempunyai massa dan bentuk yang sama, molekul dengan muatan
lebih besar akan bergerak lebih cepat ke elektroda. Elektroforesis
melalui gel agarose atau poliakrilamid merupakan metode standar
untuk pemisahan, identifikasi, dan pemurnian fragmen DNA (Sudjadi,
2008).
Hal tersebut sangat berkaitan dengan praktikum kali ini dimana
berkaitan dengan isolasi DNA kromosom dan plasmid dimana untuk
mengetahui berat molekulnya serta untuk membedakan keduanya.1.2
Rumusan Masalah
1.2.1 Bagaimana cara mengisolasi DNA kromosom dan plasmid ?
1.2.2 Bagaimana cara menentukan berat molekul DNA kromosom dan
plasmid1.2.3 Bagaimana cara membedakan antara DNA kromosom dan
plasmid ?1.3 Tujuan
1.3.1 Melatih kemampuan mahasiswa untuk mengisolasi DNA kromosom
dan plasmid.1.3.2 Memahami dan mengetahui berat molekul DNA
kromosom dan plasmid1.3.3 Membedakan DNA kromosom dan plasmid1.4
Manfaat
Manfaat praktikum analisis kali ini adalah kita dapat
mengisolasi DNA kromosom serta plasmid dari suatu bakteri sehingga
kita dapat mengetahui teknik dasar yang dipakai untuk rekayasa
genetika.
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA2.1 DNASemua makhluk hidup memiliki
materi genetik untuk mempertahankan kelangsungan struktur, sifat,
fungsi dan aktivitas-aktivitas kimia dalam selnya. DNA merupakan
salah satu jenis asam nukleat yang berperan sebagai materi genetic
yang menurunkan sifat tertentu dari satu generasi ke generasi
turunannya. Materi ini mengarahkan pembentukan protein dan RNA
tertentu yang penting dalam sel makhluk hidup. DNA juga mengatur
pertumbuhan dan pembelahan sel, termasuk informasi untuk
diferensiasi sel sehingga terbentuk tumbuhan, hewan, manusia dan
mikroorganisme lainnya. Begitu pentingnya DNA ini sehingga disebut
sebagai molekul utama kehidupan (Wirahadikusumah, 1985).
DNA (Deoxyribose Nucleid Acid) adalah master molekul yang
mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme
dalam setiap organism (Jamilah, 2005).
DNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua
kelompok basa yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin
dan pirimidin. Dua purin yang paling banyak terdapat dalam DNA
adalah adenin dan guanin, dan pirimidin yang umum adalah sitosin
dan timin. Purin dan pirimidin berisi beberapa ikatan ganda yang
berhubungan. Molekul molekul yang berisi ikatan demikian itu
mempunyai potensi untuk hadir dalam sejumlah struktur kimia yang
berbeda, karena atom hidrogennya mempunyai kebebasan tertentu.
Misalnya saja satu atom hidrogen dapat berpindah dari suatu gugusan
asam amino (-NH2), dengan meninggalkan gugusan asam amino (-NH) dan
muatan negatif netto yang diserap oleh sistem cincin molekul yang
berkonjugasi. Fluktuasi kimia semacam itu disebut pergeseran
tautomer, dan struktur molekul berbeda yang dihasilkannya disebut
tautomer (Goodenough, 1988).
DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa
nitrogen, dan phospat. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan
nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda, dimana basa nitrogen
dan kedua benang polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan
yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu
dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat.
Ikatan-ikatan fosfat itu sangat kuat dan dikenal sebagai ikatan
ikatan ester kovalen, atau ikatan fosfodiester. Residu fosfat (
PO4-) sepanjang rantai ini bersifat asam, sehingga diberi nama
asamnukleat (Goodenough. 1988).
DNA berfungsi untuk menyimpan informasi genetik secara lengkap
yang diperlukan untuk mencirikan struktur semua protein dan RNA
tiap-tiap spesies organisme, untuk membuat program pada saat yang
tepat dan menempatkan biosintesis sel dan jaringan secara teratur,
untuk menentukan aktivitas organisme sepanjang siklus hidupnya, dan
untuk menentukan kekhususan organisme tertentu. DNA alami terdiri
dari dua rantai anti parallel dalam suatu rangkaian heliks ganda.
Basa A-T dan G-T yang saling komplementer tersusun berpasangan
melalui ikatan hydrogen pada heliks (Lehninger, 1982).
DNA akan mengalami denaturasi dan renaturasi. Jika suatu larutan
yang mengandung DNA dipanaskan atau diberi alkali kuat, maka
hubungan hydrogen menjadi labil dan putus. Dua pita spiral dari
molekul DNA itu membuka. Proses ini disebut denaturasi DNA. Jika
larutan tersebut kemudian didinginkan kembali atau dinetralisis
secara perlahan-lahan maka terbentuklah pasangan-pasangan basa itu
kembali. Peristiwa ini dinamakan renaturasi. Molekul DNA juga dapat
mengalami replikasi. Ada tiga cara replikasi molekul DNA, yaitu
secara:1. Semi konservatif yaitu dua pita spiral dari `double
helix` memisahkan diri. Tiap pita tunggal dari 'doublehelix'
parental ini berlaku sebagai pencetak (model) untuk pembentuk pita
pasangan yang baru.
2. Konservatif Double helix parental tetap utuh, tetapi
keseluruhannya dapat mencetak double helix baru.
3. Dispersif Kedua buah pita dari double helix arental
terputus-putus. Segmen-segmen DNA parental dan segmen-segmen DNA
yang dibentuk baru saling bersambungan dan menghasilkan dua double
helix baru (Jack, 1995).
Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di
luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya
bakteri dan sel eukariotik tingkat rendah. DNA plasmid berukuran
lebih kecil dari DNA kromosom dan dapat bereplikasi sendiri.
Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan
menggunakan E. coli sebagai host, sehingga dalam rekayasa genetika
plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen
tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut
selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti
insulin, interferon, dan berbagai enzim (Alatar, 2012).
Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid
memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning, yaitu
replication origin, marker yang memungkinkan adanya seleksi
(biasanya gen resisten antibiotik) dan region yang mampu disisipi
oleh fragmen DNA dari luar. Plasmid merupakan salah satu vektor
pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi
DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan
DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah
molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran
kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan
replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006). Beberapa
hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai
wahana (vektor) kloning, antara lain adalah :
a). plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya
lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi
b). DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil
selama diisolasi secara kimia
c). mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat
memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara
otonomi
d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga
terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih
mudah diamplifikasi
e). mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap
antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi
plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et al., 1994).
Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan
kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan
tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu memberikam kesempatan
bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan
didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan
dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan
membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein,
fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam
tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi
protein di dalamnya (Saunders and Parkers, 1999).
Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan
menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin
tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi
EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Ion
ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun
mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat.
Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk
merusak membran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis.
Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS
dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal
hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein
dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil
RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari
larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari
larutan dan mengendapkan DNA (Muladno, 2002).2.2 Isolasi DNAIsolasi
DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsip isolasi
DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk
memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul
yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah
tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung
(Mader, 1993).Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan
DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat.
Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran
(lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti
selulosa dan protein, serta pemurnian DNA ( Glick, 2005). Ada
beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA
antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti
protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk
semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur
dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.
Prinsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada
berbagai organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi
dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan beberapa teknik
menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh
suatu perusahaan sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi
DNA pada tumbuhan seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk
isolasi DNA pada hewan digunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification
Kit. Namun tahapan-tahapan isolasi DNA dalam setiap langkahnya
memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan.
Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki
kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan
harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara kekurangannya
membutuhkan waktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh
tergantung jenis sampel (Murray, 2000).
Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau
penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis)
merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk
mengeluarkan isi sel. Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki
beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel
dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau
dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi. Cara lain
yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran
dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen yang dapat
melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi
membran sel (Alberts et al, 2000).
Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K
seperti untuk melisiskan membran pada sel darah serta mendegradasi
protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel
(Harth et al, 2000).
2.3 Isolasi DNA Kromosom
Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari
komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur
mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan
menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada
ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi
mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi
RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak
tersebut dipanaskan sampai suhu 90 oC untuk menginaktifasi enzim
yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi
dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air (Cooper,
2000).2.4 Isolasi DNA Plasmid
DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen,
sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA
plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA
kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan
yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel
dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA
kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom
dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. DNA + protein +
potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi.
Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang
tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk
mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat
dipresipitasi menggunakan etanol (Cooper, 2000).2.5 Elektroforesis
Gel Agrosa
Metoda ini didasarkan pada pergerakan mulekul bermuatan dalam
media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik.
Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid.
Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA
yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara
horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan
1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid
biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing).
Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam
sumur-sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutup
negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan
buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutup positif. Laju
migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa
DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk
DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat
dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu
memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk
visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan
masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA
akan kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan
dengan membandingkannya dengan pita DNA standar.
Gambar 2.5 Foto produk PCR pada gel agrosa
(Smith,J.E, 1996).
BAB III. METODOLOGI PERCOBAAN
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat
Gelas ukur
Alat sentrifugasi
Tabung reaksi
Beaker gelas
Erlenmeyer
Pipet volume
Ball pipet
Waterbath Shaker incubator
Penangas air
Set alat elektroforesis
Power supply
Spektrofotometer
Tabung eppendorf
3.1.2 Bahan
- Koloni tunggal isolat A
- Buffer TE (50 mM tris HCl pH 8 dan 50 mM EDTA)
- Pecahan kaca steril
- Larutan STEP (SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8, proteinase K)
- Larutan fenol jenuh
- Larutan natrium asetat 0,3 M
- Etanol absolut
- ddH2O
- Koloni tunggal transforman E.Coli
- Glukosa
- Tris-Cl 2.5 mM pH 8
- Na2EDTA 10 mM Ph 8
- NaOH 0.2 N
- SDS 1%
- Aquades - Kaliaum asetat 5M
- Asam asetat glasial- Fenol
- Kloroform
- Isoamil alkohol
- Gel Agarosa 1%
- Bromofenol biru 0,25%
- Sukrosa 40%
- Larutan EtBr
3.2 Alur Percobaan
3.2.1 Isolasi DNA kromosom
diinokulasikan ke dalam 5 mL media cair
diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 30oCdengan kecepatan
150 rpm selama 18 jam
disentrifugasi selama 2 menit 5 mL suspensi sel dengan kecepatan
10.000 rpm pada suhu 4oC
dibuang supernatan dan pellet sel diresuspensi dengan 250 uL
buffer TE (50 mM tris HCl pH 8 dan 50 mM EDTA)
ditambahkan 0,2 gram pecahan kaca steril kemudian dikocok selama
15 menit
ditambahkan larutan STEP (SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8, proteinase
K) sebanyak 50 uL ke dalam susupensi dan dicampur rata
dipanaskan campuran dalam waterbath pada suhu 50oC selam 1 jam
sambil sesekali digoyang perlahan
ditambahkan 300 uL larutan fenol jenuh ke dalam campuran lalu
dikocok sampai terbentuk emulsi
disentrifugasi campuran pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit
selama terpisah 2 lapisan
dipipet lapisan atas secara berhati-hati dan dipindahkan ke
dalam tabung eppendof yang steril
ditambahkan larutan natrium asetat 0,3 M sebanyak 0,1 kali dari
volume total hasil pemipetan DNA , lalu dicampur pelahan
ditambahkan etanol absolut dingin sebanyak 2 kali volume
larutan
diinkubasi campuran pada suhu -20oC selam 2 jam sampai
semalam
disentrifugasi campuran pada 12000 rpm selama 5 menit
dibuang supernatan dan dicuci pellet dengan 0,6 mL etanol
70%
disentrifuge kembali campuran pada 12000 rpm selama 5 menit
diambil pelet dan ditambahkan 30 uL ddH2O
3.2.2 Isolasi DNA plasmid Pet-endo
diinokulasikan ke dalam 5 mL media LB cair yang mengandung 2,5
uL kanamisin
diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 37oC dengan kecepatan
150 rpm selam 16 jam
disentrifugasi 5 mL suspensi sel selama 2 menit dengn kecepatan
10.000 rpm pada suhu 4oC
disuspensi pellet dengan larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-Cl 2.5
mM pH 8, Na2EDTA 10 mM Ph 8) 100 uL dan dihomogenkan lalu di
diamkan 5 menit
ditambah 200 uL larutan II (NaOH o.2 N 20 uL, SDS 1% 100 uL,
aquades steril 880 uL)
dihomogenkan dengan cara membolak balik tabung Eppendorf
diinkubasi larutan selama 15 menit
ditambah 150 uL larutan III (kaliaum asetat 5M, asam asetat
glasial, ddH2O dingin)
dipindahkan supernatan secara perlahan menggunakan pipet kedalam
tabung Eppendorf baru yang steril
ditambah campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1)
1 kali volume total
dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi
12.000 rpm 2 menit
dipindahkan fasa cair dengan cara mempipet secara hati-hati
kedalam tabung eppendorf baru yang steril
dipekatkan dengan penambahan etanol absolut dingin 2 kali volume
total, dan diinkubasi dalam es selama 1 jam
disentrifugasi campuran 12.000 rpm selama 5 menit
dicuci pellet dengan etanol dingin 70%
disentrifugasi lagi dan tabung eppendorf dikeringkan dari etanol
5 menit
dilarutkan pellet dalam 30 uL ddH2O
3.3.3 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa
dibuat dengan melarutkan 0,4 g agarosa dalam 40 mL buffer TAE
(40 mM Na2EDTA pH 8/stok buffer TAE 5x : 24,2 gr, 5,72 mL asam
asetat glasial dan 10 mL dengan pemanasan
dilarutkan agarosa dan didinginkan sampai kira-kira temperatur
45oC
dituangkan gel pada cetakan dan dibiarkan memadat
dicampur dengan buffer pembeban 1x ( bufer pembeban 6x
bromofenol biru 0,25% (b/v) dan sukrosa 40% (b/v)] pada sel yang
dielektroforesis
dilakukan elektroforesis dalam bufer TAE pada tegangan 70-100
volt
dihentikan elektroforesis ketika bromofenol biru telah
bermigrasi kira-kira 2/3 dari panjang gel
direndam gel agrosa dalam larutan EtBr 250 ug/mL selama 3-5
menit
direndam dalam bufer TAE selama 5-10 menit atau aquades
diamati Pita-pita DNA dengan sinar UV.
3.3 Prosedur Kegiatan3.3.1 Isolasi DNA kromosomKoloni tunggal
isolat A diinokulasikan ke dalam 5 mL media cair dan diinkubasi
pada shaker incubator pada suhu 30oCdengan kecepatan 150 rpm selama
18 jam. Kemudian sebanyak 5 mL suspensi sel disentrifugasi selama 2
menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC. Setelah terpisah,
supernatan dibuang kemudian pellet sel diresuspensi dengan 250 uL
buffer TE (50 mM tris HCl pH 8 dan 50 mM EDTA), kemudian
ditambahkan 0,2 gram pecahan kaca steril kemudian dikocok selama 15
menit. Lalu menarmbahkan larutan STEP (SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8,
proteinase K) sebanyak 50 uL ke dalam susupensi dan dicampur rata.
Campur an ini selanjutnya dipanaskan dalam waterbath pada suhu 50oC
selam 1 jam sambil sesekali digoyang perlahan. Kemudian ditambahkan
300 uL larutan fenol jenuh ke dalam campuran lalu dikocok sampai
terbentuk emulsi. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm
selama 5 menit selama terpisah 2 lapisan. DNA yang diinginkan
berada pada lapisan atas. Lapisan atas dipipet secara berhati-hati
dan dipindahkan ke dalam tabung eppendof yang steril. Selanjutnya
ditambahkan larutan natrium asetat 0,3 M sebanyak 0,1 kali dari
volume total hasil pemipetan DNA , lalu dicampur pelahan. Kemudian
ditambahkan etanol absolut dingin sebanyak 2 kali volume larutan
kemudian tabung bolak-balik untuk pencampuran. Setelah itu,
campuran diinkubasi pada suhu -20oC selam 2 jam sampai semalam.
Campuran disentrifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit, kemudian
supernatan dibuang dan pellet dicuci dengan 0,6 mL etanol 70%.
Sentrifuge kembali campuran pada 12000 rpm selama 5 menit. Pelet
diambil kemudian ditambahkan 30 uL ddH2O.3.3.2 Isolasi DNA plasmid
pE-endo
Koloni tunggal transforman E.Coli diinokulasikan ke dalam 5 mL
media LB cair yang mengandung 2,5 uL kanamisin dan diinkubasi pada
shaker incubator pada suhu 37oC dengan kecepatan 150 rpm selam 16
jam. Kemudian sebanyak 5 mL suspensi sel di sentrifugasi selama 2
menit dengn kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC, pellet disuspensi
dengan larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-Cl 2.5 mM pH 8, Na2EDTA 10 mM
Ph 8) 100 uL dan dihomogenkan lalu di diamkan 5 menit. Ditambah 200
uL larutan II (NaOH o.2 N 20 uL, SDS 1% 100 uL, aquades steril 880
uL) dan dihomogenkan dengan cara membolak balik tabung Eppendorf,
larutan di inkubasi selama 15 menit, setelah 15 menit ditambah 150
uL larutan III (kaliaum asetat 5M, asam asetat glasial, ddH2O
dingin), di inkubasi dalam es selama 10 menit. Campuran tersebut
disenfrugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm suhu 40C,
supernatan yang diperoleh dipindah secara perlahan menggunakan
pipet kedalam tabung Eppendorf baru yang steril dan ditambah
campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1) 1 kali
volume total, dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian
disentrifugasi lagi 12.000 rpm 2 menit. Dihasilkan 3 lapis, fasa
paling bawah adalah fasa organik, fasa tengah adalah fasa emulsi
putih dan fasa paling atas adalah fasa cair, fasa cair dipindah
dengan cara mempipet secara hati-hati kedalam tabung eppendorf baru
yang steril, fasa cair tersebut dipekatkan dengan penambahan etanol
absolut dingin 2 kali volume total, dan diinkubasi dalam es selama
1 jam. Campuran disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, pellet
dicuci dengan etanol dingin 70% sentrifugasi lagi dan tabung
eppendorf di kkeringkan dari etanol dengan cara membalikkan tabung
dan didiamkan 5 menit. Kemudian pellet dilarutkan dalam 30 uL
ddH2O.
3.3.4 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa
Gel agarosa 1%ndibuat dengan melarutkan 0,4 g agarosa dalam 40
mL buffer TAE (40 mM Na2EDTA pH 8/stok buffer TAE 5x : 24,2 gr,
5,72 mL asam asetat glasial dan 10 mL dengan pemanasan. Setelah
agarosa terlarut dan didiginkan sampai kira-kira temperatur 45oC,
selanjutnya gel dituangkan pada cetakan dan dibiarkan memadat.
Sampel yang akan dielektroforesis dicampur dengan buffer pembeban
1x ( bufer pembeban 6x bromofenol biru 0,25% (b/v) dan sukrosa 40%
(b/v)]. Elektroforesis dilakukan dalam bufer TAE pada tegangan
70-100 volt. Elektroforesis dihentikan ketika bromofenol biru telah
bermigrasi kira-kira 2/3 dari panjang gel. Gel agrosa kemudian
direndam dalam larutan EtBr 250 ug/mL selama 3-5 menit, selanjutnya
direndam dalam bufer TAE selama 5-10 menit atau aquades. Pita-pita
DNA dapat diamati dengan sinar UV.BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN1.1
Hasil
4.1.1 Isolasi DNA plasmid
No.PerlakuanHasil
1.Suspensi disentrifugasi dengan suhu 40CDihasilkan pellet dan
supernatan
2.
Pelet +100(L larutan IWarna kekuning
Dihomogenkan (disentil) dalam es, diamkan 5 menitHomogen
+200(L larutan IIWarna kekuningan
Dihomogenkan (dibolak-balik)Homogen
Diinkubasi Warna kekuningan
3.+larutan III 150(L, diinkubasi 10 menit, disentrifugasi
(I)Terbentuk supernatan dan pelet
4.Supernatan diambil 0,15mLTidak berwarna
+larutan IV dengan perbandingan 1:1 (150(L), dikocokTidak
berwarna
Sentrifugasi (II)Terbentuk 2 fase (atas: tidak berwarna, bawah:
keruh)
5.Bagian atas diambil (0,1mL), +200(L etanolTidak berwarna
Diinkubasi 1 jamTidak berwarna
Disentrifugasi (III)Didapat pelet dan supernatan
6.Pelet ditambah etanol dingin 70%, disentrifugasiDidapat pelet
dan supernatan
4.2.2 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa
No.Perlakuan Gambar
1.Dielektroforesis menggunakan agarosa pada tegangan 70-100 volt
dan hasilnya diamati dengan sinar UV
1.2 Pembahasan
Praktikum kali ini berkaitan dengan isolasi DNA plasmid. Dimana
dalam praktikum kali ini yang digunakan adalah bakteri Escherchia
coli, dikarenakan bakteri ini mudah didapatkan, menghasilkan
keturunan yang banyak dalam waktu yang singkat dan memiliki jumlah
plasmid yang banyak. Plasmid adalah molekul DNA sirkuler yang
berukuran relatif kecil yang berada di luar kromosom yang terdapat
di dalam sel prokariot, terutama pada bakteri. Gen yang berada di
dalam plasmid tidak esensial bagi kelangsungan dan pertumbuhan
bakteri, namun gen tersebut sering menyandi sintesis protein untuk
resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika, plasmid
sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang
diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut kemudian akan
menghasilkan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon,
dan berbagai enzim.
Secara garis besar prinsip yang digunakan dalam mengisolasi DNA
plasmid adalah sama dengan isolasi DNA/RNA dari suatu sel. Prinsip
yang digunakan adalah melakukan isolasi plasmid yaitu dengan
melakukan sentrifugasi dan presipitasi. Hal ini dilakukan dengan
memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk
ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA.
Kemudian ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel
yang mengandung plasmid (Blackwell 1997).Perlakuan pertama dalam
praktikum ini yaitu pada sampel, dimana sampel didapatkan dari
bakteri Escherchia coli. Dalam hal ini sampel kemudian di
sentrifugasi denan 10.000 rpm selama 2 menit dengan suhu 4oC.
Proses ini akan terbentuk supernatan dan pelet. Supernatan adalah
substansi hasil sentrifugasi yang memiliki berat jenis yang lebih
rendah. Posisi dari substansi ini berada pada lapisan atas dan
warnanya lebih jernih. Sementara pelet adalah substansi hasil
sentrifugasi yang memiliki berat jenis yang lebih tinggi. Posisinya
berada pada bagian bawah (berupa endapan) dan warnanya lebih keruh.
Sel dari bakteri Escherichia coli akan berada pada pelet sehingga
supernatan harus dibuang. Prinsip utama sentrifugasi adalah
memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara
memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat
akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan
terletak di atas. Selanjutnya supernatan di simpan dan hasil
peletnya diambil. Pelet yang diambil kemudian ditambahkan dengan
larutan I , dimana larutan I adalah campuran dari glukosa 50 mM,
Tris-Cl 2.5 mM pH 8, Na-EDTA 10 mM pH 8 sebanyak 100 mL, dimana
larutan ini berfungsi untuk untuk memecah dinding sel dan
mensuspensikan pelet sampai larut. EDTA dapat menghambat DNAse yang
dapat mendenaturasi DNA sebagai pengkelat Mg2+ yang berperan
merusak stabilitas membran plasma sehingga membran plasma menjadi
tidak stabil. Selain itu, Tris-Cl juga berfungsi untuk menjaga pH
larutan. Kemudian dihomogenkan dengan cara di ketuk-ketuk dan
dididamkan.Tahap selanjutnya yaitu ditambahkan larutan II 200 uL
dimana terdiri dari NaOH 0,2 N 20 uL, SDS 1% 100 uL, aquades steril
880 uL. Larutan 2 digunakan untuk mengendapkan dinding sel bakteri.
SDS dalam larutan ini berfungsi untuk menghancurkan membran sel dan
mendenaturasi protein, sedangkan NaOH berfungsi untuk mendenaturasi
DNA genomik. Kemudian dihomogenkan dengan cara di bolak balik dan
kemudian diinkubasi selama 15 menit, inkubasi pada tahap tersebut
berfungsi untuk melihat pertumbuhan atau perkembangbiakan pada
mikroorganisme.
Tahap selanjutnya yaitu ditambahkan dengan larutan III 150 uL,
dimana larutan III ini terdiri dari kalium asetat 5 M, asam asetat
glasial, ddH2O dingin. Kalium asetat akan mengakibatkan terjadinya
renaturasi plasmid dan mengendapnya single strand DNA karena
molekulnya yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan
kadar garam yang tinggi. Penambahan Larutan III juga berfungsi
untuk mempertahankan pH agar DNA plasmid tidak rusak. Setelah itu,
diinkubasi selama 10 menit.
Selanjutnya yaitu disentrifugasi kembali dengan 12000 rpm pada
suu 40oC selama 5 menit, dan dilakukan setelah penambahan ketiga
larutan di atas sehingga diperoleh pelet dan supernatan. Praktikum
kali ini diambil supernatan dan peletnya disimpan. Supernatan yang
diperoleh tidak berwarna, menunjukkan bahwa sama-sama sudah
terendapkan dengan sempurna sehingga tidak mencemari supernatan.
Supernatan dipindahkan, dan ditambahkan larutan IV, dimana larutan
IV tersebut terdiri dari campuran pelarut organik (fenol,
kloroform) 1:1, dimana berfungsi untuk menghilangkan protein dan
pengotor-pengotor lain dalam larutan. Pelarut organik akan
mengikat, menarik, dan mempresipitasi protein sehingga fase air
yang terpisah akan mengandung DNA (Sambrook & Russell 2006).
Setelah disentrifus, terlihat akibat dari penambahan pelarut
organik tersebut, yaitu DNA plasmid berada pada lapisan atas.
Setelah itu kemudian dikocok atau dibolak balik.
Metode lain yang biasa digunakan dalam deproteinase selain
menggunakan fenol-klorofrom adalah metode pengikatan dengan silika.
Prinsip kerja dari metode ekstraksi DNA dengan silika adalah
menyerap DNA dengan menggunakan silika dan garam chaotropik. Garam
chaotropik berfungsi untuk merusak jaringan ikatan hidrogen dalam
air dan protein sehingga membuat protein-protein yang merupakan
kotoran-kotoran pada DNA denaturasi atau lisis. Pada larutan asam
(pH < 7,5), DNA akan diserap oleh silika , sedangkan pada pH
basa dan konsentrasi garam rendah, DNA secara efisien adakn
dipisahkan dari silika (Gregory & Funnell 2004).
Perlakuan selanjutnya yaitu disentrifugasi kembali 12000 rpm
selama 2 menit. Hal ini dihasilkan 3 lapis, fasa paling bawah
adalah fasa organik, fasa tengah adalah suatu emulsi putih dan fasa
paling atas adalah fasa cair. Pada bagian atas tersebut merupakan
supernatan, dan kemudian di pindah dengan cara memipet secara
hati-hati dalam tabun eppendorf baru yan steril, kemudian
dipekatkan dengan menamabakan etanol absolut. Penambahan etanol
absolut bertujuan untuk mengendapkan plasmid karena adanya
perbedaan polaritas. Penambahan etanol absolut harus dilakukan pada
keadaan dingin dengan tujuan agar banyak DNA plasmid yang
mengendap. Prinsip pengendapan dengan menggunakan etanol absolut
dingin, yaitu pada saat penambahan garam yaitu Na-asetat yang
berfungsi sebagaineutralize charge pada gula fosfat DNA, maka
ion-ion seperti kation Na+akan menyelimuti rantai DNAyang bermuatan
negatif. Jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion
positif(Na+) dan negative (DNA) masih lemah karena sebagian rantai
DNA masih berikatan dengan air. Air memiliki konstanta dielektrik
yang tinggi, sehingga penambahan pelarut organik seperti etanol
dapat menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak
ikatan DNA dengan Na+sehingga membuat DNA lebih mudah
terpresipitasi (Brown 2010).
Perlakuan selanjutnya setelah ditambahkan etanol absolut yaitu
diinkubasi lai selama 1 jam. Langkah selanjutnya adalah melakukan
sentrifugasi kembali dan diperoleh pelet dalam jumlah yang sangat
sedikit. Supernatan dibuang dan dilakukan penambahan etanol 70%
pada pelet. Tujuan penambahan etanol yaitu untuk membersihkan
sisa-sisa larutan yang digunakan untuk mengendapkan plasmid
sebelumnya sehingga diperoleh plasmid yang murni. DNA dalam alcohol
akan terpresipitasi (menggumpal) sedangkan DNA dalam air akan
larut, tetapi protein tidak dapat larut dalam air. Tahap tersebut
merupakan terakhir, disebut juga tahap presipitasi presipitasi
bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai
DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein
histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Hal tersebut dapat
terlihat dengan adanya benang-benang endapan DNA pada dasar tabung.
Kemudian membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel di atas
tissue sampai kering selama 5 menit. Setelah itu, menambahkan 50
mikrolit dH2O pada DNA plasmid dengan menyedot dan menyemprotkan
kembali sebanyak 8 kali dengan mikropipet tip warna kuning sampai
bercampur. Langkah terakhir, memipet larutan dengan mikropipet tip
warna kuning dan memasukannya ke dalam botol eppendorf kemudian
dimasukkan ke dalam freezer.
Perlakuan selanjutnya yaitu denan elektroforesis, dimana
elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular
berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang
dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan.
Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang
ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika
molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium,
misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub
ke kutb yang berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan
bergerak dari kutub negatif ke kutub positif (Yuwono
2005).Elektroforesis kali ini digunakan gel agarose karena dengan
menggunakan gel agarose teknik yang digunakanpun cukup sederhana,
mudah penanganannya dan sederhana, selain itu gel agarose mempunyai
kemampuan pemisahan dengan range yang cukup luas yaitu mulai 70 pb
(pasangan basa) sampai 800.000 pb.
Selain itu penggunaan gel agarose juga mempunyai keuntungan,
dimana lokasi dari DNA dalam gel dapat diamati secara insitu dengan
menggunakan Etidium Bromida sebagai pewarna. Etidium bromide
nantinya akan berinteraksi dengan basa dari molekuk DNA dan
memberikan warna orange Floresance dibawah lampu UV. Hasil
penyinaran dibawah lampu UV dapat dilihat berupa potongan pita-pita
DNA, yang mempunyai fragmen-fragmen. Gambar pada hasil pengamatan
kami ditemukan salah satunya potongan fragmen pita DNA yang banyak
terurai dan kurang sempurna karena pengaruh konsentrasi agarose
yang menyebabkan DNA bermigrasi,sehingga fragmen-fragmennya lebih
besar.
BAB V. PENUTUP5.1 Kesimpulan
Adapun kesimpulan untuk praktikum isolasi DNA kromosom dan
Plasmid adalah sebagai berikut
a. Suatu DNA plasmid diisolasi dengan beberapa tahap yakni
resuspention, lysis, neutralization, dan clearing of lysate. b.
Proses elektroforesis digunakan untuk menandai adanya suatu DNA
yang berhasil diisolasi dan diindikasi dengan adanya suatu lekukan
berwarna orange nyala api pada agarosa yang dianilasa menggunakan
sinar ultraviolet5.2 Saran
Adapun saran dari praktikum kali ini adalah :1. Praktikan lebih
teliti dalam mengamati perubahan-perubahan proses dalam plasmid
isolasi DNA.
2. Praktikan lebih berhati-hati dalam melakukan praktikum agar
alat-alat praktikum tidak mudah rusak.
3. Praktikan harus menjaga kesterilan alat-alat praktikum dan
menjaga kesterilan tubuh sehingga tidak terkontaminasi dengan
mikroba.
DAFTAR PUSTAKA
Alatar, et al.. 2012. Molecular Structure of Bacterial Plasmids.
Bacteriological Reviews. New York : USA.
Brock, T. D., Michael T. Madigan, John M. Martinko and Paker.
1994.Biology of Microorganisms. New Jersey: Prentice Hall.Campbell,
N.A. 2002. Biologi 5th ed. Jakarta : Erlangga.
Chang W. 2009. Bioetika sebuah pengantar. Yogyakarta:
Kanisius.Goodenough.1988. Understanding DNA. Amsterdam : Academic
Press.
Glick. 2005. Understanding DNA. Amsterdam : Academic
Press.Jamilah.2005. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: VI Press.
Mader.1993. Plasmid biology. Washington: ASM Press.
Muladno, 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Bogor :Pustaka
Wirausaha Muda.
Radji, 2011. Petunjuk Praktikum Biologi Sel Dan Molekuler.
Yogyakarta: Universitas Negeri Yogyakarta.
Saunders and Parkers.1999. The Condensed Protocols From
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring
Harbour Laboratory Press.
Suharsono dan Widyastuti.2006. Analisis DNA. Bogor: Departemen
Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi
Universitas Pangan dan Gizi IPB.Susanto.2012. Penuntun Praktikum
Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya
Hayati dan Bioteknologi, IPB.
Wirahadikusumah.1985. Teknik Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka
Wirausaha Muda. Koloni tunggal isolat A
Hasil
Koloni tunggal transforman E.Coli
Hasil
Gel Agarosa 1%
Hasil