-
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI
PEWARNAAN BAKTERI TAHAN ASAM
Senin, 12 Maret 2015
Kelompok III
Senin, Pukul 10.00 13.00 WIB
Nama NPM
Nunung nurjanah 260110130027
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015
Nilai TTD
(Casuarina) (Sani)
-
PEWARNAAN TAHAN ASAM
I. Tujuan
Mengamati dua kelompok bakteri, yaitu bakteri tahan asam dan
bakteri tak tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan
tahan asam
pewarnaan (Ziehl-Neelsen). Memahami setiap langkah dan
reaksi-reaksi kimia
yang terjadi dalam prosedur tersebut.
II. Prinsip
1. Penetrasi zat warna.
Penetrasi zat warna adalah suatu jalan untuk zat warna agar
dapat masuk kedalam suatu molekul maka harus bias diserap
oleh
mikroorganisme tersebut.
2. Pewarnaan tahan asam
Pewarnaan tahan asam adalah tipe pewarnaan diferensial lebih
dari satu pewarnaan untuk membedakan suatu mikroorganisme
dengan
kandungan dinding sel peptidoglikan serta disusun lebih dari
60%
lipid kompleks yang tahan terhadap dekolorasi dengan alcohol
asam.
3. Pemanasan.
Pemanasan ini biasanya diperlukan untuk memperkuat
penetrasi pewarna dasar ke dalam sel bakter.sehingga semua tipe
sel
akan terwarnai oleh pewarna dasar.
4. Impermeabilitas dinding sel bakteri tahan asam
Dinding sel hidrofobik dan impermeabel terhadap perwarnaan
dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika
proses
-
pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan
asam
sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam.
III. Teori Dasar
Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki
ciri-ciri
yaitu berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki
dinding sel
yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak
mikolat, lipid yang
ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang
termasuk BTA
antara lain Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium bovis,
Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis, dan Nocandia
gonorrhoeae.
Mycobacterium tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat
menyebabkan
penyakit tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga
digolongkan sebagai
bakteri tahan asam (BTA). Penularan Mycobacterium tuberculose
terjadi
melalui jalan pernafasan (Syahrurachman, 1994).
Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat
diwarnai
dengan pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol
dan
dengan pemanasan. Bakteri ini memilki dinding sel berlilin
karena
mengandung sejumlah besar materi lipoidal oleh karena itu
bakteri ini hanya
dapat diwarnai dengan pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding
sel
hidrofobik dan impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan kimia
lain pada
cairan atau larutan encer. Ketika proses pewarnaan, bakteri
tahan asam ini
melawan dekolorisasi dengan asam sehingga bakteri tersebut
disebut bakteri
tahan asam (Ball, 1997).
Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus
atau
berbentuk filamen. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk
spora, non
motil, tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif. Namun,
ketika
Mycobacteria diberi warna oleh pewarnaan gram, maka warna
tersebut tidak
dapat dihilangkan dengan asam. Oleh karena itu, maka
mycobacteria disebut
sebagai Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme lain
yang
-
juga memiliki sifat tahan asam, yaitu spesies Nicardia,
Rhodococcus,
Legionella micdadei, dan protozoa Isospora dan Cryptosporidium.
Pada
dinding sel mycobacteria, lemak berhubungan dengan
arabinogalaktan dan
peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini menurunkan permeabilitas
dinding
sel, sehingga mengurangi efektivitas dari antibiotik.
Lipoarabinomannan
adalah suatu molekul lain dalam dinding sel mycobacteria,
berperan dalam
interaksi antara inang dan patogen, menjadikan M. tuberculosis
dapat bertahan
hidup di dalam makrofaga. Mikobakteria dapat tumbuh lebih cepat
pada pH 6
dan 8 dengan pH optimum sekitar 6.5 - 6.8 untuk tipe pathogen.
Sel
mikobakteria terdiri dari tiga lapisan penting yaitu lipid,
protein, dan
polisakarida (Thomas, 1999).
Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan
kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya.
Kelompok
bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat
mempertahankan zat
warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan
pemucat
(alkohol asam). Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya
pada
bakteri yang tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol
asam) akan
melakukan reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga
sel bakteri
tidak berwarna (Lay, 1994).
Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat
warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue
0,3%. Pada
pemberian warna pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat
mempertahankannya. Carbol fuchsinmerupakan fuksin basa yang
dilarutkan
dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah pada
sediaan
dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan
zat
warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi
pemanasan
untuk melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin
dapat masuk
sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol,
maka zat
warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci
dengan air
-
mengalir untuk menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA
akan
terlihat berwarna merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam
akan
melarutkan carbol fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri
tidak berwarna.
Setelah penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri
tidak tahan
asam akan berwarna biru (Lay, 1994).
Mikobakteria merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi
dari
oksidasi beberapa senyawa sederhana. Penambahan CO2
meningkatkan
pertumbuhan. Tidak ada aktivitas biokimia yang menandai. Dan
kecepatan
pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian besar bakteri. Waktu
untuk
menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk saprofit
cenderung
tumbuh lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23C,
untuk
menghasilkan pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk
cepat
asam daripada bentuk patogenik. Mikobakteria cenderung lebih
resisten
terhadap agen kimia daripada bakteri lain karena sifat
hidrofobik permukaan
sel dan pertumbuhannya. Basil tuberkel reisten terhadap
kekeringan dan
bertahan hidup selama periode waktu yang lama dalam sputum
kering. Variasi
dapat terjadi dalam koloni, pigmentasi, virulensi, temperatur
petumbuhan
yang optimal dan beberapa tanda pertumbuhan atau seluler lainnya
(Fardiaz,
1992).
IV. Alat dan Bahan
A. Alat :
1. Bak pewarna .
2. Botol semprot.
3. Kaca obyek.
4. Kapas
5. Kertas saring.
6. Korek api.
-
7. Mikroskop majemuk.
8. Ose
9. Pembakar spirtus.
B. Bahan :
1. Alkohol 70% dan air suling.
2. Asam alcohol (3% HCl dalam alcohol 95%).
3. Karbol fuchsin dan metilen biru.
4. Suspensi bakteri saprofit.
5. Gambar alat
C. Gambar Alat
Bak pewarna Botol Semprot Gelas Kimia
Kaca objek Kapas Kawat Ose
-
Kertas Saring Mikroskop majemuk
Pembakar spirtus
Spidol Tabung Reaksi
Zat Warna
V. Prosedur
Disediakan kaca obyek yang bersih kemudian dibuat olesan
dari
suspensi bakteri, olesan bakteri digenangi dengan pewarna karbol
fuchsin
diamkan selama 5 menit,sambil dipanaskan di atas penangas air.
Jaga jangan
-
sampai, mendidih atau kering. Kemudian zat warna yang berlebih
dibuang,
lalu dibilas dengan air suling, lalu bilas dengan zat pemucat
alcohol asam
diamkan selama 15 detik atau sampai latar belakang olesan
berwarna merah
muda pucat. Kemudian olesan bakteri digenangi dengan pewarna
tandingan
biru metilen diamkan selama 2 menit, zat warna yang berlebih
dibuang dan
dibilas denganair suling,lalu keringkan dengan kertas saring.
Kemudian diatas
preparat diteteskan imersi oil untuk memperjelas identifikasi,
lalu preparat
tersebut diperiksa atau diamati di bawah mikroskop. Mulailah
dengan lensa
obyektif berkekuatan terendah 10X, lalu ganti dengan lensa
obyektif
berkekuatan 100X. kemudian hasilnya diamati dan digambar. Jika
identifikasi
yang dilakukan benar maka hasil yangakan terlihat yaitu bakteri
tahan asam
(ZN +) akan berwarna merah dan bakteri tidak tahan asam (ZN-)
akan
berwarna biru
VI. Data Pengamatan
VII. Pembahasan
Pada praktikum kali ini mengenai pewarnaan bakteri tahan
asam
(BTA), dilakukan teknik pewarnaan tahan asam pada bakteri
Mycobacterium
tuberculosis yang juga merupakan bakteri gram positif.
pengecetan Bakteri
-
Tahan Asam (BTA) yang menggunakan tiga jenis cat Ziehl Neelson
(ZN)
yaitu carbol fuchsin 0,3 %, asalm alcohol 3 % dan methylene blue
3 %.
Bakteri tahan asam memiliki sel berlilin karena mengandung
sejumlah besar
materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai
dengan
pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan
impermeabel
terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan
encer.
Ketika proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan
dekolorisasi dengan
asam sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam.
Sesuai dengan teori dan prosedur, hal yang pertam dilakukan
adalah
menyiapkan alat dan bahan. Alat yang digunakan antara lain ose
bulat, tabung
reaksi, pembakar spirtus, kaca obyek, mikroskop majemuk, bak
pewarnaan,
botol semprot,kapas, korek api. Sedangkan untuk bahan yang
digunakan
antara lain suspensi Mycobacterium tuberculosis , alcohol 70%,
air suling,
ketiga zat warna yang telah disebutkan di atas, dan imersi oil.
Langkah
selanjutnya adalah melakukan pengolesan bakteri dari
suspensi
M.tuberculosis dengan cara membersihkan terlebih dahulu kaca
obyek dengan
menggunakan alcohol 70% , keringkan dengan kapas sampai
terdengar bunyi
berdecit dari kaca obyek yang menandakan bahwa kaca obyek telah
bersih.
Sebelum dilakukan pengolesan terlebih dahulu beri tanda
lingkaran di bagian
bawah kaca objek guna untuk menandai tempat olesan bakteri
dan
mempermudah pengamatan saat menggunakan mikroskop. Selanjutnya
ose
bulat difiksasi terlebih dahulu kemudian dimasukan (dicelupkan)
kedalam
tabung reaksi yang berisi suspense bakteri Mycobacterium
tuberculosis,
perlakuan tersebut dilakukan dekat api (pembakar spirtus) guna
untuk
mencegah kontaminasi melalui udara,kemudian oleskan ose ke atas
kaca
obyek,kemudian fiksasi kembali ose dan tabung reaksi beserta
kapas penutup
tabung, begitupun dengan bagian bawah kaca objek difiksasi
supaya olesan
bakteri tersebut menempel. Tujuan dari fiksasi itu sendiri
adalah
menghentikan proses metabolisme secara cepat, mencegah
kerusakan
-
jaringan, mengawetkan komponen-komponen sitologis dan
histologis,
mengawetkan keadaan sebenarnya, mengeraskan materi-materi yang
lembek
sehingga akan terjadi koagulasi protoplasma maupun elemen-elemen
di dalam
protoplasma, jaringan dapat diwarnai sehingga bagian-bagian dari
jaringan
dapat mudah dikenali. Secara ringkas fiksasi terdiri dari dua
proses yang jelas,
yaitu mematikan dan menetapkan.
Setelah dilakukan pengolesan bakteri diatas kaca obyek, olesan
bakteri
digenangi dengan pewarna karbol fuchsin diamkan selama 5 menit
sambil
dipanaskan dipenangas air. Pewarnaan pertama ini, akan sulit
menembus
dinding dari Bakteri tahan asam, sehingga dilakukan pemanasan
untuk
memuaikan dinding sel bakteri tersebut sehingga warna carbol
fuchsin ini
mampu diserap oleh sel-sel bakteri. Namun perlu diperhatikan,
pemanasan
dilalukan jangan sampai mendidih cukup sampai menguap agar
sel-sel bakteri
tersebut tidak rusak. Pada saat olesan didiamkan selama 5 menit
setelah
pewarnaan dengan warna carbol fuchsin dan dilakukan pemanasan
bertujuan
agar cat ini dapat diserap dan melekat sempurna pada dinding
bakteri dan
dinding selnya kembali seperti semula setelah dilakukan
pemanasan. Carbol
fuchsin merupakan fuksin basa yang dilarutkan dalam larutan
fenol 5 %. Zat
fenol inilah yang membantu pemasukan zat warna ke dalam sel
bakteri
sewaktu proses pemanasan. kemudian tetesi olesan dengan zat
pemucat
alcohol asam diamkan selama 15 detik atau sampai latar belakang
olesan
berwarna merah muda pucat. Pada saat olesan ditetesi asam
alcohol lalu
didiamkan selama 15 detik itu bertujuan agar zat warna dapat
luntur secara
sempurna dan tidak ada yang tersisa.
Penambahan alcohol asam ini berfungsi untuk membilas atau
melunturkan zat warna (decolorization) pada sel bakteri
(mikroorganisme).
Saat sel-sel bakteri sudah mampu menyerap warna carbol fuchsin
maka
dinding sel tersebut akan kembali tertutup pada suhu semula.
Sehingga
-
sebelum dilakukan penambahan asam alcohol ditunggu samapai 5
menit. Saat
penambahan asam alcohol ini, maka bakteri yang bukan BTA
akan
dilunturkan kembali warna carbol fuchsin tersebut karena tidak
mampu
mengikat kuat seperti halnya bakteri BTA.
Kemudian olesan bakteri digenangi dengan pewarna tandingan
biru
metilen diamkan selama 2 menit, zat warna yang berlebih dibuang
dan dibilas
dengan air suling,lalu keringkan dengan kertas saring..
Methylene Blue
merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini
berfungsi untuk
mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama
setelah
perlakuan dengan asam alkohol. Zat warna methylene blue masuk ke
dalam
sel bakteri non BTA yang permeabilitas dinding selnya membesar
akibat
lapisan lipid pada bakteri non BTA terekstraksi oleh asam
alkohol, sehingga
menyebabkan sel bakteri non BTA tersebut menjadi berwarna
biru.
Sedangkan pada bakteri BTA dinding selnya sudah terdehidrasi
dengan
perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel
dan
membran menurun sehingga zat warna methylene blue tidak dapat
masuk,
sehingga sel bakteri BTA berwarna merah. Olesan didiamkan selama
2 menit
bertujuan agar cat ini dapat diserap sempurna pada dinding
bakteri non BTA
sehingga ada perbedaan warna antara bakteri BTA dan Non BTA.
Setelah
ketiga zat tersebut diteteskan kemudian olesan bakteri ditetesi
dengan imersi
oil guna untuk memperjelas penglihatan pada saat bakteri di
identifikasi di
bawah mikroskop dan mengurangi indeks bias cahaya.
Setelah olesan di tetesi imersi oil, kaca objek siap damati
dengan menggunakan
mikroskop majemuk. Pertama gunakan lensa obyektif berkekuatan
rendah 10X kemudian
diganti dengan lensa obyektif berkekuatan 100X.
Karena pewarnaan bakteri tahan asam ini berpotensi
menularkan
penyakit pada praktikan, maka prosedur pewarnaan tidak dilakukan
oleh
praktikan dan praktikan hanya melakukan pengamatan melalui
mikroskop.
Hasil yang di dapat menunjukan adanya bakteri tahan asam, namun
tidak ada
-
bakteri non tahan asam karena tidak adanya bakteri pembanding.
Hal ini
terjadi karena suspensi bakteri yang digunakan merupakan
suspense bakteri
tunggal yaitu suspensi Mycobacterium tuberculosis. pada saat
dilakukan
pengamatan juga terlihat warna dari bakteri tersebut tidak
berwarna merah
melainkan hijau kecoklatan. Hal ini terjadi mungkin karena zat
warna yang
digunakan bukan pewarna karbol fuchsin.
VIII. Kesimpulan
Dua kelompok bakteri yaitu bakteri tahan asam dan bakteri tidak
tahan
asam dapat diamati dengan menggunakan pewarnaan tahan asam
(Ziel-
Neelse) beserta setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang
terjadi dalam
prosedur tersebut dapat teramati. Bajteri yang teramati sebagai
bakteri tahan
asam adalah Mycobacterium tuberculosis.
-
DAFTAR PUSTAKA
Ball, A.S. 1997. Bacterial Cell Culture : Essential Data. John
Wiley & Sons,
New York.
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. PT. Gramedia Pustaka
Utama,
Jakarta.
Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT.
Raga
Grafindo Persada.
Syahrurachman, dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran
Edisi Revisi.
Jakarta: UI Press.
Thomas Dormandy (1999). The White Death: A History of
Tuberculosis.
Tersedia online di
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1044719.
-
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI
PEWARNAAN SPORA
Senin, 12 Maret 2015
Kelompok III
Senin, Pukul 10.00 13.00 WIB
Nama NPM
Nunung nurjanah 260110130027
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015
Nilai TTD
(Casuarina) (Sani)
-
PEWARNAAN SPORA
I. Tujuan
Mengamati endospore bakteri dengan menggunakan prosedur
pewarnaan spora (pewarnaan Klien). Memahami setiap langkah dan
reaksi-
reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.
II. Prinsip
1. Teknik aseptis
Teknik aseptis merupakan suatu teknis yang dilakukan dalam
pemindahbiakan bakteri agar bakteri yang dibiakan tidak
mengalami
kontaminasi, dengan teknis aseptis diharapkan bakteri yang
dipindahbiakan mempertahankan kemurniannya.
2. Impermeabilitas spora
Adalah sifat dari dinding endospore yang sulit untuk
ditembus
oleh zat warna dan tidak permeable oleh karena itu dibutuhkan
proses
pemanasan agar dinding spora dapat mengembang dan zat warna
dapat
masuk.
3. Penetrasi zat warna.
Penetrasi zat warna adalah suatu jalan untuk zat warna agar
dapat masuk kedalam suatu molekul maka harus bias diserap
oleh
mikroorganisme tersebut.
4. Pewarnaan spora
Pewarnaan spora bertujuan untuk mewarnai spora pada bakteri
yang dapat membentuk spora
III. Teori Dasar
Spora bakteri adalah bentuk bekteri yang sedang dalam usaha
mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora
bakteri
-
mempunyai fungsi yang sama seperti kista amoeba, sebab bakteri
dalam
bentuk spora dan amoeba dalam bentuk kista merupakan suatu fase
dimana
kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri
terhadap
faktor luar yang tidak menguntungkan.Sepanjang pengetahuan yang
kita
miliki sekarang, hanya golongan basillah yang dapat membentuk
spora, akan
tetapi tidak semua basil mampu berbuat demikian. Beberapa
spesies Bacillus
yang aerob dan beberapa spesies Clostridium yang anaerob dapat
membentuk
spora. Spora ini lazim disebut endospora, dikarenakan spora itu
dibentuk di
dalam sel (Dwidjoseputro,2001).
beberapa bakteri mampu membentuk spora meskipun tidak dalam
keadaan ekstrem ataupun medium yang kurang nutrisi. Hal ini
dimungkinkan
karena bakteri tersebut secara genetis, dalam tahapan
pertumbuhan dan
perkembangannya memang memiliki satu fase sporulasi
(Dwidjoseputro,2001).
Ada dua genus bakteri yang dapat membentuk endospora, yaitu
genus
Bacillus dan genus Clostridium.Strukturspora yang terbentuk di
dalamtubuh
vegetative bakteri disebut sebagai endospora (endo=dalam,
spora=spora)
yaitu spora yang terbentuk di dalam tubuh. Secara sederhana,
dapat dikatakan
bahwa endospora merupakan sel yang mengalami dehidrasi dengan
dinding
yang mengalami penebalan serta memiliki beberapa lapisan
tambahan
(Waluyo, 2010).
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum,
dan
sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna
sederhana. Istilah
pewarna sederhana dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri
hanya
digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990).
Endospora hanya terdapat pada bakteri. Merupakan tubuh
berdinding
tebal, sangat refraktif, dan sangat resisten, dihasilkan oleh
semua spesies
Bacillus, Clostridium dan Sporosarcina. Bakteri yang mampu
membentuk
endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama banyak generasi
sebagai sel
-
vegetatif. Namun pada beberapa tahapan di dalam pertumbuhannya,
terjadi
sintesis protoplasma baru dalam sitoplasma vegetatifnya yang
dimaksudkan
untuk menjadi spora. (Pelczar,1986).
Dalam pengamatan spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu
yang
dapat menembus dinding tebal spora. Contoh dari pewarnaan
yang
dimaksudkan oleh Volk & Wheeler tersebut adalah dengan
penggunaan
larutan hijau malakit 5%, dan untuk memperjelas pengamatan, sel
vegetative
juga diwarnai dengan larutan safranin 0,5% sehingga sel
vegetative ini
berwarna merah. Dengan demikian ada atau tidaknya spora dapat
teramati,
bahkan posisi spora di dalam tubuh sel vegetative juga dapat
diidentifikasi.Namun ada juga zat warna khusus untuk mewarnai
spora dan di
dalam proses pewarnaannya melibatkan treatment pemanasan, yaitu;
spora
dipanaskan bersamaan dengan zat warna tersebu tsehingga
memudahkan zat
warna tersebut untuk meresap ke dalam dinding pelindung
spora
bakteri.(Volk, 1998).
IV. Alat dan Bahan
A. Alat :
1. Bak pewarna .
2. Botol semprot.
3. Kaca obyek.
4. Kapas
5. Kertas saring.
6. Korek api.
7. Mikroskop majemuk.
8. Ose
-
9. Pembakar spirtus
B. Bahan:
1. Alkohol 70% dan air suling.
2. Biakan padat bakteri Bacillus subtilis berumur 72 jam.
3. H2SO4 1%.
4. Karbol fuchdin dan biru metilen.
5. Minyak celup.
6. NaCl fisiologis.
7. Xylene.
C. Gambar alat
Bak pewarna Botol Semprot Gelas Kimia
Kaca objek Kapas Kawat Ose
-
Kertas Saring Mikroskop majemuk
Pembakar spirtus
Spidol Tabung Reaksi
Zat Warna
V. Prosedur
Dibuat suspensi bakteri yang terdiri dari biakan bakteri dan
NaCl
fisiologis ditabung reaksi.karbol fuchsin ditambahkan sebanyak
1:1
dimasukan ke dalam suspensi tersebut. Kemudian campuran
tersebut
dipanaskan dalam penangas air bersuhu 800C selama 10 menit jaga
jangn
sampai mendidih atau kering. Kaca objek dibersihkan dengan
menggunakan
-
alcohol 70% keringkan dengan menggunakan kapas sampai kaca
obyek
berdecit. Kemudian dibuat olesan bakteri dari suspense bakteri
tersebut diatas
kaca obyek yang telah dibersihkan, dengan cara menggunakan ose
bulat yang
difiksasi terlebih dahulu, kemudian ose digunakan untuk
mengambil suspense
bakteri yang berada di dalam beaker glass dan di tutup dengan
kapas,
pengambilan suspensi bakteri dari beaker glass tersebut dengan
cara dilakukan
di dekat api pertama buka kapas penutup kemudian fiksasi beserta
beaker
glassnya lalu celupkan ose ke dalam suspense bakteri dan oleskan
di atas kaca
obyek kemudian di bawah kaca obyek diberi tanda
lingkaran.setelah itu
fiksasi kembali kapas penutup dan beaker glass, fiksasi ose dan
juga fiksasi
kaca obyek yang telah berisi olesan bakteri. Simpan preparat
diatas kawat bak
pewarna kemudian tetesi dengan H2SO4 bilas dengan air suling
yang berada di
dalam botol semprot. Kaca obyek atau preparat tersebut ditetesi
dengan
metilen biru dan didiamkan selama 5 menit, setelah itu bilas
dengan air suling
sampai zat warna hilang, preparat dikeringkan dengan menggunakan
kertas
saring dengan cara ditepuk-tepuk sampai air bekas bilasan
hilang. Tetesi
preparat dengan imersi oil, kemudian lakukan pengamatan
dibawah
mikroskop majemuk, sebelumnya bersihkan terlebih dahulu lensa
obyektif
dengan menggunakan kapas yang telah ditetesi xylene. Preparat
diamati
dimulai dengan menggunakan lensa obyektif berkekuatan terendah
10X. lalu
ganti dengan lensa obyektif berkekuatan 100X. kemudian hasil
yang di dapat
dan diamati. Jika pengamatan yang dilakukan benar maka akan
terlihat bakteri
dengan endospore berwarna merah dan badan vegetative berwarna
biru.
-
VI. DataPengamatan
VII. Pembahasan
Pada praktikum kali ini mengenai pewarnaan spora yang
dilakukan
pada bakteri Bacillus subtilis Bacillus memiliki bentuk batang
Gram positif
pada kultur muda, motil (reaksi nonmotil kadang terjadi),
membentuk spora
yang biasanya tahan panas, aerob (beberapa spesies anaerob
fakultatif),
katalase positif dan oksidasi bervariasi (Cowan, 1974). Bacillus
dapat menjadi
gram negatif .ketika memasuki fase pertumbuhan stasioner.
Sebagian besar
Bacillus merupakan bakteri mesofil yang tumbuh dengan suhu
optimal antara
30-400 C, meskipun ada beberapa yang termasuk golongan termofil
dengan
suhu optimal pada suhu 65 0
C. Tujuan dari praktikum ini mengamati
endospore bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan
spora
-
(pewarnaan Klien). Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi
kimia yang
terjadi dalam prosedur tersebut. Zat warna yang digunakan pada
pewarnaan
spora antara lain karbol fuksin, H2SO4, dan metilen biru.
Sesuai dengan teori dan prosedur, hal yang pertam dilakukan
adalah
menyiapkan alat dan bahan. Alat yang digunakan antara lain ose
bulat, tabung
reaksi, pembakar spirtus, kaca obyek, mikroskop majemuk, bak
pewarnaan,
botol semprot,kapas, korek api. Sedangkan untuk bahan yang
digunakan
antara lain suspensi Bacillus subtilis , alcohol 70%, air
suling, ketiga zat
warna yang telah disebutkan di atas,imersi oil. Suspensi bakteri
Bacillus
subtilis dibuat dengan cara, suspens bakteri yang terdiri dari
biakan bakteri
dan NaCl fisiologis ditabung reaksi.karbol fuchsin ditambahkan
sebanyak 1:1
dimasukan ke dalam suspensi tersebut. Kemudian campuran
tersebut
dipanaskan dalam penangas air bersuhu 800C selama 10 menit jaga
jangan
sampai mendidih atau kering. Masuknya zat warna karbol fuksin
dalam spora
diakibatkan oleh pemanasan yang berlangsung karena dengan
pemanasan
akan mengembangkan lapisan luar spora, dengan melonggarnya
pori-pori
maka zat warna dapat masuk. Adanya molekul RNA dalam spora
juga
mengakibatkan zat warna tidak keluar karena adanya ikatan
kompleks zat
warna RNA, ditambah lagi dengan adanya penambahan asam yang
menutup
kembali pori-pori.Namuan karena keterbatasan waktu maka prosedur
di atas
tidak dilakukan oleh prakikan,melainkan di bantu oleh para
asistan
laboratorium Langkah selanjutnya adalah melakukan pengolesan
bakteri
suspense bakteri dengan cara membersihkan terlebih dahulu kaca
obyek
dengan menggunakan alcohol 70% , keringkan dengan kapas
sampai
terdengar bunyi berdecit dari kaca obyek yang menandakan bahwa
kaca
obyek telah bersih. Sebelum dilakukan pengolesan terlebih dahulu
beri tanda
lingkaran di bagian bawah kaca objek guna untuk menandai tempat
olesan
bakteri dan mempermudah pengamatan saat menggunakan
mikroskop.
Selanjutnya ose bulat difiksasi terlebih dahulu kemudian
dimasukan
-
(dicelupkan) kedalam tabung reaksi yang berisi suspensi bakteri
Bacillus
subtilis, perlakuan tersebut dilakukan dekat api (pembakar
spirtus) guna untuk
mencegah kontaminasi melalui udara,kemudian oleskan ose ke atas
kaca
obyek,kemudian fiksasi kembali ose dan tabung reaksi beserta
kapas penutup
tabung, begitupun dengan bagian bawah kaca objek difiksasi
supaya olesan
bakteri tersebut menempel. Tujuan dari fiksasi itu sendiri
adalah
menghentikan proses metabolisme secara cepat, mencegah
kerusakan
jaringan, mengawetkan komponen-komponen sitologis dan
histologis,
mengawetkan keadaan sebenarnya, mengeraskan materi-materi yang
lembek
sehingga akan terjadi koagulasi protoplasma maupun elemen-elemen
di dalam
protoplasma, jaringan dapat diwarnai sehingga bagian-bagian dari
jaringan
dapat mudah dikenali. Secara ringkas fiksasi terdiri dari dua
proses yang jelas,
yaitu mematikan dan menetapkan.
Setelah dilakukan pengolesan suspensi bakteri di atas kaca
objek,
kemudin olesan tersebut ditetesi dengan H2SO4 .dengan adanya
penambahan
asam maka pori-pori kembali menutup. Sehingga karbol fuksin
dapat
meresap atau masuk ke dalam spora dan mewarnainya, hingga spora
dari
bakteri tersebut berwarna merah. Kemudian bilas dengan air
suling untuk
menghilangkan larutan H2SO4 yang merupakan larutan asam, juga
supaya
bakteri tersebut tidak mati karena bakteri tersebut bukan
merupakan BTA.
Kemudian setelah ditetesi H2SO4, kaca objyek yang berisi
olesan
bakteri tersebut ditetesi dengan metilen biru yang disebut
sebagai pewarna
tandingan. Dengan adanya Penambahan pewarna tandingan metilen
blue
mengakibatkan terperangkapnya zat warna dalam sel bakteri
sehingga
perbedaan kontras antara warna badan sel bakteri dengan sporanya
dapat
diamati. Bilas zat warna berlebih dengan air suling, lalu
keringkan dengan
menggunakan kertas saring dengan cara ditepuk tepuk di atas
olesan .
Kemudian kaca obyek (preparat) ditetesi dengan imersi oil guna
untuk
memperjelas identifikasi bakteri dan mengurangi indeks bias
cahaya. Setelah
-
kaca obyek (preparat) di tetesi imersi oil, kaca objek siap
damati dengan menggunakan
mikroskop majemuk. Pertama gunakan lensa obyektif berkekuatan
rendah 10X kemudian
diganti dengan lensa obyektif berkekuatan 100X.
Hasil pengamatan menunjukan adanya bakteri Bacillus subtilis
ditandai dengan adanya badan sel berbentuk basil berwarna biru
yang disebut
sebagai sel vegetative dan adanya spora berwarna merah di dalam
sel.
Spora tersebut dapat diamati karena adanya bakteri yang
mengalami
sporulasi. Sporulasi adalah suatu respon terhadap penurunan
kadar nutrisi
dalam medium khususnya sumber karbon dan nitrogen.
Pengaturan
pembentukan spora bersifat negatif karena sel membuat repressor
dari
senyawa yang terkandung dalam medium untuk mencegah mulainya
sporulasi. proses pembentukan endospora pada B. subtilis
membutuhkan
beberapa jam. Pada tahap I, terjadi perkembangan sel vegetatif
yang ditandai
dengan perubahan struktur morfologi sel. Sel terbagi secara
asimetris (tahap
II) dan menghasilkan dua bagian yaitu sel induk dan pre-spore.
Kedua bagian
ini memiliki perkembangan yang berbeda. Tahap III dari
sporulasi,
peptidoglikan pada septum terdegradasi dan pre-sporeditelan oleh
sel induk,
sehingga membentuk sel dalam sel. Aktivitas sel induk dapat
mempermudah
sintesis endospora dan membentuk korteks yang merupakan endapan
dari
suatu lapisan (tahap VI+V). Hal ini diikuti oleh berakhirnya
dehidrasi dan
pematangan endospora (tahap VI+VII). Akhirnya sel induk hancur
pada saat
program sel mati, dan endospora terbebas ke lingkungan.
Endospora akan
tetap dorman sampai berkecambah kembali pada kondisi yang
sesuai.
-
VIII. Kesimpulan
Endospora bakteri dapat diamati dengan menggunakan prosedur
pewarnaan spora (pewarnaan Klien). Beserta setiap langkah dan
reaksi-reaksi
kimia yang terjadi pada prosedur tersebut dpat diamati. Hasil
pengamatan
menunjukan adanya bakteri Bacillus subtilis ditandai dengan
adanya badan sel
berbentuk basil berwarna biru yang disebut sebagai sel
vegetative dan adanya
spora berwarna merah di dalam sel.
-
DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan:
Jakarta
Gupte. 1990. Mikrobiologi Dasar.Jakarta : Penerbit Bina Rupa
Aksara.
Pelezar,chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press:
Jakarta
Volk, W. A. dan Margareth F. W., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid
I. Jakarta :
Erlangga
Waluyo,lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum.
UMM.
Malang