BAB I
DAFTAR PUSTAKA
BAB I3PENDAHULUAN31.1.Pendahuluan31.2. Tujuan Praktikum4BAB
II5TINJAUAN PUSTAKA52.1. DNA5Karakteristik kimia52.2.Isolasi
DNA82.2.Genomik DNA142.3.Sentrifuge142.4.Komponen Sel15BAB
III18PRINSIP KERJA183.1. Prinsip kerja sentrifuge183.2. Vortex
mixer193.3. Hot plate203.4. Inkubator (Incubator)20BAB IV22ALAT DAN
BAHAN22BAB V25CARA KERJA25BAB VI......26HASIL....26BAB
VII28KESIMPULAN28DAFTAR PUSTAKA29
BAB IPENDAHULUANIsolasi DNA dari Darah Vena
1.1. PendahuluanSampai awal tahun 70an, DNA merupakan molekul
seluler yang paling sulit dianalisis, karena strukturnya yang
panjang dan secara kimiawi monoton. Sebagai materi genetik suatu
organisme nukleotida hanya dapat dianalisis secara tidak langsung
melalui analisis urutan protein dan RNA atau melalui analisis
genetic. Kini menjadi hal yang mungkin untuk mengisolasi suatu
region spesifik dari suatu genome, yaitu total informasi genetic
yang dimiliki oleh suatu organisme; dan untuk memproduksi jumlah
kopi yang tidak terbatas dari region tersebut, atau untuk
mendeterminasi urutan nukleotida dari region tersebut hanya dalam
semalam, dengan kecepatan pembacaan 1000 nukleotida per
detik.Teknologi rekombinan DNA yang menjadi pusat kegiatan dalam
aktifitas Bioteknologi, merupakan suatu teknik yang menggabungkan
suatu segmen DNA dengan DNA yang lain, telah menjadi pengetahuan
yang memberikan banyak manfaat bagi kehidupan manusia, seperti
dalam produksi vaksin dan hormone. Aktifitas utama dalam teknik
rekombinan DNA, antara lain:Memotong DNA pada tempat (site) yang
spesifik dengan enzim restriksi nuclease. Dengan teknik ini,
dimungkinkan untuk mengisolasi dan memanipulasi gen secara
individual.Kloning DNA dengan menggunakan suatu vector atau teknik
Polymerase Chains Reaction (PCR), yang memungkinkan suatu molekul
DNA dapat dikopi untuk meghasilkan jutaan molekul
identik.Hibridisasi asam nukleat, teknik untuk menemukan urutan DNA
atau RNA yang spesifik dengan tingkat akurasi yang tinggi
berdasarkan kemampuannya mengikat urutan asam nukleat
komplemennyaPengurutan (sequencing) semua nukleotida dari fragmen
DNA yang telah dipurifikasi. Bertujuan untuk mengidentifikasi gen
dan memperkirakan urutan asam amino yang membentuk protein.
Pemantauan (monitoring) tingkat ekspresi suatu gen di dalam sel
dengan menggunakan teknik mircroarry asam nukleat.
1.2. Tujuan Praktikum1. Mengisolasi DNA dari hepar ayam dengan
menggunakan kit wizard genomic DNA purification2. Melakukan
pemisahan DNA dari organel-organel sel dengan menggunakan kit
wizard genomic dan alat serta bahan lainnya
BAB IITINJAUAN PUSTAKA2.1. DNAAsam deoksiribonukleat, lebih
dikenal denganDNA(bahasa Inggris:deoxyribonucleicacid), adalah
sejenisasam nukleatyang tergolongbiomolekulutama penyusunberat
keringsetiaporganisme. Di dalamsel, DNA umumnya terletak di
dalaminti sel.Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel
adalah sebagaimateri genetik; artinya, DNA menyimpan cetak biru
bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi setiap organisme.
Di antara perkecualian yang menonjol adalah beberapa jenisvirus(dan
virus tidak termasuk Karakteristik kimia
Struktur untai komplementer DNA menunjukkan pasangan basa
(adenina dengan timina dan guanina dengan sitosina) yang membentuk
DNA beruntai ganda.
DNA merupakanpolimeryang terdiri dari tiga komponen utama,
gugusfosfat gula deoksiribosa basa nitrogen, yang terdiri dari:
Adenina(A) Guanina(G) Sitosina(C) Timina(T)Sebuah unitmonomerDNA
yang terdiri dari ketiga komponen tersebut dinamakannukleotida,
sehingga DNA tergolong sebagaipolinukleotida.Rantai DNA memiliki
lebar 22-24, sementara panjang satu unit nukleotida 3,3 [2].
Walaupun unit monomer ini sangatlah kecil, DNA dapat memiliki
jutaan nukleotida yang terangkai seperti rantai. Misalnya, kromosom
terbesar pada manusia terdiri atas 220 juta nukleotidaRangka utama
untai DNA terdiri dari gugusfosfatdangulayang berselang-seling.
Gula pada DNA adalah gulapentosa(berkarbon lima), yaitu
2-deoksiribosa. Dua gugus gula terhubung dengan fosfat
melaluiikatan fosfodiesterantara atom karbon ketiga pada cincin
satu gula dan atom karbon kelima pada gula lainnya. Salah satu
perbedaan utama DNA dan RNA adalah gula penyusunnya; gula RNA
adalahribosa.DNA terdiri atas dua untai yang berpilin membentuk
strukturheliks ganda. Pada struktur heliks ganda, orientasi rantai
nukleotida pada satu untai berlawanan dengan orientasi nukleotida
untai lainnya. Hal ini disebut sebagaiantiparalel. Masing-masing
untai terdiri dari rangka utama, sebagai struktur utama, dan basa
nitrogen, yang berinteraksi dengan untai DNA satunya pada heliks.
Kedua untai pada heliks ganda DNA disatukan oleh ikatan hidrogen
antara basa-basa yang terdapat pada kedua untai tersebut. Empat
basa yang ditemukan pada DNA adalahadenina(dilambangkan
A),sitosina(C, daricytosine),guanina(G), dantimina(T). Adenina
berikatan hidrogen dengan timina, sedangkan guanina berikatan
dengan sitosina. SegmenpolipeptidadariDNAdisebutgen, biasanya
merupakanmolekulRNA.
Pada replikasi DNA, rantai DNA baru dibentuk berdasarkan urutan
nukleotida pada DNA yang digandakan.Replikasimerupakan proses
pelipatgandaan DNA. Proses replikasi ini diperlukan ketika sel
akanmembelah diri. Pada setiap sel, kecualisel gamet, pembelahan
diri harus disertai dengan replikasi DNA supaya semuaselturunan
memiliki informasigenetikyang sama. Pada dasarnya, proses replikasi
memanfaatkan fakta bahwa DNA terdiri dari duarantaidan rantai yang
satu merupakan "konjugat" dari rantai pasangannya. Dengan kata
lain, dengan mengetahui susunan satu rantai, maka susunan rantai
pasangan dapat dengan mudah dibentuk.Ada beberapa teori yang
mencoba menjelaskan bagaimana proses replikasi DNA ini terjadi.
Salah satu teori yang paling populer menyatakan bahwa pada
masing-masing DNA baru yang diperoleh pada akhir proses replikasi;
satu rantai tunggal merupakan rantai DNA dari rantai DNA
sebelumnya, sedangkan rantai pasangannya merupakan rantai yang baru
disintesis. Rantai tunggal yang diperoleh dari DNA sebelumnya
tersebut bertindak sebagai "cetakan" untuk membuat rantai
pasangannya.Proses replikasi memerlukan protein atauenzimpembantu;
salah satu yang terpenting dikenal dengan namaDNA polimerase, yang
merupakan enzim pembantu pembentukan rantai DNA baru yang merupakan
suatupolimer. Proses replikasi diawali dengan pembukaan untaian
ganda DNA pada titik-titik tertentu di sepanjang rantai DNA. Proses
pembukaan rantai DNA ini dibantu oleh enzim helikase yang dapat
mengenali titik-titik tersebut, dan enzim girase yang mampu membuka
pilinan rantai DNA.Setelah cukup ruang terbentuk akibat pembukaan
untaian ganda ini, DNA polimerase masuk dan mengikat diri pada
kedua rantai DNA yang sudah terbuka secara lokal tersebut. Proses
pembukaan rantai ganda tersebut berlangsung disertai dengan
pergeseran DNA polimerase mengikuti arah membukanya rantai ganda.
Monomer DNA ditambahkan di kedua sisi rantai yang membuka setiap
kali DNA polimerase bergeser. Hal ini berlanjut sampai seluruh
rantai telah benar-benar terpisah.Proses replikasi DNA ini
merupakan proses yang rumit namun teliti. Proses sintesis rantai
DNA baru memiliki suatu mekanisme yang mencegah terjadinya
kesalahan pemasukan monomer yang dapat berakibat fatal. Karena
mekanisme inilah kemungkinan terjadinya kesalahan sintesis amatlah
kecil.
2.2. Isolasi DNAPrisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel
atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama namun
memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan.
Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit
yang diproduksi oleh suatu perusahaan sebagai contoh kit yang
digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti Kit Nucleon
Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan digunakan
GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. Namun tahapan-tahapan
isolasi DNA dalam setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang
disesuaikan dengan keperluan. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan
kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode
konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan digunakan
secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif
lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.Tahap pertama
dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran
dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal
isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan
Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki
beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel
dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau
dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi (Giacomazzi
et al., 2005). Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun
enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti
penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel
sehingga terjadi destabilisasi membran sel (Surzycki, 2000).
Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti
untuk melisiskan membran pada sel darah (Khosravinia et al., 2007)
serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam
komponen sel (Brown, 2010; Surzycki (2000).Pada proses lisis dengan
menggunakan detergen, sering digunakan sodium dodecyl sulphate
(SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain
berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam
mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim
pendegradasi DNA (Switzer, 1999). Selain digunakan SDS, detergen
yang lain seperti cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) juga
sering dipakai untuk melisiskan membran sel pada isolasi DNA
tumbuhan (Bettelheim dan Landesberg, 2007). Parameter keberhasilan
dalam penggunaan CTAB bergantung pada beberapa hal. Pertama,
Konsentrasi NaCl harus di atas 1.0 M untuk mencegah terbentuknya
kompleks CTAB-DNA. Karena jumlah air dalam pelet sel sulit
diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah larutan harus
dengan NaCl dengan konsentrasi minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan
larutan sel yang mengandung CTAB harus disimpan pada suhu ruang
karena kompleks CTAB-DNA bersifatinsolublepada suhu di bawah 15C.
Ketiga, penggunaan CTAB dengan kemurnian yang baik akan menentukan
kemurnian DNA yang didapatkan dan dengan sedikit sekali kontaminasi
polisakarida. Setelah ditambahkan CTAB, sampel diinkubasikan pada
suhu kamar. Tujuan inkubasi ini adalah untuk mencegah pengendapan
CTAB karena CTAB akan mengendap pada suhu 15C. Karena
efektivitasnya dalam menghilangkan polisakarida, CTAB banyak
digunakan untuk purifikasi DNA pada sel yang mengandung banyak
polisakarida seperti terdapat pada sel tanaman dan bakteri gram
negatif seperti Pseudomonas, Agrobacterium, dan Rhizobium
(Surzycki, 2000).Dalam penggunaan buffer CTAB seringkali
ditambahkan reagen-reagen lain seperti NaCl, EDTA, Tris-HCl, dan
2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk menghilangkan polisakarida
sementara 2-mercaptoethanol befungsi untuk menghilangkan kandungan
senyawa polifenol dalam sel tumbuhan (Ranjan et al., 2010).
2-mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol dalam sel tanaman
dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol yang
kemudian akan terpisah dengan DNA (Lodhi et al., 1994). Senyawa
polifenol perlu dihilangkan agar diperoleh kualitas DNA yang baik
(Moyo et al., 2008). Polifenol juga dapat menghambat reaksi dari
enzim Taq polimerase pada saat dilakukan amplifikasi. Disamping itu
polifenol akan mengurangi hasil ektraksi DNA serta mengurangi
tingkat kemurnian DNA (Porebskiet al., 1997). Penggunaan
2-mercaptoethanol dengan pemanasan juga dapat mendenaturasi protein
yang mengkontaminasi DNA (Walker dan Rapley, 2008).Konsentrasi dan
pH dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang pH 5 sampai
12. Larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi
dan mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase fenol selama proses
deproteinisasi. Sedangkan pH larutan yang tinggi di atas 12 akan
mengakibatkan pemisahan untai ganda DNA. Fungsi larutan buffer
adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses penghancuran dan
purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein dan RNA
serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan mencegah
perubahan pada molekul DNA. Untuk mengoptimalkan fungsi larutan
buffer, dibutuhkan konsentrasi, pH, kekuatan ion, dan penambahan
inhibitor DNAase dan detergen (Surzycki 2000).Pada tahapan
ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) yang berperan
menginaktivasi enzim DNase yang dapat mendenaturasi DNA yang
diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease dengan cara mengikat
ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim
DNAse (Corkill dan Rapley, 2008). DNA yang telah diekstraksi dari
dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen
penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang
didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali
digunakan sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi dengan
menggunakan fenol menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan
mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA
melalui sentrifugasi (Karp, 2008). Bettelheim dan Landesberg (2007)
menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang
terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus
(air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase
aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi
akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase organik
(Gambar 1). Selain fenol, dapat pula digunakan campuran fenol dan
kloroform atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil alkohol untuk
mendenaturasi protein. Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga
terkontaminasi oleh RNA sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA
ekstrak dengan cara pemberian RNAse (Birren, et al., 1997; Clark,
2010).Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut
dalam air. Disamping itu, protein juga mengandung residu hidrofobik
yang mengakibatkan protein larut dalam pelarut organik. Berdasarkan
sifat ini, terdapat beberapa metode deproteinisasi berdasarkan
pemilihan pelarut organik. Biasanya pelarut organik yang digunakan
adalah fenol atau kloroform yang mengandung 4% isoamil alkohol.
Penggunaan kloroform isoamil alkohol (CIA) berdasarkan perbedaan
sifat pelarut organik. Kloroform tidak dapat bercampur dengan air
dan kemampuannya untuk mendeproteinisasi berdasarkan kemampuan
rantai polipeptida yang terdenaturasi untuk masuk atau
termobilisasi ke dalam fase antara kloroform air. Konsentrasi
protein yang tinggi pada fase antara tersebut dapat menyebabkan
protein mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa organik
lain akan terpisah pada lapisan kloroform (Clark, 2010).Proses
deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara
kloroform-air. Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk emulsi
dari air dan kloroform. Hal ini hanya dapat dilakukan dengan
penggojogan atau sentrifugasi yang kuat karena kloroform tidak
dapat bercampur dengan air. Isoamil alkohol berfungsi sebagai
emulsifier dapat ditambahkan ke kloroform untuk membantu
pembentukan emulsi dan meningkatkan luas permukaan kloroform-air
yang mana protein akan mengalami presipitasi. Penggunaan kloroform
isoamil alkohol ini memungkinkan untuk didapatkan DNA yang sangat
murni, namun dengan ukuran yang terbatas (20.00050.000 bp). Fungsi
lain dari penambahan CIA ini adalah untuk menghilangkan kompleks
CTAB dan meninggalkan DNA pada fase aquoeus. DNA kemudian diikat
dari faseaquoeus dengan presipitasi etanol (Surzycki, 2000).Setelah
proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui
presipitasi.Pada umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam
tahapan presipitasi. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA
pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber
dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi (Switzer,
1999).Hoelzel (1992) juga menambahkan bahwa presipitasi juga
berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal
dari tahapan ekstraksi.Menurut Surzycki (2000), prinsip-prinsip
presipitasi antara lain pertama, menurunkan kelarutan asam nukleat
dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi
molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air
berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester DNA.
Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol
dapat bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air.
Molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar
dari asam nukleat sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah
bagi asam nukleat; kedua, penambahan isopropanol akan menghilangkan
molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi;
ketiga, penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas
molekul air sehingga memudahkan presipitasi DNA.Pada tahapan
presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari
residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa. Residu tersebut
juga mengalami koagulasinamun tidak membentuk struktur fiber dan
berada dalam bentuk presipitat granular.Pada saat etanol atau
isopropanol dibuang dan pellet dikeringanginkan dalam tabung, maka
pellet yang tersisa dalam tabung adalah DNA pekat.Proses
presipitasikembali dengan etanol atau isopropanol sebelum pellet
dikeringanginkan dapat meningkatkan derajat kemurnian DNA yang
diisolasi (Bettelheim dan Landesberg, 2007). Keller dan Mark (1989)
menerangkan bahwa pencucian kembali pellet yang dipresipitasi oleh
isopropanol dengan menggunakan etanol bertujuan untuk menghilangkan
residu-residu garam yang masih tersisa. Garam-garam yang terlibat
dalam proses ekstraksi bersifat kurang larut dalam isopropanol
sehingga dapat terpresipitasi bersama DNA, oleh sebab itu
dibutuhkan presipitasi kembali dengan etanol setelah presipitasi
dengan isopropanol untuk menghilangkan residu garam (Ausubel et
al., 2003).Setelah dilakukan proses presipitasi dan dilakukan
pencucian dengan etanol, maka etanol kemudian dibuang dan pellet
dikeringanginkan, perlakuan tersebut bertujuan untuk menghilangkan
residu etanol dari pelet DNA. Penghilangan residu etanol dilakukan
dengan cara evaporasi karena etanol mudah menguap (Surzycki, 2000).
Pada tahap pencucian biasanya etanol dicampur dengan ammonium
asetat yang bertujuan untuk membantu memisahkan kontaminan yang
tidak diinginkan seperti dNTP dan oligosakarida yang terikat pada
asam nukleat (Sambrook et al., 2001).Setelah pellet DNA
dikeringanginkan, tahap selanjutnya adalah penambahan buffer TE ke
dalam tabung yang berisi pellet dan kemudian disimpan di dalam
freezer dengan suhu sekitar -20C. Verkuil et al. (2008) menyatakan
bahwa buffer TE dan penyimpanan suhu pada -20C bertujuan agar
sampel DNA yang telah diekstraksi dapat disimpan hingga waktu
berminggu-minggu. Keller dan Mark (1989) juga menjelaskan bahwa
pelarutan kembali dengan buffer TE juga dapat memisahkan antara RNA
yang mempunyai berat molekul lebih rendah dibandingkan DNA sehingga
DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA dan DNA sangat
stabil ketika disimpan dalam keadaan terpresipitasi pada suhu -20C.
Isolasi DNA juga dapat dilakukan dengan menggunakan kit yang sudah
diproduksi oleh beberapa perusahan untuk mempermudah dan
mempercepat proses isolasi DNA. Kit isolasi juga disesuaikan dengan
kebutuhan oleh konsumen dan jenis sel yang akan digunakan. Berikut
adalah bagan contoh isolasi DNA tanaman dengan menggunakan Kit
Nucleon Phytopure.
2.2. Genomik DNA
DNA Genom yaitu seluruh DNA yang ada pada suatu organisme
(makhluk hidup), baik yang berfungsi atau yang tidak, baik yang ada
di inti sel, mitokondria, atau kloroplas. Atau dengan kata lain DNA
genom adalah DNA mentah yang masih memiliki komponen lengkap
seperti promoter gen, bagianexon, dan bagianintron. Lebih lengkap
tentang bagian-bagian DNA dijelaskan dalam tulisan Bagian-bagian
DNA.
2.3. Sentrifugesentrifugasi adalah metode sedimentasi untuk
memisahkan partikel-partikel dari suatu fluida berdasarkan berat
jenisnya dengan memberikan gaya sentripetal (Robinson 1975).
Sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan sel menjadi organel-organel
utama sehingga fungsinya dapat diketahui (Miller 2000). Dalam
bentuk yang sederhana sentrifus terdiri atas sebuah rotor dengan
lubang-lubang untuk melatakkan wadah/tabung yang berisi cairan dan
sebuah motor atau alat lain yang dapat memutar rotor pada kecepatan
yang dikehendaki. Semua bagian lain yang terdapat pada sentrifus
modern saat ini hanyalah perlengkapan yang dimaksudkan untuk
melakukan berbagai fungsi yang berguna dan mempertahankan kondisi
lingkungan dimana rotor tersebut bekerja. Penggunaan sentrifus
cukup luas, meliputi koleksi dari pemisahan sel, organel dan
molekul (Hendra 1989)
2.4. Komponen SelSel-sel yang membentuk tubuh makhluk hidup
memiliki bermacam-macam bentuk dan ukuran. Antara sel hewan dan sel
tumbuhan terdapat beberapa perbedaan dan persamaan. Pada dasarnya,
sel hewan maupn sel tumbuhan memiliki 3 bagian utama, yaitu membran
sel, sitoplasma, dan inti sel.
1. Nukleus (Inti Sel)
Nukleus berfungsi sebagai pengatur aktivitas sel. Dalam nukleus
terdapat benang-benang kromatin. Pada waktu sel membelah
benang-benang ini berubah menebal menjadi kromosom yang merupakan
faktor pembawa keturunan (gen) , selaput inti, nukleoplasma,
(cairan inti), dan nukleolus (anak inti) yang berperan dalam
sintesis protein secara tidak langsung.
2. Sitoplasma (Cairan di Luar Inti)Sitoplasma atau plasma sel
adalah cairan kental yang mengisi ruangan antara membran sel dan
inti sel.Di dalam sitoplasma terdapat organel-organel sel antara
lain:1. Mitokondria, sebagai tempat berlangsungnya proses oksidasi
sel (respirasi).2. Lisosom, pada sel hewan berfungsi sebagai
penghasil enzim pencernaan dan zat kebal.3. Ribosom, merupakan
tempat berlangsungnya sintesis protein. Letaknya ada yang bebas dan
ada yang menempel pada retikulum endoplasma.4. Retikulum
endoplasma, merupakan saluran halus yang mengandung ribosom yang
berperan dalam transportasi hasil sintesis protein. Retikulum
endoplasma yang tidak mengandung ribosom berperan dalam sintesis
lemak, kolesterol, dan hormon.5. Badan golgi, merupakan organ yang
berperan dalam ekskresi. Organel ini terdiri atas tumpukan-tumpukan
kantong-kantong pipih yang dikelilingi oleh gelembung-gelembung.
Kantong-kantong ini menampung dan mengumpulkan protein atau lipid
dari retikulum endoplasma melalui perlengketan gelembung dari
retikulum pada dinding kantong badan golgi yang akhirnya menyatukan
cairan di dalamnya.6. Plastida, berupa butir-butir zat warna pada
sel tumbuhan. Plastida yang utama adalah kloroplas yang berisi
klorofil. Klorofil berfungsi untuk menangkap energi matahari, yang
digunakan untuk fotosintesis.7. Vakuola. Vakuola yang terdapat pada
sel tumbuhan berisi zat makanan dan zat hasil metabolisme. Semakin
tua umur sel, maka ukuran vakuola semakin besar. Pada beberapa
hewan bersel satu ada 2 jenis vakuola yaitu vakuola makanan dan
vakuola kontraktil.8. Peroksiom, di dalamnya terdapat enzim
katalase yang berfungsi mengubah hidrogen peroksida (H2O2) menjadi
air dan oksigen.9. Sentriol/Sentrosoma, berperan dalam pembelahan
sel dengan cara membentuk benang gelendong.
3. Membran Sel
Membran Sel
Membran sel tersusun atas lemak dan protein (lipoprotein)
sehingga bersifat permeabel (selektif permeabel). Fungsinya
mengatur peredaran zat dari dan ke dalam sel. Organel ini terletak
di luar sitoplasma, bersifat tipis dan elastis.
3. Dinding SelDinding sel hanya terdapat pada pada sel tumbuhan.
Letaknya di luar membran sel. Berfungsi untuk melindungi bagian
dalam sel dan memberi bentuk sel. Dinding sel tersusun dari
selulose (serat), pektin, dan lignin. Strukturnya berlapis-lapis
tergantung pada umur sel.
BAB IIIPRINSIP KERJA
3.1. Prinsip kerja sentrifugeSentrifugemerupakan alat
laboratorium yang memanfaatkan gaya sentrifugal , yaitu gaya yang
timbul akibat benda yang diputar dari satu titik sebagai porosnya .
untuk memisahkan partikel dari satu benda cair atau dengan kata
lain memisahkan benda cair dari kepadatan yang berbeda.Benda cair
ini merupakan cairan tubuh , contoh darah , serum , air seni ,
bahan reaksi lainnya , atau campuran dari kedua duanya dengan zat
tambahan lainIni adalah gambar bagian bagiannya :
Prinsipkerjaalatcentrifugeadalahdenganmemanfaatkangayasentrifugal.Gayasentrifugaljugadipengaruhiolehgayagravitasi.
Makincepatputarannyamakasemakintinggipulagayayangdihasilkan.Komponenutamapadaalatiniadalahmotor.Padamotorterdapatrotordanstato,Jikadialiriaruslistrikmakadiantararotordanstatorakantimbulmedanmagnetsecarabergantian.Padaprinsipnya,kerjacentrifugeyaitumerubahenergilistrikmenjadienergimekanikdalambentukputaran.3.2.
Vortex mixerBagi tenaga analis kesehatan, sering kali kita
menggunakan Vortex mixer pada laboratorium, ataupun Rumah Sakit dan
di tempat-tempat lain. Pengertian Vortex mixer Alat ini dapat
digunakan untuk percobaan pencampuran, reaksi atau pelarutan sampel
cair dengan cepat. Sebuah mixer pusaran adalah perangkat sederhana
yang digunakan untuk mencampur botol kecil cairan atau membubarkan
padat menjadi cari. Kecepatan yang sesuai dengan kebutuhan analisa
dapat mudah dilakukan dengan tombol yang tersedia. Kondisi
pencampuran yang paling sesuai dapat dicapai dengan penggunaan
motor. Alat ini terdiri dari sebuah motor listrik dengan drive
shaft berorientasi vertikal dan melekat pada sepotong karet
dipasang sedikit off-center. Sebagai motor berjalan, potongan karet
berosilasi cepat dalam gerakan melingkar. Ketika tabung reaksi atau
wadah lain yang sesuai ditekan ke bagian karet (atau menyentuh ke
tepi) gerak ditransmisikan ke cairan di dalamnya dan pusaran
dibuat. Ini mixer vortex memiliki pengaturan kecepatan variabel dan
dapat diatur untuk terus berjalan, atau berjalan hanya ketika
tekanan diterapkan ke bagian karet.
3.3. Hot plate
3.4. Inkubator (Incubator)Inkubator adalah alat untuk
menginkubasi atau memeram mikroba pada suhu yang terkontrol. Alat
ini dilengkapi dengan pengatur suhu dan pengatur waktu. Kisaran
suhu untuk inkubator produksi Heraeus B5042 misalnya adalah
10-70oC. Suhu di dalam inkubator konstan dan dapat diatur sesuai
dengan tujuan inkubasi. Bentuk inkubator yang dikenal ada yang
berupa shaker dan water bath. Di dalam laboratorium mikrobiologi
digunakan untuk menumbuhkan bakteri pada suhu tertentu, menumbuhkan
ragi dan jamur, menyimpan biakan murni mikroorganisme I pada suhu
rendah. Inkubator biasanya hanya dapat diatur di atas suhu kamar,
sedangkan cooled inkubator dapat diatur baik pada suhu di bawah
maupun diatas suhu kamar. Prinsip kerjanya yaitu mengubah energi
listrik menjadi energi panas. Kawat nikelin akan menghambat aliran
elektron yang mengalir sehingga mengakibatkan peningkatan suhu
kawat (Taiyeb, 2001).Cara penggunaan inkubator adalah semua medium
yang sudah dimasukan ke dalam cawan petri dan terbungkus kertas
dimasukan ke dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu konstan
sesuai dengan yang diinginkan.
BAB IVALAT DAN BAHAN1. Microsentrifuge tube 1,5 ml
2. Micropipet 0,5 ul, 10-100ul, 100-1000 ul + tip
3. Vortex
4. Microsentrifugator
BAB VCARA KERJA
Masukkan 900 ul cell lysis solution ke dalam tabung
microcentrifuge steril1. tambahkan 300 ul hepar ayam yg sudh
dihncurkn dan tabung diputar bolak balik 5- 6 kali untuk
homogenasi2. Inkubasi campuran diatas selama 10 menit dalam suhu
ruang (bolak-balik 2- 3 kali selama inkubasi)3. sentrifugasi dengan
kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 2 menit.4. buang
supernatan tanpa mengganggu pellet.5. tambahkan 600 ul cell lysis
solution ke pellet dan vortex .6. ulangi tahap 4 dan 5 sampai
pellet terlihat putih.7. tambahkan 300 ul nuclei lysis solution ke
pellet. Pipet larutan 5- 6 kali untuk melisiskan sel darah putih
dan inti sel. Larutan harus benar-benar jadi kental.8. optional.
Tambahkan 1,5 ul Rnase solution dan campurkan dengan cara
membolak-balikan tabung, inkubasi campuran pada suhu 37c selama 15
menit, lalu didinginkan pada suhu ruang.9. tambahkan 100 ul protein
precipitation solution ke dalam lisate dan vortex selama 20 detik,
setelah divortex akan terlihat butiran-butiran protein halus.10.
sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selam 4 menit pada suhu
ruang. Akan terlihat pellet dengan warna coklat terang. Bila
supernatant masih berwarna coklat, ambil supernatant tersebut,
pindahkan ke tabung microsentrifuge bersih, ulangi langkah 10 dan
11.11. pindahkan supernatant ke dalam tabung microsentrifuge bersih
yang sudah berisi 300 ul isopropanol.12. bolak- balik tabung secara
perlahan sampai terlihat benang-benang putih halus (DNA).13. untuk
optimalisasi, simpan tabung pada suhu -20C selama 1jam.14.
sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 3
menit. Akan terlihat pellet putih.15. buang supernatant, cuci
dengan 400 ul alkohol 70% dingin16. sentrifugasi dengan kecepatan
13.000 rpm selama 3 menit pada suhu ruang, sampai Dna berubah
menjadi transparan.17. Buang supernatant, kering anginkan DNA pada
suhu ruang.18. Larutkan DNA dengan 100 ul rehydration solution.19.
Rehidrasi DNA pada suhu 65 oC selama 1 jam atau pada suhu 4 oC
overnight.20. Simpan DNA pada suhu -20 oC.
BAB VIIKESIMPULAN
Isolasi DNA merupakan tahap awal dalam proses identifikasi DNA,
sampel dapat diambil dalam isolasi dna bisa dari sel mukosa pipi
(Saliva) dan darah vena, maupun dari hepar. Isolasi DNA digunakan
untuk pengindentifikasian maupun sebagai bahan untuk PCR, sehingga
dalam pembuatannya haruslah teliti agar hasil yang didapatkan bisa
akurat.
28
DAFTAR PUSTAKAGuyton and Hall.2007.Buku Ajar Fisiologi
Kedokteran.Jakarta: EGC.Murray, Robert K.2009.Biokimia
Harper.Jakarta:EGCSadikin,Mohamad. 2002.Biokimia Enzim.Jakarta :
Widya Medika.Soewoto,Hafiz, dkk. 2000.Biokimia Eksperimen
Laboratorium.Jakarta: Widya Medika.Staf Pengajar Kimia Organik.
2005. Penuntun Praktikum Kimia Organik untuk Mahasiswa Program D3
Analisis Kimia.Departemen Kimia FMIPA-IPB.Yusminah, Oslan
Jumadi.2009.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: BambatangHala.Arhan.
2009.Laporan Pratikum isolasi DNA.Istanti, Annie. 1999. Biologi
Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM.Jamilah. 2005. Pengaruh
Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan Ekstrak NanasAnanas
Comusus. terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah sebagai
Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan.
Malang: Program Sarjana Biologi.